人源化抗淋巴毒素β受体的抗体的制作方法

专利名称：人源化抗淋巴毒素β受体的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学以及癌症的诊断和治疗领域。尤其涉及抗淋巴毒素β(LT-β-R)特异性的人源化抗体，产生这种抗体的细胞系，由该抗体构成的免疫化学制剂和使用该抗体的诊断方法。本发明也涉及在治疗方法中单独或联合化学治疗剂使用该抗体。
背景技术：
淋巴毒素β受体(此处称为LT-β-R)是肿瘤坏死因子家族的一个成员，它对免疫系统的发展和对许多细胞包括滤泡树突细胞的免疫体系和许多基质细胞类型的功能保持起了很好的作用(Matsumoto等，Immunol.Rev.156137(1997)。LT-β-R的已知配体包括LTα1/β2和称为LIGHT的第二配体(Mauri等Immunity 821(1998))。LT-β-R的活性已经显示可诱导某些体内癌细胞系的程序性死亡(PCT/US96/01386)。使用与LT-β-R结合并对被实验者具有最小免疫原性的特异性人源化抗LT-β-R抗体，将对治疗或减轻被实验者(例如人)体内瘤形成的进展(advancement)、严重性或影响起作用。
发明简述本发明提供了特异性抗淋巴毒素β受体(LT-β-R)的人源化抗体，产生这种抗体的细胞系，由这种抗体制备的免疫化学制剂和使用这种抗体的诊断方法。本发明也涉及在治疗方法中单独或联合化学治疗剂使用该抗体。特别地，本发明包括特异性与LT-β-R(如，人LT-β-R)结合的人源化抗体。该抗体包括由SEQ ID NO1的氨基酸残基24至34，50至56和89至97限定的轻链互补决定区，和/或由SEQ ID NO2的氨基酸残基31至35，50至65和95至102限定的重链互补决定区，此外在它的轻链上包含至少一个(如1，2，3或4个)以下的残基Y36，S49，T63和F87；或在它的重链上包含至少一个(如1，2，3，4，5或6个)以下的残基Y27，T30，I48，A67，L69和F91(常规Kabat编号)。本发明的另一个实施方式包括能与上述抗体所结合的表位相同的LT-β-R表位结合的抗体。
在一个实施方式中，本发明的人源化抗体包括由SEQ ID NO6的氨基酸残基1至107限定的轻链可变区序列和/或由SEQ ID NO14的氨基酸残基1至113限定的重链可变区序列。该人源化抗体也可包括与如下抗体，即CHO细胞系表达版本4 huBHA10“克隆3D9”(ATCC专利保藏号PTA-4726，保藏于2002年9月27日)产生的抗体，如实施例7所述同样的重和/或轻链多肽序列。含有版本4huBHA10的克隆3D9于2002年9月27日被保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，给予登记号为PTA-4726。该保藏遵照在国际承认用于专利程序微生物保藏的布达佩斯条约的规定。该保藏仅对本领域技术人员提供方便。
在另一个实施方式中，本发明的人源化抗体基本保持了亲本抗体例如小鼠单克隆抗体BHA10(WO96/22788中描述)的结合性质。在其中一个实施方式中，本发明的人源化抗体以功能性亲和力结合LT-β-R，例如约1pM至约10pM，或约10pM至约20pM，或约20pM至约30pM，或约30pM至约40pM，或约40pM至约50pM，或约50pM至约60pM，或约60pM至约70pM，或约70pM至约80pM，或约80pM至约90pM的功能性亲合力(functional affinity)，其中功能性亲和力通过BIACORE(即利用非标记试剂的表面等离子体共振)，或竞争性结合测定法测定。
在另一个实施方式中，本发明的人源化抗体被连结到细胞毒部分或毒素如蓖麻毒蛋白A链或假单胞菌属细菌的毒素(Pseudonomas toxin)上，形成免疫毒素的形式。本发明的人源化抗体也可被连结到化疗药上(如羟基柔红霉素(adriamycin)，5-氟尿嘧啶，长春碱，放线菌素D，表鬼臼毒吡喃葡糖苷(etoposide)，顺铂(Cisplatin)，氨甲喋呤，DM1和阿霉素(doxorubicin))。或者，本发明的抗体被可检测性标记(如连结到一可检测性的部分上，如放射性同位素)。本发明也包括联合治疗，例如被连结到细胞毒部分或毒素上的本发明的人源化抗体与结合到本发明中与化疗药连结的人源化抗体联合应用。
本发明进一步包括一种适合施药于具有表达LTβR的肿瘤的哺乳动物(如人)的组合物，该组合物包括a)单独的抗LTβR抗体或免疫毒素或化疗药形式的人抗LTβR抗体，和b)细胞毒因子，以分别能有效减少施药哺乳动物肿瘤体积的量存在。细胞毒因子可包括，例如TNF-α，TNF-β，IL-1，INF-γ，IL-2。或者，细胞毒因子(cytotoxic factor)可以是化疗药。该化疗药可包括，如羟基柔红霉素，5-氟尿嘧啶，长春碱，放线菌素D，表鬼臼毒吡喃葡糖苷，顺铂，氨甲喋呤，DM1和阿霉素。
在一个实施方式中，本发明的抗体可以是任何同种型(如具有两个全长的轻链和两个全长的重链)和亚类(如IgM，IgD，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgE，IgA1和IgA2)的完整抗体；或者，它可以是完整抗体的抗原结合部分(例如Fab，F(ab’)2和Fv)。
本发明还包括一种含有药学可接受载体的组合物；一种包含SEQ IDNO5编码序列的分离核苷酸；一种包含SEQ ID NO13编码序列的分离核苷酸；一种含有由克隆3D9(ATCC专利保藏号PTA-4726，保藏于2002年9月27日)细胞系产生的抗体轻链的编码序列的分离核苷酸；一种含有由克隆3D9(ATCC专利保藏号PTA-4726，保藏于2002年9月27日)细胞系产生的抗体重链的编码序列的分离核苷酸；一种含有SEQ ID NO5的残基1至107的编码序列的分离核苷酸；和一种含有SEQ ID NO13的残基1至120的编码序列的分离核苷酸。
本发明还包括产生人抗-LTβR抗体细胞系的细胞，包括如，细胞系克隆3D9(ATCC专利保藏号PTA-4726)。在一个实施方式中，该细胞系产生约250mg/L至约300mg/L的所述抗体，或者该细胞系产生约300mg/L至约350mg/L的所述抗体，或者该细胞系产生约350mg/L至约400mg/L的所述抗体，或者该细胞系产生约400mg/L至约450mg/L的所述抗体，或者该细胞系产生约450mg/L至约500mg/L的所述抗体，或者该细胞系产生约500mg/L至约550mg/L的所述抗体，或者该细胞系产生约550mg/L至约600mg/L的所述抗体。由细胞系产生的抗体浓度以10天分批培养的收获效价测定。
本发明还提供了一种治疗或减弱被实验者(如人)体内瘤形成的进展、严重性或影响的方法，包括给被实验者施用有效量的本发明抗体。组合物的有效量可以以一或多剂量给药。在另一实施方式中，本发明提供了一种治疗或减少被实验者(如人)体内瘤的增长、严重性或影响的方法，包括给被实验者施用有效量的本发明抗体和细胞毒因子。该细胞毒因子可包括例如TNF-α，TNF-β，IL-1，INF-γ，IL-2。或者该细胞毒因子可以是一种化疗药。该化疗药包括，如羟基柔红霉素，5氟尿嘧啶，长春碱，放线菌素D，表鬼臼毒吡喃葡糖苷，顺铂，氨甲喋呤，DM1和阿霉素。
本发明也描述了本发明抗体的抗原结合片段。在本发明的一个实施方式中，该片段选自Fab片段，Fab’片段，F(ab)2片段和Fv片段。
在另一实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段接合到聚乙二醇或清蛋白(albumen)上。在另一实施方式中，本发明的抗体恒定区被修饰，使得相对于未修饰抗体至少一个恒定区-介导的生物效应子功能减少。在另一实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段包括具有改变了效应子功能的Fc区域。
本发明也描述了由3D9(ATCC保藏号PTA-4726)组成的杂交瘤细胞。在一个实施方式中，本发明的杂交瘤细胞产生了一种人源化抗体或它们的抗原结合部分。
在另一实施方式中，本发明提供了一种轻链，包括来自单克隆抗体BHA10的互补决定区(CDR)和可变区框架的氨基酸残基Y36，S49和F87(Kabat编号系统)，轻链的其余部分来自人抗体。在另一实施方式中，本发明提供了一种重链，包括来自单克隆抗体BHA10的互补决定区(CDR)和可变区框架的氨基酸残基Y27和T30(Kabat编号系统)，重链的其余部分来自人抗体。在另一实施方式中，本发明的人源化抗体包括所述重链和轻链。
在一个实施方式中，本发明的人源化抗体结合到淋巴毒素-β受体(LT-β-R)上。
本发明还提供了一种包括来自SEQ ID NO1所示BHA10可变轻链序列CDR的人源化抗体。在另一实施方式中，本发明提供了一种包括来自SEQID NO2所示BHA10可变重链序列的人源化抗体。
本发明描述了一种特异性结合LT-β-R的人源化抗体或它们的抗原结合片段，它包括可变区，该可变区含有与来自小鼠BHA10抗体的CDR相应的CDR。在一个实施方式中，该片段是Fab片段。
在另一实施方式中，本发明描述了一种治疗或减轻患者癌症的方法，包括给患者施用有效量本发明的人源化抗体。本发明也描述了一种治疗或减轻患者实体瘤的方法，包括给患者施用有效量本发明的人源化抗体。在本发明的一个实施方式中，实体瘤选自非小细胞肺癌(NSCLC)，结直肠癌(CRC)，乳腺癌，前列腺癌，胃癌(gastric cancer)，皮肤癌，胃癌(stomachcancer)，食道癌或膀胱癌。
附图简述

图1显示了不同版本(version)的人BHA10(版本2-4)对IL-8的对A375细胞的激动作用(agonism)的比较。IL-8检测按实施例5所述方法进行。实心正方形嵌合BHA10；空心圆圈版本2；实心圆圈版本3；空心圆圈版本4；空心三角形huCBE11(阳性对照)。
图2显示了与HT29细胞结合的纯化的人BHA10抗体版本2-4的FACS分析结果。FACS分析按实施例8所述方法进行。实心正方形嵌合BHA10；空心圆圈版本2；实心圆圈版本3；空心圆圈版本4；空心三角形huCBE11(阳性对照)；十字形M92(抗-CD40L抗体)(阴性对照)。
图3说明了pKJS077的质粒图。该质粒含有轻链#2和新霉素抗性基因。该轻链表达盒包含人CMV的立即早期启动子和第一内含子(含有小的缺失)，以及人生长激素聚腺苷酰化序列。
图4(A)显示了编码轻链#2的核苷酸序列(可变区-单下划线；恒定区-双下划线)(SEQ ID NO59)，图4(B)显示了相应的氨基酸序列(可变区-单下划线；恒定区-双下划线)(SEQ ID NO60)。
图5说明了pKJS078的质粒图。该质粒包括重链#3和DHFR基因。该重链表达盒含有重链CMV立即早期启动子盒第一内含子(含有小的缺失)，以及人生长激素聚腺苷酰化序列。
图6(A)显示了编码重链#3的核苷酸序列(可变区-单下划线；恒定区-双下划线)(SEQ ID NO61)，图6(B)显示了相应的氨基酸序列(可变区-单下划线；恒定区-双下划线)(SEQ ID NO62)。
发明详述序列识别号说明书中所指的核苷酸和氨基酸序列被注明以下序列识别号。
SEQ ID NO1-小鼠BHA10轻链可变(VH)区的氨基酸序列。
SEQ ID NO2-小鼠BHA10重链可变(VL)区的氨基酸序列。
SEQ ID NO3-人源化的BHA10轻链可变区(版本1-VL#1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO4-人源化的BHA10轻链可变区(版本1-VL#1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO5-人源化的BHA10轻链可变区(版本2-VL#2)的核苷酸序列。
SEQ ID NO6-人源化的BHA10轻链可变区(版本2-VL#2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO7-人源化的BHA10轻链可变区(版本3-VL#3)的核苷酸序列。
SEQ ID NO8-人源化的BHA10轻链可变区(版本3-VL#3)的氨基酸序列。
SEQ ID NO9-人源化的BHA10重链可变区(版本1-VH#1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO10-人源化的BHA10重链可变区(版本1-VH#1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO11-人源化的BHA10重链可变区(版本2-VH#2)的核苷酸序列。
SEQ ID NO12-人源化的BHA10重链可变区(版本2-VH#2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO13-人源化的BHA10重链可变区(版本3-VH#3)的核苷酸序列。
SEQ ID NO14-人源化的BHA10重链可变区(版本3-VH#3)的氨基酸序列。
SEQ ID NO15-轻链#2的氨基酸序列(包括VL#2和人昵崃春愣ㄇ)。
SEQ ID NO16-重链#3的氨基酸序列(包括VH#3和人IgG1重链恒定区)。
SEQ ID NO17至SEQ ID NO58-各种引物
SEQ ID NO59-轻链#2的核苷酸序列(包括VL#2和人κ轻链恒定区)加上起始密码子和信号序列。
SEQ ID NO60-轻链#2的氨基酸序列(包括VL#2和人κ轻链恒定区)加上起始密码子和信号序列。
SEQ ID NO61-重链#3的核苷酸序列(包括VH#3和人IgG1重链恒定区)加上起始密码子和信号序列。
SEQ ID NO62-重链#3的氨基酸序列(包括VH#3和人IgG1重链恒定区)加上起始密码子和信号序列。
定义此处交替使用的术语“人源化抗体”或“重构抗体”是指包括至少一种来自非-人源典型地为鼠科动物，亲本抗体的人源化免疫球蛋白或抗体链(也即，至少一种人源化的轻链或重链)，它保持或基本保持了亲本抗体的抗原结合性质，但优选在人体内具有较少的免疫原性。术语“人免疫球蛋白链”或“人抗体链”(即“人免疫球蛋白轻链”或“人免疫球蛋白重链”)指具有可变区的免疫球蛋白或抗体链(即分别为轻链或重链)，该可变区包括基本上来自人免疫球蛋白或抗体的可变框架区和基本上来自非-人源免疫球蛋白或抗体的互补决定区(CDR)(如至少一个CDR，优选两个CDR，更优选三个CDR)，并进一步包括恒定区(例如，如果是轻链，它们的至少一个恒定区或其部分，如果是重链，优选三个恒定区)。
术语“区”可指抗体链或抗体链功能域的一部分(例如重链或轻链的一部分或恒定区或可变区的一部分，正如此处所限定的)，以及所述链或功能域更分散的部分。例如，轻链和重链或轻链和重链可变区包括散布在“框架区”或“FR”的“互补决定区”或“CDR”，如此处所限定的。
此处使用的术语互补决定区(CDR)指共同决定天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列，正如Kabat等在Sequence of Proteins of Immunological Interest(第5版，美国健康和公共事业部，美国政府印刷局，1991)所描述的。
此处使用的术语框架区(FR)指在CDR之间插入的氨基酸序列。这部分抗体用以将CDR保持在适当的方向上(允许CDR结合抗原)。
此处使用的术语恒定区(CR)指具有效应子功能的抗体分子部分。典型地，非-人源(例如鼠)恒定区被人恒定区取代。目标嵌合抗体或人源化抗体的恒定区典型地来自人免疫球蛋白。重链恒定区可以选自五种同型的任一种α、δ、ε、γ或μ。进一步，各种亚类的重链(如重链的IgG亚类)是造成效应子功能不同的原因，因此通过选择想要的重链恒定区，可以产生想要的效应因子功能。优选的重链区是γ1(IgG1)，γ3(IgG3)和γ4(IgG4)。更优选γ1(IgG1)同型的Fc区。恒定区的轻链可以是κ或λ型，优选为κ型。在一个实施方式中，轻链恒定区是人κ恒定区(Heiter等(1980)Cell 22197-207)，重链恒定链的是人IgG1恒定链(Ellison等(1982)Nucleic Acids Res.104076-4079)。
此处使用的术语嵌合抗体指含有来自第一物种的可变区和来自第二物种恒定区的一种抗体。典型的嵌合抗体包含人和鼠抗体片段，通常是人恒定区和鼠可变区。
免疫球蛋白或抗体可以单体或多聚体形式存在，例如IgM抗体以五聚体的形式存在和/或IgA抗体以单体、二聚体或多聚体的形式存在。术语“片段”指抗体或抗体链的一部分，与完整或完全抗体或抗体链相比，它含有较少的氨基酸残基。片段可以通过化学或酶处理一段完整或完全抗体或抗体链获得。片段也可通过重组方法获得。典型的片段包括Fab，Fab’，F(ab’)2，Fabc和/或Fv片段。术语“抗原结合片段”指能结合抗原或能与完整抗体(即衍生所述片段的完全抗体)竞争结合抗原(即特异性结合)的免疫球蛋白或抗体的多肽片段。
结合片段通过重组DNA技术或通过酶或化学分裂完整的免疫球蛋白产生。结合片段包括Fab，Fab′，F(ab′)2，Fabc，Fv，单链和单链抗体。除了“双特异性”或“双功能”免疫球蛋白或抗体之外，免疫球蛋白或抗体被认为各自具有相同的结合位点。“双特异性”或“双功能抗体”是一种具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可通过各种方法生产，包括融合杂交瘤细胞或连接Fab’片段。参见，如Songsivilai &Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79315-321(1990)；Kostelny等，J.Immunol.148，1547-1553(1992)。
此处使用的术语免疫原性指，当向受体给药时，靶蛋白或治疗部分引起免疫反应(体液或细胞免疫反应)的能力的度量。本发明涉及受检者人源化抗体的免疫原性。
减少免疫原性的人源化抗体是指相对于亲本抗体，如鼠抗体，显示出减少的免疫原性。
人源化抗体基本上保留亲本抗体的结合特性指能特异性结合抗原的人源化抗体，所述抗原被用来产生这种人源化抗体的亲本抗体识别。优选地，所述人源化抗体显示与亲本抗体相同的或基本上相同的抗原结合亲和力。理想地，所述抗体的亲和力不少于亲本抗体亲和力的10％，更优选地，不少于约30％，最优选地，其亲和力不少于亲本抗体的50％。检测抗原结合亲和力的方法是本领域公知的，包括半数最大(half-maximal)结合检测，竞争性检测和Scatchard分析。合适的抗原结合检测也在本申请中描述。
“回复突变”是一种引入编码人源化抗体的核苷酸序列的突变，该突变产生于与亲本抗体氨基酸相应的氨基酸(例如供体抗体，例如鼠抗体)。亲本抗体残基的某些框架残基在本发明抗体人源化的过程中可被保留，以便基本保留亲本抗体的结合特性，而同时使产物抗体的免疫原性最小化。在本发明的一个实施方式中，亲本抗体是鼠源的。例如，回复突变使人框架残基变成亲本鼠的残基。可以回复突变的框架残基的例子包括但不限于，规范残基(canonical residues)，界面填充残基(interface packing residues)，与结合位点邻近的特殊亲本残基，在“Vernier Zone”的残基(形成CDR停驻的平台)的残基(Foote & Winter，1992，J.Mol.Biol.224，487-499)和与CDR H3邻近的残基。
此处使用的术语“保守改变”指构象上或抗原上基本中性的改变，与天然蛋白质相比，它们在突变体多肽的三级结构产生很小的变化，或在突变体多肽的抗原决定基上产生很小的变化。当涉及本发明的抗体或抗体片段时，保守改变意指氨基酸的替换不会导致抗体不能结合目标受体。本领域普通技术人员可预测进行哪些氨基酸取代可以使构象上或抗原上高几率地保持中性。这种教导可由例如Berzofsky，(1985)Science 229932-940和Bowie等(1990)Science 2471306-1310提供。被认为影响保持构象上和抗原上中性的可能性的因素包括但不限于(a)疏水氨基酸的取代很少有可能影响抗原性，因为疏水残基更可能位于蛋白质的内部；(b)相似的生物化学取代很少有可能影响构象，因为取代的氨基酸在结构上模拟了天然氨基酸；(c)进化保守序列的改变有可能对构象有不利影响，因为这种保守意味着氨基酸序列可能具有功能上的重要性。本领域普通技术人员使用公知检测方法能评价蛋白构象的改变，例如但不限于微量补体固定法(microcomplementfixfation method)(Wasserman等(1961)J.Immunol.87290-295；Levine等(1967)Meth.Enzymol.11928-936)，并通过使用构象依赖的单克隆抗体结合研究(Lewis等(1983)Biochem.22948-954)。
此处使用的术语“治疗组合物”指直接或间接改善疾病症状的组合物。也即，施用该组合物减轻了疾病或紊乱的至少一种症状。
当用于描述本发明的抗体时，术语“特异性”表示本发明抗体的可变区识别并结合到一系列一个或多个受体上(即，根据可测量的结合亲和力差异，能从其它多肽中辨别出LT-β-R，尽管LT-β-R与该多肽之间可能存在局部的序列相同，同源或相似性)特异性抗体可能也对其它蛋白质(如，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A或在ELISA技术中的其它抗体)有影响，通过与该抗体可变区外部序列的相互作用，尤其在该分子的恒定区。确定本发明抗体结合特异性的筛选检测是本领域公知的且常规操作。这种检测的综合论述参见Harlow等(Eds.)，ANTIBODIESA LABORATORY MANUAL；冷泉港实验室；冷泉港，纽约，1988，第6章。本发明也包括识别并结合LT-β-R的片段的抗体，只要该抗体对LT-β-R有特异性。本发明的抗体可使用本领域公知的和常规操作方法产生。此处使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指一种抗体分子群，它仅含有一种能与LT-β-R的特殊表位发生免疫反应或结合的抗原结合位点。单克隆抗体组合物典型地显示了对LT-β-R特殊表位的单一结合亲和力，通过它进行免疫反应。为了制备直接针对LT-β-R或其衍生物、片段、类似物或同系物的单克隆抗体，可以使用通过连续细胞系培养提供抗体分子产物的任何技术。这种技术包括但不限于杂交瘤细胞技术(参见Kohler & Milstein(1975)Nature 256495-497)；trioma技术；人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor，等(1983)Immunol.Today472)和EBV杂交瘤技术来产生人单克隆抗体(参见Cole，等.，1985 InMONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
实践本发明可采用人单克隆抗体，并可通过使用人杂交瘤细胞(参见Cote等(1983).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802026-2030)或通过用体外EB病毒(参见Cole等(1985)MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，Alan R.Liss，Inc.，77-96页)转化人B细胞来产生。本发明的嵌合和人源化的单克隆抗体可通过本领域公知的重组DNA技术产生，例如使用以下文献描述的方法PCT国际申请PCT/US86/02269；欧洲专利申请184,187；欧洲专利申请No.171,496；欧洲专利申请No.173,494；PCT国际公布WO 86/01533；美国专利No.4,816,567；欧洲专利申请No.125,023；Better等(1988)Science2401041-1043；Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.1393521-3526；Sun等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84214-218；Nishimura等(1987)Cancer Res.47999-1005；Wood等(1985)Nature 314446-449；Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.801553-1559)；Morrison(1985)Science 2291202-1207；Oi等(1986)BioTechniques 4214；U.S.Pat.No.5,225,539；Jones等(1986)Nature321552-525；Verhoeyan等(1988)Science 2391534和Beidler等(1988)J.Immunol.1414053-4060。
本发明涉及结合人LT-β-R的人源化单克隆抗体和利用该抗体的诊断方法，以及它们作为治疗剂的用途。本发明进一步涉及编码所述人源化抗体的核苷酸序列，和它们在重组细胞中的表达。更特别地，本发明涉及来自小鼠BHA10的与人LT-β-R特异性结合的人源化抗体。
鼠BHA10(mBHA10)是从被人LT-β-R-Ig融合蛋白免疫的鼠中分离出的一种鼠IgG1，κ抗体(Browning等，J.Immunol.15433(1995))。它的分离和抗肿瘤性质已被描述(Browning等J.Exp.Med.183867(1996)。本发明申请人根据布达佩斯协议的规定，已将产生mBHA10的杂交瘤细胞系贮存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并给予ATCC保藏号HB11795(PCT/US96/01386)。
申请人也已说明与各种激动剂抗LT-β-R抗体与LT-β受体的交联可使LT-β受体活化(即，可模仿天然配体的效果)(PCT/US96/01386)。在各种LT-β受体被表达的体内肿瘤模型中，受体活化反过来已显示抑制肿瘤的生长。LT-β受体已经显示被表达于许多癌细胞，包括例如非小肺癌细胞(NSCLC)，结直肠癌细胞(CRC)，乳腺癌细胞以及前列腺、胃(gastric)、皮肤、胃、食道和膀胱癌细胞上。
激动剂LT-β-R抗体抑制的肿瘤的非限制性实例包括以下实体瘤HT29结肠腺癌，HT3宫颈癌，A375黑色素瘤，MDA-231乳腺癌和早期结肠肿瘤。因此，此处描述的激动剂LT-β-R抗体，尤其是人源化抗体，它们的性质使得它们用于治疗需要LT-β-R活化和/或调变LT-β-R/LT-β-R配体相互作用的疾病，包括如治疗或减少受检者(例如人)体内瘤的增长、严重性或影响。
人源化mBHA10单克隆抗体包括需要基本上保留此处描述的mBHA10单克隆抗体结合特性的模拟分析和回复突变。
鼠可变区的模拟分析CDR包含最有可能结合抗原的残基，并必须被保留在重构抗体中。CDR由Kabat等，Sequence of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国健康和公共事业部，美国政府印刷局，1991公开的序列限定。CDR属于规范类型(Chothia等，1989 Nature，342，877-883)，其关键残基很大程度上决定CDR环的结构橡象。这些残基在重构抗体中几乎总是保留。mBHA10轻链可变区的多肽序列如下所示，根据Kabat编号系统用下划线标出CDR和残基位置序号1 DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVGINVAWYQQKP41 GQSPKSLISSASYRYSGVPD RFTGSGSGTD FTLTITNVQS81 EDLAEYFCQQYDTYPFTFGS GTKLEIK(SEQ ID NO1)mBHA10重链可变区的多肽序列如下所示，根据Kabat标号系统用下划线标出CDR的和残基位置序号(包括粗体的氨基酸52a(pro)，82a(ser)，82b(ser)，82c(leu)，且在位置100没有氨基酸)1QVQLQQSGPE LVKPGASVRI SCKASGYTFTTYYLHWVKQRaa52a41 PGQGLEWIGWIYPGNVHAQYNEKFKGKATLT ADKSSSTAYMaa82a-82c aa10081 QLSSLTSEDSAIY FCARSWEGF*PYWGQGTTVT VSS(SEQ ID NO2)用FASTA程序比较mBHA10的可变轻链和重链与鼠和人亚类的共有序列(Johnson，G.，Wu，T.T.Kabat数据库及其应用未来趋势氨基酸研究29，205-206，2001；Wu和Kabat，J.Exp.Med.132211-250(1970))。mBHA10可变轻链是鼠晟类轻链的一员，具有63.7％、超过113个氨基酸的同一性，mBHA10可变重链是鼠IIb亚类的一员，具有73.2％、超过127个氨基酸的同一性。可变重链与人的I亚类相比较具有62％、超过129个氨基酸的同一性。
本发明的互补决定区(CDR)划分为规范(canonical class)类。L1环分到规范类2(11个残基的环)，L2分到类1(7个残基)，L3分到类1(9个残基)。H1环分到类1(5个残基)允许Leu34。H2和H3环不属于规范类。这些类型中起重要作用的规范残基列于下表1。
在可变轻链和重链之间的界面上的残基已被限定(Chothia等，1985 J.Mol.Biol.，186，651-663)。它们通常在重构抗体中被保留。在mBHA10中，在界面处的个别残基是不同寻常的，即可变轻链的酪氨酸36和苯丙氨酸87以及可变重链的苯丙氨酸91。
在1999年9月版的Kabat数据库[NCBI，NIH]中，通过分析所有鼠和人的可变链序列确定不同寻常的框架残基。mBHA10特异性的差异被认为可指示体细胞突变，如果该差异接近结合位点，该突变增强了结合亲和力。轻链上发现的不同寻常的框架残基为Y36，S49，T63和F87，重链上的为Y27，T30，I48，A67，L69和F91。
模拟可变区的结构本发明的轻链和重链相对非-丰余数据库(non-redundant database)排列，以确定用于构建轻链和重链三维模型的结构框架。利用BLAST，发现该轻链与鼠Fab片段(12E8)具有85％的同一性，发现该重链与鼠IGGA2的Fab片段(1PLGH)具有81％的同一性。利用分子模型包装Sybyl(Tripos Inc.)，分别用12E8的轻链和1PLGH的重链构建该轻链和重链的三维结构。在控制台(console)评估该模型的结构完整性，并发现是合理的。
重构可变区的设计利用种系匹配选择人源受体框架以“接受”mBHA10的CDR(Rosok等J.Biol.Chem(1996)27122611-22618)。使用软件程序IgBLAST搜索来自NCBI，ENTRZ(国家卫生研究所)种系数据库和非-丰余数据库。基于序列同一性和可能的回复突变进行人源受体框架的选择。
对可变轻链(VL)，人源框架最终选自种系序列L1/L15和J1(Bentley等(1983)Cell 32181-189；Cox等(1994)Eur.J.Immunol.，24827-836和Heiter等(1982)J.Biol.Chem.2571516-1522)，对可变重链(VH)，选自种系序列1-69/J6(Tomlinson等(1992)J.Mol.Biol.，227776-798 and Mattila等(1995)Eur.J.Immunol.，252578-2582)。人源VL和VH框架与鼠源序列相比，有21个残基不同。
人源框架的回复突变在人源单克隆抗体中，最不可预料的步骤是从亲本抗体中识别需要被保留的关键框架残基(即在本实例中，亲本抗体是鼠源的)，因为这些关键框架残基基本上保留了与亲本抗体的结合特性，同时使产物抗体的潜在免疫原性最小化。保留与结合位点邻近的规范残基、界面填充残基和不同寻常的鼠源残基尤为重要。此外，还要考虑“Vernier Zone”的残基(形成CDR停驻的平台)(Foote & Winter，1992 J.Mol.Biol.224，487-499)和与CDR H3接近的残基。回复到亲本抗体的突变(即从人源框架的残基回复突变到鼠源)在此处是指回复突变。
已制得重构可变轻链(VL#)的三个版本和重构可变重链(VH#)的三个版本。通常，第一版本含有最多的回复突变，第三版本包含有最少的回复突变(即多数“人源化”)。本发明涉及来自mBHA10的人源化抗体，其含有以任意组合的选自下述可变轻链(即VL#1，VL#2或VL#3)的轻链可变区和选自下述可变重链(即VH#1，VH#2或VH#3)的重链可变区。
重构可变轻链的回复突变36F(苯丙氨酸)→Y(酪氨酸)这是一个界面填充残基。它在可变轻链构建物的VL#1和VL#2中从苯丙氨酸回复突变为酪氨酸，但是在可变轻链构建物的VL#3中保留了苯丙氨酸。
49Y(酪氨酸)→S(丝氨酸)该位置接近CDR，在鼠源和人源框架中都是不同寻常的。在所有三个可变轻链构建物中都从酪氨酸回复突变为丝氨酸。
63S(丝氨酸)→T(苏氨酸)该位置接近CDR。仅在可变轻链构建物的VL#1中由丝氨酸回复突变为苏氨酸。
87Y(酪氨酸)→F(苯丙氨酸)这是一个界面填充残基，在人源框架中是不同寻常的。在可变轻链构建物的VL#1和VL#2中从酪氨酸回复突变为苯丙氨酸，但在VL#3中保留了酪氨酸。
重构可变重链中的回复突变27G(甘氨酸)→Y(酪氨酸)这是一个在所有三个版本中回复突变为鼠残基的规范残基。
30S(丝氨酸)→T(苏氨酸)该位置接近CDR，可影响构象。在可变重链构建物的所有三个版本中从丝氨酸回复突变为苏氨酸。
48M(甲硫氨酸)→I(异亮氨酸)该位置接近CDR。在可变重链构建物的VH#1和VH#2中由甲硫氨酸回复突变为异亮氨酸，但在VH#3中不突变。
67V(缬氨酸)→A(丙氨酸)该位置接近CDR，在人源框架中是不同寻常的。在重链可变区构建物的VH#1和VH#2中由缬氨酸回复突变为丙氨酸，但在VH#3中不突变。
69I(异亮氨酸)→L(亮氨酸)该位置接近CDR，在人源框架中是不同寻常的。在可变重链构建物的VH#1由异亮氨酸回复突变为亮氨酸，但在VH#2和VH#3中不突变。
91Y(酪氨酸)→F(苯丙氨酸)这是一个界面填充残基。在可变重链构建物的VH#1中由酪氨酸回复突变为苯丙氨酸，但在VH#2和VH#3中不突变。
可变轻链和重链的不同版本的氨基酸和核苷酸序列如下重构可变轻链BHA10的重构可变轻链-可变轻链-版本1(VL#1)
1GACATTCAGATGACCCAGTCTCCTAGCTCCCTGTCCGCCTCAGTAGGAGACAGGGTCACC 60D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T61 ATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTATTAACGTTGCCTGGTATCAACAGAAACCA 120I T CK A S Q N V G I N V AW Y Q Q K Paa36121 GGGAAGGCTCCTAAATCACTGATTTCCTCGGCCTCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTTCT 180G K A P K S L I SS A S Y R Y SG V P Saa49181 AGATTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT 240R F T G S G S G T D F T L T I S S L Q Paa63241 GAAGACTTCGCAACCTATTTCTGTCAGCAATATGACACCTATCCATTCACGTTCGGCCAG 300E D F A T Y F CQ Q Y D T Y P F TF G Qaa87301 GGTACCAAGGTGGAGATCAAA 321G T K V E I KSEQ ID NO3-代表上述重构VL#1的核苷酸序列。
SEQ ID NO4-代表上述重构VL#1的氨基酸序列。
BHA10的重构可变轻链—可变轻链-版本2(VL#2)1GACATTCAGATGACCCAGTCTCCTAGCTCCCTGTCCGCCTCAGTAGGAGACAGGGTCACC 60D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T61 ATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTATTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCA 120I T CK A S Q N V G I N V AW Y Q Q K Paa36121 GGGAAGGCTCCTAAATCACTGATTTCCTCGGCCTCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTTCC 180G K A P K S L I SS A S Y R Y SG V P Saa49181 AGATTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCT 240R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P241 GAAGACTTCGCAACCTATTTCTGTCAGCAATATGACACCTATCCATTCACGTTCGGCCAG 300E D F A T Y F CQ Q Y D T Y P F TF G Qaa87301 GGTACCAAGGTGGAGATCAAA 321G T K V E I KSEQ ID NO5-代表上述重构VL#2的核苷酸序列。
SEQ ID NO6-代表上述重构VL#2的氨基酸序列。
BHA10的重构可变轻链—可变轻链版本3(VL#3)
1 GACATTCAGATGACCCAGTCTCCTAGCTCCCTGTCCGCCTCAGTAGGAGACAGGGTCACC 60D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T61 ATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTATTAATGTAGCCTGGTTCCAACAGAAACCC 120I T CK A S Q N V G I N V AW F Q Q K P121 GGGAAGGCTCCTAAATCACTGATTTCCTCGGCCTCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTTCT 180G K A P K S L I SS A S Y R Y SG V P Saa49181 AGATTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT 240R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P241 GAAGACTTCGCAACCTATTACTGTCAGCAATATGACACCTATCCATTCACGTTCGGCCAG 300E D F A T Y Y CQ Q Y D T Y P F TF G Q301 GGTACCAAGGTGGAGATCAAA 321G T K V E I KSEQ ID NO7-代表上述重构V-3的核苷酸序列。
SEQ ID NO8-代表上述重构VL#3的氨基酸序列。
重构可变重链BHA10的重构可变重链-可变重链-版本1(VH#1)1 CAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTG 60Q V Q L V Q S G A E V K K P G S S V K V61 TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACTTTCACAACCTACTATTTGCACTGGGTGAGGCAGGCC 120S C K A S G Y T F TT Y Y L HW V R Q Aaa27aa30121 CCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTCATGCTCAGTAC 180P G Q G L E W I GW I Y P G N V H A Q Yaa48181 AATGAGAAGTTCAAGGGCAGGGCCACACTGACAGCAGACAAATCCACCAGCACAGCCTAC 240N E K F K GR A T L T A D K S T S T A Yaa67 aa69241 ATGGAGCTCAGCAGCCTGAGGTCTGAAGATACTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCCTGG 300M E L S S L R S E D T A V Y F C A RS Waa91301 GAAGGTTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 348E G F P YW G Q G T T V T V S SSEQ ID NO9-表示上述重构VH#1的核苷酸序列。
SEQ ID NO10-表示上述重构VH#1的氨基酸序列(Kabat编号系统，包括52a位置的脯氨酸，82a位置的丝氨酸，82b位置的丝氨酸，82c位置的亮氨酸和100位置的缺失氨基酸)。
BHA10的重构可变重链—可变重链版本2(VH#2)
1CAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTG 60Q V Q L V Q S G A E V K K P G S S V K V61 TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACTTTCACAACCTACTATTTGCACTGGGTGAGGCAGGCC 120S C K A S G Y T F TT Y Y L HW V R Q Aaa27aa30121 CCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTCATGCTCAGTAC 180P G Q G L E W I GW I Y P G N V H A Q Yaa48181 AATGAGAAGTTCAAGGGCAGGGCCACAATCACTGCAGACAAATCCACCAGCACAGCCTAC 240N E K F K GR A T I T A D K S T S T A Yaa67241 ATGGAGCTCAGCAGCCTGAGGTCTGAAGATACTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCCTGG 300M E L S S L R S E D T A V Y Y C A R S W301 GAAGGTTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 348E G F P YW G Q G T T V T V S SSEQ ID NO11-表示上述重构VH#2的核苷酸序列。
SEQ ID NO12-表示上述重构VH#2的氨基酸序列(Kabat编号系统，包括52a位置的脯氨酸，82a位置的丝氨酸，82b位置的丝氨酸，82c位置的亮氨酸和100位置的缺失氨基酸)。
BHA10的重构可变重链-可变重链-版本3(VH#3)1 CAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTG 60Q V Q L V Q S G A E V K K P G S S V K V61 TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACTTTCACAACCTACTATTTGCACTGGGTGAGGCAGGCC 120S C K A S G Y T F TT Y Y L HW V R Q Aaa27 aa30121 CCTGGACAGGGACTTGAGTGGATGGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTCATGCTCAGTAC 180P G Q G L E W M GW I Y P G N V H A Q Y181 AATGAGAAGTTCAAGGGCAGGGTCACAATCACTGCAGACAAATCCACCAGCACAGCCTAC 240N E K F K GR V T I T A D K S T S T A Y241 ATGGAGCTCAGCAGCCTGAGGTCTGAAGATACTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCCTGG 300M E L S S L R S E D T A V Y Y C A RS W301 GAAGGTTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 348E G F P YW G Q G T T V T V S SSEQ ID NO13-表示上述重构VH#3的核苷酸序列。
SEQ ID NO14-表示上述重构VH#3的氨基酸序列。(Kabat编号系统，包括52a位置的脯氨酸，82a位置的丝氨酸，82b位置的丝氨酸，82c位置的亮氨酸和100位置的缺失氨基酸)。
用上述可变轻链和重链构建人源化BHA10抗体，进一步描述见实施例4。例如，按照实施例4所述方法构建版本4人源化BHA10抗体(“版本4人BHA10”)，使用含有#2轻链的表达载体pKJS49结合含有#3重链的表达载体pKJS46。版本4人BHA10的轻链和重链的氨基酸和核苷酸序列如下所示DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQNVGINVAWYQQKP GKAPKSLISSaa36aa49ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYFCQQYDTYPFTFGQaa87GTKVEIK{RTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC}(SEQ ID NO15)上述SEQ ID NO15-代表版本4人BHA10的氨基酸序列。下划线部分为CDR；粗体部分为回复突变Y36，S49和F87；括号内为人κ恒定区(Kabat编号系统)。
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFTTYYLHWVRQA PGQGLEWMGWaa27 aa30IYPGNVHAQY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSWEGFPYWGQGT TVTVSS{ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG}(SEQ ID NO16)上述SEQ ID NO16表示人BHA10重链版本4的氨基酸序列。下划线部分是CDR；粗体部分是回复突变Y27和T30；括号内部分是人IgG1恒定区(Kabat编号系统)。
其它人源化抗体包括此处描述可制得的重构轻链可变区和重链可变区的不同型。例如，可制得包括人源恒定轻链(非限定性的例子包括人κ恒定区)和人源恒定重链(非限定性的例子包括人IgG1恒定区)结合任一重构可变轻链(VL#1，VL#2或VL#3)和重构可变重链(VH#1，VH#2或VH#3)的抗体。
本发明进一步涉及重构VH和VL序列的等效体或变异体，如含有一个或多个保守氨基酸的取代物，它们基本上不影响LT-β-R结合。含有人源可变重链和轻链序列的人源化LT-β-R抗体可以通过重组的方法获得，如实施例所述。
在另一实施方式中，涉及本发明抗体的免疫化学衍生物包括，例如1)免疫毒素(抗体和细胞毒部分的结合物)，2)标记衍生物(即放射性标记的，酶标记或荧光标记的)，所述标记提供了鉴别包含标记抗体的免疫复合物的方法。
细胞毒部分可以是细胞毒类药物，或是细菌或植物来源的酶活性毒素，或是这种毒素的酶活性片段。这里使用的酶活性毒素和片段是白喉A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))，蓖麻毒素(ricin)A链，abrin A链，蕨莲根毒素(modeccin)A链，α-八叠球菌，Aleurites fordii proteins，dianthin proteins，美洲商陆(Phytolaccaamericana)蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，momordica charantia inhibitor，麻疯树毒蛋白(curcin)，巴豆毒蛋白(crotin)，sapaonaria officinalis inhibitor，gelonin，mitogellin，局限曲菌素(restrictocin)，酚霉素和伊诺霉素。选择性地，该抗体与小分子抗癌药偶联。
单克隆抗体的结合物利用各种双官能蛋白偶合剂制得。这种试剂的例子包括SPDP，IT，亚氨基酯类的双官能衍生物如二甲基乙二酰亚胺HCl，活性酯如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯，醛如戊二醛，二叠氮基化合物如二(p-叠氮苯甲酰)己二胺，二重氮基衍生物如二-(p-重氮苯甲酰)-乙二胺，二异氰酸盐如甲代亚苯基2，6-二异氰酸盐和二-活性氟化合物如1，5-二氟-2，4-二硝苯基。毒素的赖氨酸(lysing)部分可与抗体的Fab片段连接。
治疗癌症的细胞毒放射性药品可以通过将放射性同位素(如I，Y，Pr)结合到抗体上制得。此处使用的术语“细胞毒部分”意指包括这种同位素。在另一实施方式中，细胞毒药被装入脂质体中，脂质体被涂上特异性结合生长因子受体的抗体。由于存在很多受体位点，该方法使得大量药物传输到正确的细胞类型中。
化学改性在一些实施方式中，本发明的抗体和抗体片段可被化学改性，以产生想要的效果。例如，本发明的抗体PEG化(pegylation)和抗体片段可进行任何本领域公知的PEG化反应，如在下述参考文献中所述Focus on GrowthFactors 34-10(1992)；EP 0154316；和EP0401384(均全文引入此处作为参考)。优选地，可通过与反应性的聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶性的多聚体)的酰化反应或烷基化反应进行PEG化。优选的用于本发明抗体和抗体片段的PEG化的水溶性多聚体是聚乙二醇(PEG)。此处所用的“聚乙二醇”意指包括任何形式的PEG，所述PEG已被用于衍生其它蛋白质，如单(Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。
制备本发明PEG化的抗体和抗体片段的方法通常包括以下步骤(a)在抗体或抗体片段开始连接到一个或多个PEG基团的条件下，该抗体或抗体片段与聚乙二醇，如PEG的反应性酯或醛衍生物反应，(b)获得反应产物。对于本领域普通技术人员，选择最佳的反应条件或基于已知参数和想要结果的酰化反应是明显的。
PEG化抗体或抗体片段可通常被用于治疗病症，所述病症可能被减轻或调整，通过施用这里描述的抗体和抗体片段。通常，相对于非PEG化的抗体和抗体片段，PEG的抗体和抗体片段具有增强的半衰期。该PEG化的抗体和抗体片段可以单独施用，共同施用或与其它药物组合物联合施用。
在本发明的另一实施方式中，利用本领域公知的技术将抗体或它们的抗原结合片段与清蛋白偶联。
本发明的另一实施方式中，抗体或它们的片段被改性以减少或消除潜在的糖基化作用位点。这种改性抗体通常被归为“去糖基化”抗体。为了改善抗体或其抗原结合片段的结合亲和力，可改变抗体的糖基化位点，如通过突变(如定点突变)。“糖基化位点”指被真核细胞识别的氨基酸残基，真核细胞作为糖残基连接位置。被碳水化合物，如寡糖连接的氨基酸典型地为天冬酰胺(N-结合)，丝氨酸(O-结合)和苏氨酸(O-结合)残基。为了鉴别抗体或抗原结合片段中潜在的糖基化作用位点，测定该抗体的序列，如通过利用公众可获得的数据库，如由生物序列分析中心提供的网站(参见http//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/测知N-结合糖基化作用位点)以及http//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/预测O-结合糖基化作用位点)。其它改变抗体糖基化作用位点的方法在US专利6,350,861和5,714,350中已描述。
在本发明的另一实施方式中，抗体或它们的片段可被改变，其中抗体的恒定区域被改性，使得相对于非改性抗体，至少一个恒定区-介导的生物学效应功能减弱。为了修饰本发明的抗体，使得它表现出减弱的与Fc受体的结合力，该抗体免疫球蛋白的恒定区部分可在特定的对Fc受体(FcR)相互反应必需的区域突变(参见，如Canfield，S.M.和S.L.Morrison(1991)J.Exp.Med.1731483-1491；和Lund，J.等(1991)J.of Immunol.1472657-2662)。抗体FcR结合力的减少也可减少依赖FcR相互反应的其它效应功能，如调理作用和吞噬作用和抗原依赖性细胞毒作用。
用途本发明的抗体和标记抗体可用于各种免疫成像或免疫测定步骤，用来检测患者体内癌症的存在，或监控已诊断有癌症的患者体内癌症的状态。当用来监控癌症状态时，需使用定量免疫测定方法。如果周期性进行这种监控检测，并比较结果，可确定出关于患者肿瘤负荷的增加或减少。通常施用的检测技术包括直接和间接分析。如果样品包括癌细胞，标记抗体会结合到这些细胞上。冲洗组织或细胞，除去非结合标记抗体，可读出该组织样品中标记的免疫复合物的存在。在间接检测中，组织或细胞样品与非标记单克隆抗体培养。然后用抗单克隆抗体的标记抗体(如，标记的抗鼠源抗体)处理样品，清洗，读出三元络合物的存在。
对于诊断应用，该抗体典型地以试剂盒形式分配。这些试剂盒典型地包括在适当容器中的标记或非标记形式的抗体，间接检测需要的温育试剂，和依赖标记性质的底物或衍生试剂。
在另一实施方式中，本发明的抗体具有治疗疾病或病症的用途，所述疾病或病症中，LT-β-R的活化作用在治疗上是有益的。这种病症包括但不限于治疗、预防或减少肿瘤的发展、严重性或影响。
本发明的一个实施方式为治疗哺乳动物(即人)体内与不希望有的细胞增值相关的病症的方法，通过向哺乳动物施用治疗有效量的包含本发明人源化LT-β-R抗体的组合物。
本发明的另一实施方式提供了一种治疗哺乳动物(即人)体内过量表达LT-β-R实体瘤(即癌)的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的结合LT-β-R的人源化LT-β-R抗体，以减少肿瘤体积。癌细胞的增殖由LT-β-R调整的例子可通过体外测量LT-β-R水平和/或表达在肿瘤组织文库中的LT-β-R配体(即LTα1β2或LIGHT)的信息来筛选。本发明涉及的肿瘤类型包括但不限于非小细胞肺癌(NSCLC)，结肠直癌(CRC)，乳腺癌以及前列腺、胃、皮肤、胃、食道和膀胱癌。
本发明的人源化抗体用于治疗与不希望有的细胞增殖相关病症，尤其是肿瘤治疗，它有利地抑制了肿瘤生长，例如经检测肿瘤体积减少，约10％，20％，30％或40％以上，最好约50％以上。通过筛选获得该人源化抗体(参见，如实施例10的论述)。例如，本发明的人源化抗体可基于减少的肿瘤体积相对于处理的癌细胞的比值来筛选(如大于约10％，20％，30％，40％或50％)。
本发明也提供了包含本发明人源化抗体和药学可接受赋形剂的药物组合物。适当的载体，以及它们的剂型公开于Remington’PharmaceuticalSciences，第16版，1980，Mack Publishing Co.，Oslo等出版。用于该剂型的典型的药学可接受的盐可使得该剂型等渗。载体的实例包括缓冲液例如盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。溶液的pH优选约5-约8，更优选约7.4-约7.8。进一步，载体包括持续释放制剂，如固体疏水聚合体的半透性基质，该基质是成形的物质形式，如脂质体，薄膜或微粒。对本领域技术人员明显的是，一些载体可更优选使用，根据如给药途径和施用的药物组合物浓度。
可通过注射(如静脉、腹膜、皮下、肌肉)完成给药，或通过其它方法例如确保以有效形式传到血流中的灌输法。
本发明的人源化抗体可以有效剂量给药，来治疗特殊的临床病症(即减轻或消除患者肿瘤负荷的量)。它们通常是肠道外给药，如果可能，在靶细胞位点或静脉内给药。对给定的应用确定优选的药物剂型和治疗有效量标准是本领域技术人员公知的。该剂量和剂量方案是基于病症的性质(即癌的性质)，特殊免疫毒素(如果使用)的性状，例如它的治疗指数，患者和患者的病史。有效量的范围在例如约0.05至约100mg/kg体重/天。更优选，约0.05mg，0.1mg，0.2mg，0.3mg，0.4mg，0.5mg，0.6mg，0.7mg，0.8mg，0.9mg，1mg，2mg，3mg，4mg，5mg，6mg，7mg，8mg，9mg，10mg，15mg，20mg或25mg/kg体重/天。或者约0.05至约100mg，更优选，约0.05mg，0.1mg，0.2mg，0.3mg，0.4mg，0.5mg，0.6mg，0.7mg，0.8mg，0.9mg，1mg，2mg，3mg，4mg，5mg，6mg，7mg，8mg，9mg，10mg，15mg，20mg或25mg/kg体重/周。或者约0.05至约100mg，更优选，约0.05mg，0.1mg，0.2mg，0.3mg，0.4mg，0.5mg，0.6mg，0.7mg，0.8mg，0.9mg，1mg，2mg，3mg，4mg，5mg，6mg，7mg，8mg，9mg，10mg，15mg，20mg或25mg/kg体重/2周。或者约0.05至约100mg，更优选，约0.05mg，0.1mg，0.2mg，0.3mg，0.4mg，0.5mg，0.6mg，0.7mg，0.8mg，0.9mg，1mg，2mg，3mg，4mg，5mg，6mg，7mg，8mg，9mg，10mg，15mg，20mg或25mg/kg体重/3周。或者约0.05至约100mg，更优选，约0.05mg，0.1mg，0.2mg，0.3mg，0.4mg，0.5mg，0.6mg，0.7mg，0.8mg，0.9mg，1mg，2mg，3mg，4mg，5mg，6mg，7mg，8mg，9mg，10mg，15mg，20mg或25mg/kg体重/4周。
另一实施方式中，处理肿瘤细胞，通过1)给患者施用本发明的人源化抗体和2)化学治疗剂。化学治疗剂的实例包括但不限于顺铂，红豆杉醇(faxol)，camptosar，羟基柔红霉素(dox)，5-FU，gemcitabine，DM-1(来自Immunogen)，长春花碱，放线菌素D，表鬼臼毒吡喃葡糖苷，氨甲喋呤和阿霉素。本领域普通技术人员会考虑到一些变量，以确定治疗剂方案和个体的给药剂量，包括如，给药途径和患者的临床病症。在一个实施方式中，本发明的抗体被设计在化学治疗剂或放射治疗存在下给药。在另一实施方式中，按照与化学疗法或放射治疗联合使用的说明配制和包装本发明抗体，或与化学疗法或放射治疗联合使用销售或宣传本发明抗体。
除非另有说明，本发明实例使用本领域技术人员公知的常规细胞生物学、细胞培养、微生物、重组DNA、蛋白质化学和免疫学技术。这些技术在文献中都有公开。参见如，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版(Sambrook，Fritsch和Maniatis编)，冷泉港实验室印刷，1989；DNACloning，卷I和II(D.N.Glover编)，1985；Oligonucleotide Synthesis，(M.J.Gait编)，1984；U.S.专利No.4,683,195(Mullis等，)；Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins，编)，1984；Transcription andTranslation(B.D.Hames和S.J.Higgins编)，1984；Culture of Animal Cells(R.I.Freshney编).Alan R.Liss，Inc.，1987；Immobilzed Cells and Enzymes，IRLPress，1986；A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal)，1984；Methodsin Enzymology，卷154和155(Wu等编)，学术出版社，纽约；Gene TransferVectors for Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编)，1987，冷泉港实验室；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayer和Walker，编)，学术出版社，伦敦，1987；Handbook of Experiment Immunology，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)，1986；Manipulating the MouseEmbryo，冷泉港实验室印刷，1986。
以下实施例用来说明本发明，不应作为对本发明的限制。
实施例实施例1muBHA10可变区的克隆使用Qiagen Rneasy小型试剂盒由BHA10小鼠杂交瘤细胞(ATCC保藏号HB-11795)制备全细胞RNA，根据厂商推荐的步骤。编码重链和轻链可变区的cDNA由全细胞RNA克隆，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，第一股cDNA使用GIBCO BRL上标前置放大系统(SuperScriptPreamplification System)，根据厂商推荐的步骤，由随机六聚体启动。
用于鼠BHA10免疫球蛋白重链可变区PCR扩增的引物是5′TGA GGAGAC GGT GAC CGT GGC CCT TGG CCC C 3′(SEQ ID NO17)和5′AGGTSM ARC TGC AGS AGT CWG G 3′(S＝C/G，M＝A/C，R＝A/G，W＝A/T)(SEQ ID NO18)。含有信号序列的该BHA10轻链可变区由以下引物扩增5’ACT AGT CGA CAT GGG CWT CAA GAT GGA GTC ACA KWY YCWGG 3’(K＝G/T，W＝A/T，和Y＝C/T)(SEQ ID NO19)，5’GTT AGA TCTCCA GCT TGG TCC C 3’(SEQ ID NO20)。PCR在94℃进行3分钟热启动，然后用Clontech的AdvanTaq DNA聚合酶循环35次在94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，68℃延伸2分钟，然后最后在68℃延伸7分钟。使用QiagenQia快速凝胶提取试剂盒凝胶-纯化PCR产物，根据厂商推荐的步骤。纯化的BHA10 PCR产物被亚克隆到Invitrogen的pCR2.1-TOPO克隆载体上，利用它们的TOPO TA克隆试剂盒，根据厂商推荐的步骤。重链RT-PCR亚克隆被命名为pAND138。轻链RT-PCR亚克隆被命名为pAND145。来自多个独立亚克隆的插入片段被测序。除了PCR引物中简并位置，独立亚克隆的插入片段的序列是相同的。被cDNA序列从被信号序列扩增的PCR产物预测的成熟轻链的N端氨基酸序列恰好与来自Edman降解(DIVMTQSQKF)(SEQ ID NO21)的纯化真实的BHA10轻链的N端氨基酸相匹配。成熟重链残基1-16的预期序列与由(deblocked)纯化的BHA10重链([Q]VQLQQSGPELVKPGA)(SEQ ID NO22)的Edman降解确定的相匹配。
可变区序列的Blast分析证实了它们的免疫球蛋白的同一性(identity)。BHA10的重链可变区是鼠亚类II(B)的一员。Tucker等Science2061299-1303(1979)。BHA10轻链可变区是小鼠κ亚类(subgroup)I的一员。Kabat等(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest.第5版，美国健康与公共事业部。BHA10小鼠轻链可变区和重链可变区的预测氨基酸序列分别在SEQ ID NO1和2中显示。
实施例2chBHA10的构建与表达编码小鼠BHA10重链和轻链可变区的cDNA被用来构建表达小鼠-人嵌合体(chBHA10)的载体，所述嵌合体中鼠BHA10的可变区与人IgG1(Ellison等(1982)Nucleic Acids Res.104071-4079)和κ恒定区(Heiter等(1980)Cell 22197-207)连接。为了构建重链嵌合体，来自BHA10重链亚克隆pAND138的0.32kb的部分PstI-BstEII片段被亚克隆到来自5a8重链质粒pLCB7(5a8是一种分子水平上克隆的CD4-特异性的mAb-ATCC保藏号HB-10881))脱去磷酸的2.82kb PstI-BstEII的载体片段上，以在5’端加入小鼠重链信号序列，在鼠BHA10重链可变区的3’端加入剪接供体部位。该质粒称为pAND146，其重链成熟N端被重构，使得与纯化的真正的BHA10重链的N末端序列(QVQLQQSGP)(SEQ ID NO23)相匹配。合成的质粒pAND146中的重链序列由DNA序列测定证实。含有人IgG1恒定区的来自质粒pAND146的0.43kb的NotI-HindIII重链可变区和来自质粒pEAG964的1.21kb的HindIII-NotI片段被亚克隆到pCEP4(Invitrogen)EBV表达载体-衍生质粒pCH269的NotI位点，产生质粒pAND147。
为了构建轻链嵌合体，来自BHA10轻链可变区质粒pAND145的0.42kb的EcoRI片段被亚克隆到线性化的，磷酸化的pUC-衍生克隆载体pNN09的EcoRI位点。该步骤在合成的质粒AND149中，加入了侧翼NotI位点。质粒pAND149中的轻链序列由DNA的测序确定。含有人κ轻链恒定区的来自pAND149的0.45kb NotI-BglII轻链可变区片段和来自质粒pEAG963的0.68kb BclI-NotI片段被亚克隆到pCEP4(Invitrogen)EBV表达载体-衍生质粒pCH269，产生质粒pAND151。
表达载体(chBHA10重链载体pAND147和chBHA10轻链载体pAND151)被联合转染到293-EBNA细胞，检测转染细胞的抗体分泌和特异性。空载体-转染细胞，或用EBV表达载体联合转染表达hu5c8(分子水平上克隆的CD154-特异性mAb)的细胞，以及huCBE11的细胞(LT-β-R-特异性mAb(已给予ATCC专利保藏号PTA-3357))作为对照。来自全细胞溶解产物和条件培养基的蛋白质A免疫沉淀反应的蛋白质印迹分析(用抗-人源重链和轻链抗体显色)证明嵌合BHA10-转染细胞合成和有效分泌抗体重链和轻链的水平与hu5c8-或huCBE11-转染细胞相似。来自转染细胞的LT-β-R-表达HT-29细胞条件培养基染色的FACS分析证明，嵌合BHA10抗体结合和产生的染色图谱与muBHA10和huCBE11的相似，而来自模拟的和hu5c8-转染细胞的条件培养基缺少LT-β-R在HT-29细胞上的染色。从大规模瞬时转染产生的嵌合BHA10被纯化，并被证明LT-β-R在HT-29细胞上染色，其表现Kd值(apparenf kd)明显地高于huCBE11大约两倍，与检测的muCBE11和muBHA10的相对亲和力相一致(Browning等，J.Exp.Med.183867，1996)。
实施例3重构BHA10可变区的构建BHA10的轻链可变区与人κI(Hieter等(1980)Cell 22197-207)相应，重链可变区与人重链亚类I(Ellison等(1982)Nucleic Acids Res.104071-4079)相应。使用程序IgBLAST通过与人的种系序列进行同源匹配来选择人源受体框架Sato等Mol.Immunol.31371-381(1994)人L1/L15/J1(Bentley等(1983)Cell 32181-189；Cox等(1994)Eur.J.Immunol.，24827-836和Heiter等(1982)J.Biol.Chem.2571516-1522)对于轻链，和人1-69/J6(Tomlinson等(1992)J.Mol.Biol.，227776-798和Mattila等(1995)Eur.J.Immunol.，252578-2582)对于重链。设计各重构可变轻链和可变重链的三个版本。通常第一个版本包含最多的回复突变的鼠源供体序列，第三个模型含有最少的鼠源供体序列(即最多“人源化”)。
BHA10可变区是通过结合单一位点消除(USE)和快速突变构建的，快速诱变使用Clontech的转化突变和Stratagene的快速突变试剂盒(Stratagene’s Quikchange mutagenesis kits)，根据厂商推荐的步骤进行。嵌合BHA10可变区质粒pAND146和pAND149被用作起始模板。用于框架改变的诱变引物(FR)如下所述。使用人源受体框架的cDNA序列，通过沉默突变引入，以产生限制性位点改变，使得易于识别突变质粒。突变质粒通过筛选引物的限制性位点改变来识别。合成质粒的可变区cDNA序列由DNA测序确定。
基于质粒的各种BHA10和相应的表达载体在下表2中描述。
重构可变重链(VH)可变重链(版本1)最初突变通过USE突变，使用pAND146模板，该模板带有去除了StuI限制性位点的框架2(FR2)引物5’GCA CTG GGT GAGGCA GGC CCC TGG ACA GGG ACT TG 3’(SEQ ID NO24)，产生了质粒pKJS030。该质粒随后进行两轮快速突变(Quikchange mutegenesis)，使用寡对5’CCC AGG TCC AAC TGG TGC AGT CTG GAG CTG AGG 3’(SEQ IDNO25)和它的框架1(FR1)的互补体(Complement)和5’GAA GTT CAA GGGCAG GGC CAC ACT GAC AGC AGA CAA ATC CAC CAG CAC AGC CTACAT GGA GCT CAG CAG CCT GAG GTC TGA AGA TAC TGC GGT CTATTT CTG TGC AAG ATC C 3’(SEQ ID NO26)和它的框架3(FR3)的互补体，每对删除PstI位点。合成的重构可变重链(VH#1)质粒标记为pKJS036。
可变重链(版本2)使用经单轮USE突变的pAND146模板，使用删除EcoRV和PstI位点的框架1引物5′CAG GTC CAA CTG GTG CAG TCTGGA GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG TCC TCA GTG AAG GTG TCCTGC AAG GC 3′(SEQ ID NO27)；删除StuI位点的框架2引物5′GCA CTGGGT GAG GCA GGC CCC TGG ACA GGG ACT TG 3′(SEQ ID NO28)；产生SacI位点的框架3引物5′GAA GTT CAA GGG CAG GGC CAC AAT CACTGC AGA CAA ATC CAC CAG CAC AGC CTA CAT GGA GCT CAG CAGCCT GAG GTC TGA AGA TAC TGC GGT CTA TTA CTG TGC AAG ATC C3′(SEQ ID NO29)。合成的重构可变重链(VH#2)质粒标记为pKJS031。
可变重链(版本3)最初突变通过USE突变，使用pAND146模板，该模板带有删除了EcoRV和PstI位点的框架1引物5′CAG GTC CAA CTG GTGCAG TCT GGA GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG TCC TCA GTG AAGGTG TCC TGC AAG GC 3′(SEQ ID NO30)，和产生SacI位点的框架3引物5′GAA GTT CAA GGG CAG GGT CAC AAT CAC TGC AGA CAA ATCCAC CAG CAC AGC CTA CAT GGA GCT CAG CAG CCT GAG GTC TGAAGA TAC TGC GGT CTA TTA CTG TGC AAG ATC C 3′(SEQ ID NO31)，产生质粒pKJS032。质粒pKJS032然后被用来作为快速突变(Quikchangemutagenesis)的模板，使用框架2引物对5′GGC CCC TGG ACA GGG ACTTGA GTG GAT GGG ATG GAT TTA TCC TGG 3’(SEQ ID NO32)和它的互补体，导致HpaII位点缺失。合成的重构可变重链(VH#3)质粒被标记为pKJS037。
人BHA10重链的表达载体如下制备将来自pKJS036，pKJS031或pKJS037的0.425kb NotI-HindIII重链可变区框架和来自质粒pEAG964含有人IgG1恒定区的1.21kb HindIII-NotI片段亚克隆到pCEP4 EBV表达载体-衍生的质粒pCH274的NotI位点，产生重链表达载体pKJS044(重链#1表达载体)，pKJS045(重链#2表达载体)和pKJS046(重链#3表达载体)。
重构可变轻链(VL)可变轻链(版本1)最初在模板质粒pAND149上经USE突变，用框架1引物5′GAT GGA GAC ATT CAG ATG ACC CAG TCT CCT AGC TCC CTGTCC GCC TCA GTA GGA GAC AGG GTC ACC ATC ACC TGC AAG GC 3′(SEQ ID NO33)，引入XmaI位点的框架2引物5′GTA GCC TGG TTC CAACAG AAA CCC GGG AAG GCT CCT AAA TCA C 3′(SEQ ID NO34)，引入XbaI位点的5′框架3引物5′CAG TGG AGT CCC TTC TAG ATT CACAGG CAG 3′(SEQ ID NO35)，和引入PstI位点的3′框架3引物5′CTCACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAC TTC GCA ACC TAT TTCTGT CAG C 3′(SEQ ID NO36)。合成的质粒标记为pKJS033。质粒pKJS033含有框架2内不需要的残基，因而使用第二框架2引物对5′GGG TAT TAATGT AGC CTG GTA TCA ACA GAA ACC AGG GAA GGC TCC 3′(SEQ IDNO37)和它的互补体进行快速突变，去除了XmaI位点并加入了BclI位点。质粒pKJS033也经一轮附加快速突变，使用框架4引物对5′CCT ATCCAT TCA CGT TCG GCC AGG GTA CCA AGG TGG AGA TCT AAC AAGGGC G 3′(SEQ ID NO38)和它的互补体，引入单一KpnI位点。这些反应产生了质粒pKJS038。质粒pKJS038中包含框架2内的错误，因而使用第三框架2引物对5′CCC TGG TTT CTG TTG ATA CCA GGC AAC GTT AATACC CAC 3′(SEQ ID NO39)及其互补体进行一轮附加的快速突变，导致BclI位点缺失。合成的重构可变轻链(VL#1)标记为pKJS051。
可变轻链版本2最初在模板质粒pAND149上经USE突变，使用框架1引物5’GAT GGA GAC ATT CAG ATG ACC CAG TCT CCT AGC TCC CTGTCC GCC TCA GTA GGA GAC AGG GTC ACC ATC ACC TGC AAG GC 3′(SEQ ID NO40)，加入XmaI位点的框架2引物5′GTA GCC TGG TTC CAACAG AAA CCC GGG AAG GCT CCT AAA TCA C 3′(SEQ ID NO41)，加入XbaI位点的5′框架3引物5′CAG TGG AGT CCC TTC TAG ATT CAGCGG CAG TGG ATC 3′(SEQ ID NO42)，和加入PstI位点的3′框架3引物5′CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAC TTC GCA ACCTAT TTC TGT CAG C 3′(SEQ ID NO43)。得到的质粒标记为pKJS034。质粒pKJS034包含框架3和框架2中不需要的突变。通过连续数轮的快速突变，使用删除了PstI位点的新的3′框架3引物对5′GCT GAC AGA AATAGG TTG CGA AGT CTT CAG GCT GGA GGC TGC TGA TGG 3′(SEQ IDNO44)及其互补体；和删除了XbaI位点的新的5′框架3引物5′GGTACA GTG GAG TCC CTT CCA GAT TCA GCG GCA GTG GAT CTG GG 3′(SEQ ID NO45)及其互补体，质粒pKJS034中的框架3突变被修正。pKJS034中框架2的错误然后被另一轮突变来修正，使用引物对5′GGGTAT TAA TGT AGC CTG GTA TCA ACA GAA ACC AGG GAA GGC TCC3′(SEQ ID NO46)及其互补体，该引物对删除了XmaI位点并加入BclI位点。质粒pKJS034然后经受最后一轮的快速突变，使用引入KpnI位点的框架4引物对5′CCT ATC CAT TCA CGT TCG GCC AGG GTA CCA AGGTGG AGA TCT AAC AAG GGC G 3′(SEQ ID NO47)及其互补体，合成的重构可变轻链(VL#2)质粒标记为pKJS039。
可变轻链版本3最初在模板质粒pAND149上经USE突变，使用框架1引物5′GAT GGA GAC ATT CAG ATG ACC CAG TCT CCT AGC TCCCTG TCC GCC TCA GTA GGA GAC AGG GTC ACC ATC ACC TGC AAGGC 3′(SEQ ID NO48)，引入XmaI位点的框架2引物5′GTA GCC TGGTTC CAA CAG AAA CCC GGG AAG GCT CCT AAA TCA C 3′(SEQ ID NO49)，引入XbaI位点的5′框架3引物5′CAG TGG AGT CCC TTC TAGATT CAG CGG CAG TGG ATC 3′(SEQ ID NO50)，和引入Pst I位点的3′框架3引物5′CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAC TTCGCA ACC TAT TAC TGT CAG CAA TAT G 3′(SEQ ID NO51)，产生pKJS035。质粒pKJS035经单轮快速突变，使用引入新KpnI位点的框架4引物对5′CCT ATC CAT TCA CGT TCG GCC AGG GTA CCA AGGTGG AGA TCT AAC AAG GGC G 3′(SEQ ID NO52)及其互补体。合成的重构可变轻链(VL#3)质粒标记为pKJS040。
人BHA10轻链的表达载体如下制备将含有人昵崃春愣ㄇ睦醋pKJS051，pKJS039或pKJS040的0.453kb NotI-BglII轻链可变区片段和来自质粒pEAG963的0.678kb BclI-NotI片段，亚克隆到pCEP4 EBV表达载体-衍生的质粒pCH274的NotI位点，产生轻链表达载体pKJS048(轻链#1表达载体)，pKJS049(轻链#2表达载体)和pKJS050(轻链#3表达载体)。
实施例4重构人源化BHA10抗体(版本1，2，3和4)的构建与表达将上述各种表达载体配对，列于下述表2，并联合转染到293-EBNA细胞中。版本1的人BHA10含有pKJS44对(重链#1表达载体)和pKJS48(轻链#1表达载体)；版本2的人BHA10含有pKJS45对(重链#2表达载体)和pKJS49(轻链#2的表达载体)；版本3的人BHA10含有pKJS46对(重链#3表达载体)和pKJS50(轻链#3的表达载体)；版本4的人BHA10含有pKJS46对(重链#3的表达载体)和pKJS49(轻链#2表达载体)。所述载体联合转染到293-EBNA细胞中，检测这些转染细胞的抗体分泌和特异性。条件培养基的蛋白质印迹分析(检测抗-人重链和轻链抗体)证明了与嵌合BHA10-转染细胞相比，人BHA10-转染细胞具有相似的合成和有效分泌重链与轻链的水平。来自转染细胞的条件培养基染色的LT-β-R-表达HT-29细胞的FACS分析证明了版本3人BHA10 mAb结合少于与嵌合BHA10相似的版本2人BHA10(图3)。混合和竞争联合转染暗示，这种减少起因于版本3的可变轻链(VL#3)(图2)与版本2的可变轻链的两个框架残基残基36和87的不同。然后，版本4人BHA10通过将pKJS46(重链#3表达载体)和pKJS49(轻链#3表达载体)配对来构建。
用嵌合BHA10和人BHA10版本1-4对293-EBNA细胞的联合转染按比例增加，并收获培养基。在蛋白质A-琼脂糖上纯化抗体，分析纯化的mAbs的活性。结合淋巴毒素-β的受体通过细胞系HT29的蛋白质A-纯化抗体的FACS分析来确定。
实施例5IL-8-A375细胞上的激动作用A375细胞以105/ml涂布于96孔板上，该板含有可溶性抗体或捕获了山羊抗人IgG Fc的抗体(Jackson免疫研究实验室)。培养板过夜培养。以图1显示的指定浓度测定来自用BHA10变异体转染的293-E细胞的蛋白质-A纯化抗体。蛋白质A纯化的hu-CBE11用来作为阳性对照。A375细胞上的IL-8激动作用(agonism)显示于图1。生物活性的排列顺序为嵌合BHA10＝版本4人BHA10＝版本2人BHA10＞版本3人BHA10。因为版本4人BHA10比版本2更加人源化，所以它被选择为产生稳定的CHO细胞系。
实施例6版本4人BHA10的稳定的CHO表达载体的构建人BHA10版本4的EBV表达载体(轻链#2表达载体pKJS049；重链#3表达载体pKJS046)被联合转染到293-EBNA细胞中，检测转染细胞的抗体分泌。条件培养基的蛋白质印迹分析证实转染细胞的合成和有效分泌重链和轻链。EBV载体含有外来的5’和3’UTR和分离免疫球蛋白可变区和恒定区的内含子，稳定的CHO表达载体需要cDNA。因此cDNA由RT-PCR克隆。
来自瞬时联合转染人BHA10表达细胞的全细胞RNA用Qiagen Rneasy小型试剂盒制备，根据厂商推荐的步骤。编码重链和轻链的cDNA从全细胞RNA由RT-PCR克隆，使用Amersham-Pharmacia第一链cDNA合成试剂盒，根据厂商推荐的步骤，利用5’CGG ATC CTC AAC CGG GAG ACA GGGAGA GGC T 3’(SEQ ID NO53)启动重链和5’CGG ATC CCT AAC ACTCTC CCC TGT TGA A 3’(SEQ ID NO54)启动轻链。对于人BHA10免疫球蛋白重链cDNA的PCR扩增，使用的引物是5’GCT AGC GGA TCC ACCATG GAC TGG ACC TGG 3’(SEQ ID NO55)(加入BamHI位点和紧靠起始物甲硫氨酸5’端的ACC，加入Kozak信号)和5’CGG ATC CTC AAC CGGGAG ACA GGG AGA GGC T 3’(SEQ ID NO56)(基因水平上删除了重链C端赖氨酸残基并加入紧靠终止密码子3’端的BamHI位点)。人BHA10免疫球蛋白轻链cDNA的PCR扩增引物是5’CCC TTA GGA TCC ACC ATGGGC TTC AAG ATG GAG 3’(SEQ ID NO57)(加入BamHI位点和紧靠起始甲硫氨酸5’端的ACC，加入Kozak信号)和5’CGG ATC CCT AAC ACT CTCCCC TGT TGA A 3’(SEQ ID NO58)(加入紧靠终止密码字3’端的BamHI位点)。cDNA在95℃经2.5分钟的PCR热启动；用Advantage TaqDNA聚合酶(Clontech)循环10次在94℃变性0.5分钟，55℃退火0.75分钟，68℃延伸1分钟；然后在68℃最终延伸5分钟。第二次扩增使用初反应液中取出的10μl样品和Pfu DNA聚合酶(Stratagene)94℃变性0.5分钟，50℃退火0.75分钟，72℃延伸1分钟，然后在72℃最终延伸10分钟。PCR产物用Qiagen Qiaquick凝胶提取试剂盒进行凝胶纯化，根据厂商推荐的步骤。纯化的PCR产物亚克隆到Invitrogen的pCR4TOPO克隆载体上，根据厂商推荐的步骤。纯化的PCR产物亚克隆到Invitrogen的pCR4TOPO克隆载体上，根据厂商推荐的TOPO克隆步骤。多个单独亚克隆的插入片段被测序。确定为轻链cDNA亚克隆的序列标记为pKJS072。确定为重链cDNA亚克隆的序列标记为pKJS071。
来自pKJS072的726bpBamHI轻链cDNA片段被亚克隆到来自hu5c8轻链表达载体pXLC2的磷酸化的6.19kbBamHI载体片段上，制备含有neo-的人BHA10轻链表达pKJS077(图3)。该质粒含有BHA10的版本4的轻链和新霉素抗性基因。该轻链表达盒含有人CMV立即早期启动子和第一个内含子(包含小的缺失)，以及人生长激素多聚腺苷化序列。
类似的，来自pKJS071的1404bpBamHI重链cDNA片段被亚克隆到磷酸化的BamHI-线性化化pV80上，制备含有dhfr的人BHA10重链载体pKJS078(图5)。该质粒含有BHA10版本4的重链和dhfr基因。重链表达盒包含人CMV立即早期启动子和第一内含子(包含小的缺失)以及人生长激素多聚腺苷化序列。dhfr表达盒含有SV40早期启动子和SV40多聚腺苷化序列。
表达载体被联合转染到COS细胞中，检测转染细胞的抗体分泌和特异性(空载体或M92载体作为阴性对照)。条件培养基的蛋白质印迹分析(随着抗人-重链和轻链抗体显色)证明了转染细胞合成并有效分泌重链和轻链，在FACS分析中，来自人BHA10转染细胞的条件培养基特异性染色了表达LT-β-R的HT-29细胞。
实施例7表达版本4人BHA10的CHO细胞系表达版本4人BHA10的质粒pKJS077和pKJS078被转染到CHO细胞中。
实施例8抗体亲和力测定用含有5mM EDTA的PBS处理30分钟以获得HT29细胞，然后剧烈搅动。细胞被分布到圆底96孔板内，以2.5×105细胞/孔的密度。按照指定的稀释度将BHA10变异体转染的293-E细胞上清液加到孔中，总体积为100μl，4℃培养1小时。用FACS缓冲液(含有5％FBS的PBS)清洗孔两次，用1∶100稀释度的PE-结合抗人重链和轻链抗体(Jackson免疫研究实验室)培养1小时。然后用FACS缓冲液清洗细胞3次，并重悬于100μl含有1.0％多聚甲醛的PBS中。然后转移样品到FACS中便于分析。以图2显示的指示浓度，测定来自BHA10变异体转染的293-E细胞的蛋白质A纯化抗体。分别用蛋白质A-纯化的CBE11和5C8(抗CD40L抗体)的研究曲线作为阳性和阴性对照。结合亲和力的排列顺序为嵌合BHA10＝版本4人BHA10＝版本2人BHA10＞版本3人BHA10。
实施例9WiDr细胞的细胞毒性用WiDr结肠癌细胞检测细胞毒性，利用抗人IgG Fc包被孔上的可溶抗-LT-β-R抗体证明本发明的抗-LT-β-R抗体增加了对癌细胞的细胞毒性。WiDr细胞以6×104/ml的浓度与80单位/ml的huIFN-γ置于96孔板中，板中含有包被所述的可溶性抗体或包被有捕获山羊抗人IgG Fc(Jackson免疫研究实验室)。培养该板5天。加入MTT 4小时，用10mM的HCl溶液中的10％的SDS过夜培养溶解得到的沉淀物，微量板读出器中读出OD值。
实施例10人BHA10预处理减慢WiDr肿瘤的生长向6周大的裸鼠腹膜内注射100ug的抗-LFA3抗体(1E6)，100ug的抗-LT-β-R抗体(即重构人BHA10)或不注射(对照)。然后向这些动物皮下注射1×106的WiDr结肠癌细胞。重构人BHA10处理后的鼠每周用100ug抗体再处理，mBHA动物仅在第14天再处理。每周测量肿瘤大小和计算出肿瘤的体积。当动物的肿瘤达到2.0cm3(直径16mm)时，处死动物，它们的死亡记录到存活图表中。用重构人BHA10预处理期望可减慢裸鼠WiDr肿瘤的生长。
实施例11减慢预先种植的WiDr肿瘤的生长并增加长有WiDr肿瘤的裸鼠的存活率106的WiDr细胞在裸鼠皮下预先预先种植10天。每周向鼠体内皮下注射PBS或重构人BHA10，或隔周注射mBHA10。从测量的宽度和长度计算肿瘤重量，处死肿瘤大小超过2000mg的动物，在处死时的肿瘤重量进行统计学的平均计算。肿瘤重量使用以下公式计算(宽度卓矶茸长度)/2＝肿瘤重量(mg)。本发明重构人BHA10抗体可减慢体内预先生长的(pre-grown)肿瘤的生长。另外，使肿瘤生长并按上述处理后，测量动物的存活百分数。本发明的重构人BHA10抗体可诱导延长鼠体内预先种植的肿瘤的存活率。
序列表<110>比奥根艾迪克MA公司(Biogen，Idec MA Inc.)<120>人源化抗淋巴毒素β受体的抗体<130>BINA156PC<150>60/392993<151>2002-07-01<150>60/417372<151>2002-10-09<160>62<170>FastSEQ for Windows Version4.0<210>1<211>107<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>1Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn20 25 30Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe85 90 95Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>2<211>116<212>PRT<213>小鼠<400>2Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30Tyr Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val100 105 110Thr Val Ser Ser115<210>3
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<220>
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<223>人工合成的人源化的BHA10可变轻链，版本3<400>8Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn20 25 30Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>9<211>348<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工合成的人源化的BHA10可变重链，版本1
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<223>人工合成的人源化的BHA10可变轻链，版本4<400>15Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn20 25 30Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180 185 190Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205Phe Asn Arg Gly Glu Cys210<210>16<211>445<212>PRT<213>人工序列<220>
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165 170 175Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu180 185 190Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr195 200 205Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr210 215 220Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe225 230 235 240Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro245 250 255Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val260 265 270Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr275 280 285Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val290 295 300Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys305 310 315 320Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser325 330 335Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro340 345 350Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val355 360 365Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly370 375 380Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp385 390 395 400Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp405 410 415Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His420 425 430Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly435 440 445<210>17<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物<221>misc_feature<222>5，15<223>S＝Cys或Gly<221>misc_feature<222>6<223>M＝Ala或Cys<221>misc_feature<222>8<223>R＝Ala或Gly
<221>misc_feature<222>20<223>W＝Ala或Thr<400>18aggtsmarct gcagsagtcw gg 22<210>19<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<221>misc_feature<222>35<223>K＝Gly或Thr<221>misc_feature<222>17，35<223>W＝Ala或Thr<221>misc_feature<222>36，37<223>Y＝Cys或Thr<400>19actagtcgac atgggcwtca agatggagtc acakwyycwg g 41<210>20<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>20gttagatctc cagcttggtc cc 22<210>21<211>10<212>PRT<213>小鼠<400>21Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe1 5 10<210>22<211>16<212>PRT<213>小鼠<400>22Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15<210>23<211>9<212>PRT<213>小鼠
<400>23Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro1 5<210>24<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>24gcactgggtg aggcaggccc ctggacaggg acttg35<210>25<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>25cccaggtcca actggtgcag tctggagctg agg 33<210>26<211>112<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>26gaagttcaag ggcagggcca cactgacagc agacaaatcc accagcacag cctacatgga 60gctcagcagc ctgaggtctg aagatactgc ggtctatttc tgtgcaagat cc 112<210>27<211>71<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>27caggtccaac tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtg 60tcctgcaagg c 71<210>28<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>28gcactgggtg aggcaggccc ctggacaggg acttg35<210>29<211>112<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>29gaagttcaag ggcagggcca caatcactgc agacaaatcc accagcacag cctacatgga 60gctcagcagc ctgaggtctg aagatactgc ggtctattac tgtgcaagat cc 112<210>30<211>71<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>30caggtccaac tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtg 60tcctgcaagg c 71<210>31<211>112<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>31gaagttcaag ggcagggtca caatcactgc agacaaatcc accagcacag cctacatgga 60gctcagcagc ctgaggtctg aagatactgc ggtctattac tgtgcaagat cc 112<210>32<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>32ggcccctgga cagggacttg agtggatggg atggatttat cctgg 45<210>33<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>33gatggagaca ttcagatgac ccagtctcct agctccctgt ccgcctcagt aggagacagg 60gtcaccatca cctgcaaggc 80<210>34<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>34gtagcctggt tccaacagaa acccgggaag gctcctaaat cac 43<210>35<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>35cagtggagtc ccttctagat tcacaggcag 30<210>36<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>36ctcaccatca gcagcctgca gcctgaagac ttcgcaacct atttctgtca gc 52<210>37<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>37gggtattaat gtagcctggt atcaacagaa accagggaag gctcc 45<210>38<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>38cctatccatt cacgttcggc cagggtacca aggtggagat ctaacaaggg cg 52<210>39<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>39ccctggtttc tgttgatacc aggcaacgtt aatacccac 39<210>40<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>40gatggagaca ttcagatgac ccagtctcct agctccctgt ccgcctcagt aggagacagg 60gtcaccatca cctgcaaggc 80<210>41<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>41gtagcctgg ttccaacagaa acccgggaag gctcctaaat cac 43<210>42<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>42cagtggagtc ccttctagat tcagcggcag tggatc 36<210>43<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>43ctcaccatca gcagcctgca gcctgaagac ttcgcaacct atttctgtca gc 52<210>44<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>44gctgacagaa ataggttgcg aagtcttcag gctggaggct gctgatgg 48<210>45<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>45ggtacagtgg agtcccttcc agattcagcg gcagtggatc tggg 44<210>46<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>46gggtattaat gtagcctggt atcaacagaa accagggaag gctcc 45<210>47<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>47cctatccatt cacgttcggc cagggtacca aggtggagat ctaacaaggg cg 52<210>48<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>48gatggagaca ttcagatgac ccagtctcct agctccctgt ccgcctcagt aggagacagg 60gtcaccatca cctgcaaggc 80<210>49<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>49gtagcctggt tccaacagaa acccgggaag gctcctaaat cac 43<210>50<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>50cagtggagtc ccttctagat tcagcggcag tggatc 36<210>51<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>51ctcaccatca gcagcctgca gcctgaagac ttcgcaacct attactgtca gcaatatg 58<210>52<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>52cctatccatt cacgttcggc cagggtacca aggtggagat ctaacaaggg cg 52<210>53<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>53
cggatcctca accgggagac agggagaggc t 31<210>54<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>54cggatcccta acactctccc ctgttgaa 28<210>55<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>55gctagcggat ccaccatgga ctggacctgg 30<210>56<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>56cggatcctca accgggagac agggagaggc t 31<210>57<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>57cccttaggat ccaccatggg cttcaagatg gag 33<210>58<211>28<212>DNA<213>小鼠<220>
<223>引物<400>58cggatcccta acactctccc ctgttgaa 28<210>59<211>717<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化的BHA10，轻链，版本2<221>CDS<222>(1)...(716)<400>59
atg ggc ttc aag atg gag tca cag tct ctg gtc ttt gta tac atg ttg48Met Gly Phe Lys Met Glu Ser Gln Ser Leu Val Phe Val Tyr Met Leu1 5 10 15ctg tgg ttg tct ggt gtt gat gga gac att cag atg acc cag tct cct96Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro20 25 30agc tcc ctg tcc gcc tca gta gga gac agg gtc acc atc acc tgc aag144Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys35 40 45gcc agt cag aat gtg ggt att aat gta gcc tgg tat caa cag aaa cca192Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro50 55 60ggg aag gct cct aaa tca ctg att tcc tcg gcc tcc tac cgg tac agt240Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser65 70 75 80gga gtc cct tcc aga ttc agc ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act288Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95ctc acc atc agc agc ctc cag cct gaa gac ttc gca acc tat ttc tgt336Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys100 105 110cag caa tat gac acc tat cca ttc acg ttc ggc cag ggt acc aag gtg384Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val115 120 125gag atc aaa cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca432Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro130 135 140tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg480Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu145 150 155 160aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac528Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn165 170 175gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc576Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser180 185 190aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca624Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala195 200 205gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc672Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly210 215 220ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag717Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235<210>60<211>238<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化BHA10，轻链，版本2<400>60Met Gly Phe Lys Met Glu Ser Gln Ser Leu Val Phe Val Tyr Met Leu1 5 10 15Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro20 25 30Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys35 40 45Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro50 55 60Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser65 70 75 80Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys100 105 110Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val115 120 125Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro130 135 140Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu145 150 155 160Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn165 170 175Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser180 185 190Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala195 200 205Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly210 215 220Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235<210>61<211>1392<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化BHA10，重链，版本3<221>CDS<222>(1)...(1392)<400>61atg gac tgg acc tgg agg gtc ttc tgc ttg ctg gct gta gca cca ggt 48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly1 5 10 15gcc cac tcc cag gtc caa ctg gtg cag tct gga gct gag gtg aag aag 96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30cct ggg tcc tca gtg aag gtg tcc tgc aag gct tct ggc tac act ttc 144Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45aca acc tac tat ttg cac tgg gtg agg cag gcc cct gga cag gga ctt 192Thr Thr Tyr Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60gag tgg atg gga tgg att tat cct gga aat gtt cat gct cag tac aat 240Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn65 70 75 80gag aag ttc aag ggc agg gtc aca atc act gca gac aaa tcc acc agc 288
Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser85 90 95aca gcc tac atg gag ctc agc agc ctg agg tct gaa gat act gcg gtc336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110tat tac tgt gca aga tcc tgg gaa ggt ttt cct tac tgg ggc caa ggg384Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly115 120 125acc acg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc432Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lvs Gly Pro Ser Val Phe130 135 140ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg480Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu145 150 155 160ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg528Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp165 170 175aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta576Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu180 185 190cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc624Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser195 200 205agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc672Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro210 215 220agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aag720Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys225 230 235 240act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg768Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro245 250 255tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc816Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser260 265 270cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac864Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp275 280 285cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat912Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn290 295 300gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg960Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val305 310 315 320gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag1008Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu325 330 335tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa1056Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys340 345 350
acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc 1104Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr355 360 365ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc 1152Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr370 375 380tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag 1200Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu385 390 395 400agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ttg 1248Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu405 410 415gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag 1296Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys420 425 430agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag 1344Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu435 440 445gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccc ggt 1392Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly450 455 460<210>62<211>464<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化BHA10，重链，版本3<400>62Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly1 5 10 15Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Thr Tyr Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn65 70 75 80Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly115 120 125Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe130 135 140Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu145 150 155 160Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp165 170 175Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu180 185 190Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser195 200 205Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro210 215 220
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys225 230 235 240Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro245 250 255Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser260 265 270Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp275 280 285Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn290 295 300Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val305 310 315 320Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu325 330 335Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys340 345 350Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr355 360 365Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr370 375 380Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu385 390 395 400Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu405 410 415Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys420 425 430Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu435 440 445Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly450 455 460
权利要求
1.一种人源化抗-淋巴毒素-β受体(LT-β-R)抗体，其轻链互补决定区由SEQ ID NO1中的24至34，50至56和89至97位的氨基酸残基限定，其重链互补决定区由SEQ ID NO2中的31至35，50至65和95至102位的氨基酸残基限定，所述抗体至少包括轻链的一个以下残基Y36，S49，T63和F87；或重链的至少一个以下残基Y27，T30，I48，A67，L69和F91(常规Kabat编号)。
2.一种抗体，其结合与权利要求1所述人源化抗体相同的淋巴毒素-β受体表位。
3.一种人源化抗-淋巴毒素-β受体(LT-β-R)抗体，所述抗体的轻链互补决定区由SEQ ID NO1中的24至34，50至56和89至97位的氨基酸残基限定，所述抗体的重链互补决定区由SEQ ID NO2中的31至35，50至65和95至102位的氨基酸残基限定，该抗体的轻链包括残基Y36，S49和F87(常规Kabat编号)。
4.一种人源化抗-淋巴毒素-β受体(LT-β-R)抗体，所述抗体的轻链互补决定区由SEQ ID NO1中的24至34，50至56和89至97位的氨基酸残基限定，所述抗体的重链互补决定区由SEQ ID NO2中的31至35，50至65和95至102位的氨基酸残基限定，该抗体的重链包括残基Y27和T30(常规Kabat编号)。
5.权利要求1所述抗体，所述抗体包括由SEQ ID NO6的氨基酸残基1至107限定的轻链可变区序列。
6.权利要求1所述抗体，所述抗体包括由SEQ ID NO14的氨基酸残基1至113限定的重链可变区序列。
7.权利要求5所述抗体，所述抗体进一步包括由SEQ ID NO14的氨基酸残基1至113限定的重链可变区序列。
8.权利要求1所述抗体，所述抗体包括由SEQ ID NO15的氨基酸残基1至214限定的轻链区序列。
9.权利要求1所述抗体，所述抗体包括由SEQ ID NO16的氨基酸残基1至442限定的重链区序列。
10.权利要求1所述抗体，所述抗体包括由SEQ ID NO15的氨基酸残基1至214限定的轻链区序列，和由SEQ ID NO16的氨基酸残基1至442限定的重链区序列。
11.一种抗体，其包含与细胞系克隆3D9(ATCC专利保藏号PTA-4726，保藏于2002年9月27日)产生的抗体相同的重链和轻链多肽序列。
12.一种产生权利要求1-11中任一所述抗体的细胞。
13.权利要求1-11中任一项所述的抗体，所述抗体基本上保留了亲本抗体的结合特性。
14.权利要求1至11中任一项所述抗体，所述抗体进一步与一种细胞毒部分连接。
15.权利要求1-11中任一项所述的抗体，所述抗体进一步与一种化疗药连接。
16.一种包含权利要求1-11中任一项所述抗体和一种药学可接受载体的组合物。
17.一种治疗或减轻人体内瘤形成的进展、严重性或影响的方法，包括向所述人体内施用权利要求16所述组合物。
18.一种减少人体内肿瘤体积的方法，包括向所述人施用权利要求16所述组合物。
19.一种分离的核苷酸，包括由细胞系克隆3D9(ATCC专利保藏号PTA-4726，保藏于2002年月27日)产生的抗体的轻链的编码序列。
20.一种分离的核苷酸，包括由细胞系克隆3D9(ATCC专利保藏号PTA-4726，保藏于2002年9月27日)产生的抗体的重链的编码序列。
21.一种分离的核苷酸，包括SEQ ID NO5的残基1至107的编码序列。
22.一种分离的核苷酸，包括SEQ ID NO13的残基1至113的编码序列。
23.一种包括权利要求21所述核苷酸的表达载体。
24.一种包括权利要求22所述核苷酸的表达载体。
25.一种包括权利要求23或24之一所述表达载体的细胞。
26.细胞系克隆3D9(2002年9月27日保藏于ATCC，专利保藏号PTA-4726)的细胞。
27.一种前述任一权利要求所述的抗体，所述抗体是一种抗原结合片段。
28.权利要求27所述抗体，所述片段选自Fab片段、Fab’片段、F(ab)2片段或Fv片段。
29.前述任一权利要求所述抗体或抗原结合片段，所述抗体与聚乙二醇或清蛋白偶联。
30.前述任一权利要求所述抗体或抗原结合片段，所述抗体的恒定区域被修饰，使得相对于未修饰抗体至少一项恒定区-介导的生物效应子功能减弱。
31.前述任一权利要求所述抗体或抗原结合片段，包括具有改变了的效应子功能的Fc区域。
32.一种由3D9(ATCC保藏号PTA-4726)组成的杂交瘤细胞。
33.权利要求32所述的杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞产生人源化抗体，或它们的抗原结合部分。
34.一种轻链，包括来自SEQ ID NO1的互补决定区(CDR)和可变区框架氨基酸残基Y36，S49和F87(Kabat编号系统)，该轻链的剩余部分来自人抗体。
35.一种重链，包括来自SEQ ID NO2的互补决定区(CDR)和可变区框架残基Y27和T30(Kabat编号系统)，该重链的剩余部分来自人抗体。
36.一种包括权利要求34所述轻链和权利要求35所述重链，或所述抗体的结合抗原片段的人源化抗体。
37.权利要求36所述抗体，该抗体与淋巴毒素-β受体(LT-β-R)结合。
38.一种人源化抗体，包括来自SEQ ID NO1所示BHA10可变轻链序列的CDR。
39.一种人源化抗体，包括来自SEQ ID NO2所示BHA10可变重链序列的CDR。
40.一种与LT-β-R特异性结合的人源化抗体或它们的抗原结合片段，包括可变区，该可变区包括与来自小鼠BHA10抗体CDR相应的CDR。
41.权利要求40所述的片段，该片段是Fab片段。
42.一种治疗或减轻患者癌症的方法，包括向患者施用有效量的前述任一权利要求所述人源化抗体。
43.一种治疗或减轻患者实体瘤的方法，包括向患者施用有效量的前述任一权利要求所述的人源化抗体。
44.权利要求43所述的方法，所述实体瘤选自非小细胞肺癌(NSCLC)，结肠癌(CRC)，乳腺癌，前列腺癌，胃癌，皮肤癌，胃癌，食道癌和膀胱癌构成的组。
全文摘要
本发明涉及对淋巴毒素β受体(LT－β－R)特异的人源化抗体，产生这些抗体的细胞系，由抗体制得的免疫化学制剂和使用该抗体的诊断方法。本发明也涉及在治疗方法中单独或联合化学治疗剂使用该抗体。
文档编号A61P35/00GK1678625SQ03820721
公开日2005年10月5日 申请日期2003年7月1日 优先权日2002年7月1日
发明者埃伦·加伯, 肯尼思·西蒙, 乔斯·萨尔达纳 申请人:比奥根艾迪克Ma公司