专利名称：带有接头序列的受体导向性嵌合毒素的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过接头序列连接的，由毒素分子和导向分子组成的嵌合蛋白质。更具体地说，本发明涉及借助一个简单的5～15肽接头序列连接的，由作为细胞毒性剂部分的白喉毒素和作为导向部分的表皮生长因子组成的嵌合毒素，其制备方法及其作为肿瘤治疗剂的应用。
传统的肿瘤化学治疗方法取决于药物杀伤病人体内肿瘤细胞的能力。然而，大多数抗肿瘤化学药物在杀伤肿瘤细胞的同时，还将杀伤正常细胞。抗肿瘤药物对肿瘤细胞而不是正常细胞的杀伤能力，代表了某些抗肿瘤药物对肿瘤细胞的选择性程度。提高抗肿瘤药物之肿瘤细胞特异性选择性的一种方法是优先向肿瘤细胞递送药物。选择性地向特定细胞群体递送化学治疗剂即所谓“导向”。可借助几种方法将药物导向肿瘤细胞。其中方法之一是依赖存在于肿瘤细胞表面上的特异性受体分子。被称为“导向剂”的分子可以识别这些细胞表面受体并与之特异性结合。所说的“导向剂”可包括抗体、生长因子或激素。识别特异性细胞表面受体的“导向剂”可将细胞毒性分子导向具有这些表面受体的细胞。例如，许多肿瘤细胞表面都有表皮生长因子受体(EGFR)蛋白质的过度表达。表皮生长因子(EGF)和转化生长因子-α(TGF-α)均可识别肿瘤细胞上的EGFR并与之结合。因此，EGF和TGF-α即是这些肿瘤细胞的“导向剂”。
可以与“导向剂”连接并与之形成杂合分子的另一个部分是细胞毒素或细胞毒性剂。用于构建杂合分子的最强有力的细胞毒性剂是抑制哺乳动物蛋白质合成的细菌毒素。目前研究较多且认识较为深入的细胞毒性剂是假单胞菌外毒素A(PE40、PE38和PE66)。现有技术中已公开了许多基于假单胞菌外毒素A和其他细菌或植物毒素以及激素分子的嵌合蛋白质。例如，美国专利4,545,885号公开了可用于杀伤人肿瘤细胞的假单胞菌外毒素A与抗体或表皮生长因子形成的结合物。美国专利4,664,382号述及，可将抗体与蓖麻毒素的A链或B链偶联，用于杀伤肿瘤细胞。美国专利4,675,383号描述了将某些激素(如黑色素细胞刺激素，MSH)与白喉毒素(DT)蛋白直接连接，可将所得到的杂合蛋白质用于结合并杀伤表面存在有这些激素(如MSH)的细胞。
可见，嵌合细胞毒素是一类可识别并特异性地杀伤表面有特异性受体表达之细胞的定向作用分子。以DNA重组技术和基因融合技术设计并构建的这些杂合分子包括了分别将毒素导向细胞，并进而杀伤细胞的导向部分和杀伤细胞的毒素部分。
随着对抗肿瘤导向药物的研究和认识的不断深入，人们发现，为了提高嵌合毒素的细胞杀伤活性，在加大用药剂量的同时往往会导致抗体生成和血管渗漏等毒副作用，从而限制了嵌合毒素的临床应用。在有关导向性嵌合毒素的分子作用机理的研究中还发现，改善嵌合分子的不适当折迭，进而提高嵌合分子中导向部分的受体结合能力和稳定性，并促进毒素部分的细胞内在化，是克服上述问题的重要手段之一。
为此，有人首先利用小鼠白介素3(mIL-3)作为导向部分与白喉毒素结合，并在两个部分之间插入一个短肽接头序列Gly4Ser，得到融合蛋白质DAB389-Gly4Ser-mIL-3。体外和体内实验结果显示，与不带接头序列Gly4Ser的融合蛋白DAB389-mIL-3相比，前者对肿瘤细胞的特异性细胞毒作用提高约5～10倍(参见Domunique.et al.，FEBS Letters 406157～161，1997)。我们以前提交的99121905.8号中国专利申请中也曾述及可在由EGF和PE分子构成的嵌合毒素蛋白质的导向和毒素部分之间插入一个由10～30个氨基酸组成的“接头序列”或间隔臂。并且所说的接头序列较好是由5～10个主链不超过4个碳原子并且不带有苯环侧链的中性氨基酸的(如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸)2～3次串联重复序列组成的。最近，也报导了一种基于接头序列的，由假单胞菌外毒素(PE)和促性腺激素释放素(GnRH)组成的嵌合蛋白(L-GnRH-PE66或L-GnRH-PE40)。体外和体内试验结果表明，L-GnRH-PE对多种肿瘤细胞系具有细胞毒活性和肿瘤生长抑制活性，并且活性显著高于不带有多接头的GnRH-PE。因此，研究者认为L-GnRH-PE很有希望成为一种强有力的肿瘤治疗药物(参见AhmiBen-Yehudah et al，Medical Oncology 1638-45，1999)。
本发明人在多年来长期研究基于白喉毒素的抗肿瘤导向药物的基础上，成功地构建了在毒素部分—白喉毒素分子和导向部分—表皮生长因子分子之间插入了(Gly4Ser)接头序列的嵌合蛋白质，并初步证实了其明显改善的体外和体内抗肿瘤生物学活性，从而完成了本发明。
本发明的一个目的是提供由毒素部分和导向部分组成的，并且在两者之间插入了适当接头序列的嵌合蛋白质，特征在于所说的毒素部分是白喉毒素分子，导向部分是表皮生长因子分子，且接头序列是(Gly4Ser)n。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的白喉毒素部分是由包括成熟白喉毒素催化和跨膜区的386个氨基酸及484-486位三个氨基酸组成的DAB389。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的表皮生长因子部分是成熟表皮生长因子的氨基酸1～53。
根据本发明的一个优选实施方案，其中接头序列是(Gly4Ser)1-3。
根据本发明的一个优选实施方案，其中接头序列是(Gly4Ser)2。
本发明的另一个目的是提供生产如上限定的嵌合蛋白质的方法，该方法包括(1)提供携带DAB389-L-EGF之DNA编码序列的重组表达载体；(2)用步骤(1)的重组载体转化适当的宿主细胞；(3)在适于表达DAB389-L-EGF嵌合蛋白质的条件下培养步骤(2)的被转化的宿主细胞；(4)收获并纯化所产生的嵌合蛋白质。
本发明的再一个目的是提供含有如上限定的嵌合蛋白质及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
本发明的再一个目的是提供如上限定的嵌合蛋白质在生产抗肿瘤药物中的应用。
图1显示用于表达DAB389-L-EGF嵌合蛋白质的重组表达质粒pET-28a-DLE的构建。
图2显示DAB389-Gly4Ser2和EGF的DNA编码序列之PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。其中泳道A是EGF基因的PCR扩增产物；泳道B是DAB389-Gly4Ser2的PCR扩增产物；泳道C是DNA分子量标志物。
图3显示本发明制备的DAB389-L-EGF的SDS-PAGE图谱。其中泳道A是蛋白质分子量标志物；泳道B、C、D是DAB389-L-EGF嵌合蛋白。
图4显示以[3H]-亮氨酸掺入法检测的不同浓度的带有或不带有接头序列的DT-EGF嵌合蛋白对细胞(HepG-2人肝癌细胞系)蛋白质合成的影响。其中○代表DAB389-L-EGF治疗组；●代表DAB389-EGF治疗组；■代表磷酸盐缓冲盐水(PBS)阴性对照组。结果以占未接触嵌合蛋白之对照组细胞的百分蛋白合成表示。
图5显示嵌合毒素对裸鼠(Balb/c)移植瘤(Hct-8人结肠癌)平均肿瘤大小的影响。其中○代表DAB389-L-EGF；●代表DAB389-EGF阳性对照；■代表PBS阴性对照。
本发明涉及由毒素分子和导向分子组成的，并且在两者之间插入了一个短肽接头序列的嵌合蛋白质。具体地说，本发明涉及通过一个简单的5～15肽接头序列连接的，由作为细胞毒性剂部分的白喉毒素和作为分子导向部分的表皮生长因子组成的嵌合蛋白质、其制备方法及其作为抗肿瘤剂的应用。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的嵌合蛋白质的细胞毒性剂部分是由包括成熟的白喉毒素的催化和跨膜区的前386个氨基酸及484-486位3个氨基酸组成的(即DAB389)，并且导向部分是由成熟表皮生长因子的氨基酸1～53组成的。
如众所周知，白喉毒素是含有535个氨基酸的，对敏感真核细胞具有强毒性的单链多肽。白喉毒素完整分子包括A和B两个片段。毒素分子首先借助525位上的丝氨酸与细胞表面受体结合，然后经受体介导的内吞作用通过酸性细胞腔隙，向胞液内释放出具有酶促活性的A片段(Moya，M.et al.，J.Cell Biol.101548～559，1985；Sandvig，K.et al.，J.Biol.Chem.26111639～11645，1986)。A片段催化延长因子2(EF-2)的NAD+依赖性ADP核糖基化，导致细胞蛋白质合成抑制和细胞死亡。白喉毒素B片段带有真核细胞受体结合区以及有利于穿过胞浆膜递送A片段的序列，所以可用各种多肽类激素(如MSH或GnRH)和生长因子(如EGF)取代天然白喉毒素的受体结合区，以产生对携带特异性受体分子的真核细胞具有选择性细胞毒作用的融合毒素(Murphy.J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838258～8262，1986)。
自20世纪60年代，一些实验室就试图将白喉毒素用于肿瘤的治疗。例如，Willams，D.P.等人首先构建了以DAB486作为毒素部分并以白介素2(IL-2)作为导向部分的重组毒素。继后，其他一些研究小组相继制备了基于白喉毒素并利用IL-3、IL-4、IL-6、EGF和TGFα等作为导向剂的融合毒素。特别是近年来在对融合毒素的进一步深入研究中，Domunique等人(FEBS Letters 406157～161，1997)首先利用小鼠IL-3(mIL-3)与白喉毒素DAB389融合，并在导向和毒素部分之间插入接头序列Gly4Ser，成功地制备了较原型DAB389-mIL-3有更强细胞毒活性的DAB389-Gly4Ser-mIL-3融合蛋白质，从而为改善融合毒素的特异生物学活性，减少有效使用剂量提供了一个新的途径。
表皮生长因子(EGF)是由53个氨基酸组成的，可在与表皮和间原质来源的细胞上表达的特异性受体相互作用后，刺激细胞增殖的单链多肽(Carperter，G.Annu Rev Biochem.48193～216，1979)。EGF受体(EGFR)是一种由细胞外配体结合区、跨膜区和具有内在蛋白质酪氨酸激酶活性的内部区域组成的糖蛋白。一些研究结果表明，EGFR可能在恶性疾病的诱发和维持中发挥作用。许多肿瘤组织中都可见有恶性细胞表面EGFR的过度表达。例如，与周围正常组织相比，肿瘤细胞的EGFR可增加达500倍。这些及其他一些研究提示，可使用针对EGFR的细胞毒性剂作为一种有效的肿瘤治疗剂，用于治疗以细胞表面EGFR表达增加为特征的多种肿瘤。
为了确保嵌合毒素分子中导向部分与其细胞表面受体的结合几率和结合稳定性，考虑到嵌合蛋白质分子β片层的适当折迭，在以前长期从事基于白喉毒素的嵌合蛋白质研究的基础上，在白喉毒素分子和EGF分子之间插入了一个与单链抗体(scFv)中所使用的多接头基本上相同的接头序列，成功地构建并制备了本发明的DAB389-L-EGF嵌合蛋白质—其中L代表接头序列(Gly4Ser)n，n是1～3，且最好是2。我们的体外和体内实验结果有力地表明，本发明的DAB389-L-EGF嵌合蛋白质较不带有(Gys4Ser)2接头序列的原型嵌合蛋白(DAB389-EGF)显著地改善了分子内折迭和细胞表面受体结合能力，以及毒素分子的细胞内在化能力，从而大大提高了嵌合毒素的靶细胞特异性细胞毒活性。
为了完成本发明，可以使用本领域技术人员已知的基因融合技术或化学合成与偶联技术制备本发明的嵌合毒素蛋白质，但最好是使用基因融合技术。为此，可按照已知的DNA重组技术(如参见Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)完成各种DNA操作。例如，首先可将侧翼带有适当的酶切位点的，由(Gly4Ser)1-3编码序列组成的15～45bp合成的寡核苷酸插入到已用同样酶切割的，携带DAB389-EGF的质粒中，从而得到携带DAB389-L编码序列的重组质粒。或者，可使用适当的合成的寡核苷酸引物，以RT-PCR方法从已知携带全长度白喉毒素基因的质粒扩增得到DAB389-(Gly4Ser)n片段(其中n是1～3，最好是2)。然后将此末端带有适当酶切位点的片段连接到已用同样核酸内切酶切割的质粒上，并在适当的宿主细胞中扩增之。同时，使用适当的寡核苷酸引物，从含有EGF基因的质粒载体中扩增得到编码EGF的DNA片段，并将其连接到上述含有DAB389-(Gly4Ser)n编码序列的载体上，得到所需的用于表达本发明的DAB389-L-EGF的重组质粒载体—其中L代表(Gly4Ser)n，n代表1～3，并且最好是2。可使用核酸内切酶消化法和DNA序列分析法鉴定所得到的质粒DNA序列的正确性。然后用此重组表达载体转化适当的宿主细胞如大肠杆菌细胞，并在适当的条件下培养被转化的细胞，以产生所需的嵌合蛋白质。
可使用盐析、超滤、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法从细胞的溶胞产物及培养基中分离并纯化所需的蛋白质表达产物。在产物的分离和纯化过程步骤中，可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和酶联免疫吸附法(ELISA)或Western印迹法监测产物的存在及其分子大小。
可使用文献中已公开的各种检测方法鉴定本发明的DAB389-L-EGF嵌合蛋白质的性质及生物学活性。这些方法包括(1)ADP糖基化试验，该方法是根据DAB389-L-EGF或DAB389-EGF催化延伸因子2(EF-2)的ADP核糖基化的能力检测其对哺乳动物细胞蛋白质合成的抑制作用；(2)受体结合试验，该方法是根据DAB389-L-EGF或DAB389-EGF竞争性置换与A431细胞浆膜结合之125I-EGF的能力检测其特异性受体结合活性；(3)MTT细胞存活率试验，该方法是根据活细胞将MTT转化成兰紫色甲瓒结晶体的能力检测肿瘤靶细胞与DAB389-L-EGF或DAB389-EGF接触后的存活性；(4)细胞蛋白质合成抑制试验，该方法是根据活的肿瘤靶细胞在蛋白质合成过程中摄入[3H]-亮氨酸的能力检测DAB389-L-EGF或DAB389-EGF抑制细胞蛋白质合成的细胞毒活性；(5)裸鼠移植瘤生长抑制试验，该方法是根据DAB389-L-EGF或DAB389-EGF对Balb/c小鼠移植瘤生长的抑制能力检测其对肿瘤靶细胞的杀伤活性。
本发明进一步涉及含有上述嵌合毒素和至少一种医药上可接受的惰性载体或赋形剂的药物组合物。可按照制药工业领域已知的基本原则和方法制备适于胃肠道外途径给药的药物组合物(如参见Remington’s Pharmaceutical Science，15th ed.，Mack Publishing Company，1980)。可通过各种给药途径，特别是静脉内、肌肉内、关节内、腹腔内、鼻内、皮内、皮下等胃肠道外途径投用本发明的药物组合物。
可使用本发明的嵌合毒素或含有该嵌合毒素蛋白质的药物组合物作为治疗剂，用于治疗可依赖该蛋白质的毒性作用得以缓解或消除的特定类型人体细胞的各种疾病。一种优选的用途是用于治疗其表面上过度表达EGFR之细胞的恶性增生性疾病，特别是各种组织来源的腺癌和鳞状细胞癌。本发明的嵌合毒素或含有该嵌合毒素的药物组合物的治疗有效剂量一般应根据疾病的性质、严重程度、病人的一般状况及其对药物的敏感性，以及给药途径等因素由临床医生按照个体化原则来确定。
下列实施例旨在进一步举例阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。
实施例1重组质粒pET-28a-DLE的构建本实施例举例描述用于表达本发明DAB389-L-EGF嵌合毒素的重组表达质粒pET-28a-DLE的构建策略和基本方法。
首先，使用适当的引物以RT-PCR方法从白喉杆菌总DNA扩增得到白喉毒素全基因，并将其克隆到质粒载体pGEM-T(Novagen)中。然后，使用合成的寡核苷酸引物A5’-CATGCCATGG GCGCTGATGA TGTTGTT-3’(SEQ IDNO1)和B5’-CGGGATCCAC CTCCGCCTGA ACCGCCTCCA CCCGCATGCGTTTTATGCCC CGGAGA-3’(SEQ ID NO2)，以PCR方法扩增得到编码DAB389-(Gly4Ser)2的DNA片段。用核酸内切酶NcoI和BamHI消化后回收所需的DNA片段，并在T4 DNA连接酶存在下，将此片段连接到已用同样内切酶消化的pET-28a质粒(Novagen)中。用所得到的连接混合物转化感受态大肠杆菌JM105细胞，以大量制备质粒DNA。然后再使用合成的寡核苷酸引物C5’-CGGGATCCAA CTCCGACTCC GAATGTC-3’(SEQ ID NO3)和D5’-CGGAATTCTT ATCTCAATTC CCACCACTTC-3’(SEQ ID NO4)，从含有EGF基因的pVC8质粒(Chaudhary et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 844538～4542，1987)中PCR扩增得到全长度EGF编码序列。用核酸内切酶BamHI和EcoRI消化并回收EGF片段后，在T4 DNA连接酶存在下将其连接到已使用同样限制性内切酶切割的携带上述DAB389-(Gly4Ser)2片段的质粒载体pET-28a上。然后用所得到的连接产物转化感染受态大肠杆菌JM105菌株。
培养被转化的细胞后，挑选单个菌落并从中提取质粒DNA。使用核酸内切酶消化法和PCR扩增法鉴定所得到的DNA序列。必要时可进行DNA序列分析以进一步证实序列的正确性。将如此得到的携带白喉毒素DAB389序列(SEQID NO5)、表皮生长因子序列(SEQ ID NO7)和存在于两者之间的接头序列(SEQ ID NO6)的重组质粒定名为pET-28a-DLE。质粒pET-28a-DLE的构建流程如附图1中所示。
可用该质粒转化大肠杆菌BL21(λDE3)，培养后挑选单个菌落提取质粒DNA，并进一步使用PCR进行鉴定(参见图2)。
实施例2DAB389-L-EGF嵌合蛋白质的表达、纯化及鉴定本实施例举例描述本发明的DAB389-L-EGF嵌合蛋白质在大肠杆菌宿主细胞中的诱导表达，表达产物的分离纯化及鉴定。
用实施例1中制得的重组质粒pET-28a-DLE转化感受态大肠杆菌BL21(λDE3)菌株，并按常规方法37℃培养被转化的细胞。当OD600nm＝0.6时，降低培养温度至32℃并向培养物中加IPTG以诱导表达。诱导过程中，以SDS-PAGE电泳法监测蛋白质表达产物。发现诱导3.5小时后，目的蛋白达到最高表达水平(约占菌体总蛋白的33％)。
按常规方法分离大肠杆菌宿主细胞的包涵体，以盐析、滤胶过滤和高压液相层析等方法(HPLC)从包涵体和培养基中分离并纯化所需的蛋白质(参见图3)。
然后用免疫印迹分析法和N末端氨基酸序列测定法(Sanger双脱氧末端终止法)鉴定表达产物。结果显示，本发明制备的DAB389-L-EGF为分子量约49KDa，N末端15个氨基酸完全正确的嵌合蛋白质。
实施例3DAB389-L-EGF嵌合蛋白质的体外细胞毒活性试验本实施例旨在试验本发明的嵌合毒素蛋白质对各种培养的人肿瘤细胞系体外细胞毒活性。实验中所使用的人肝癌细胞系HepG-2、人结肠癌细胞系Hct-8、人乳腺癌细胞系Mcf-7、人肺癌细胞系A549和人宫颈癌细胞系Hela均可从中国典型培养物保藏中心(CCTCC)或中国药品生物制品检定所购得。
将细胞(2×104/ml)接种于96孔微量培养板的各孔中(0.2ml/孔)并按常规方法培养24小时后，向各孔内加入不同浓度的DAB389-L-EGF或对照样品DAB389-EGF(0.01ml)。继续保温24小时后，再加入[3H]-亮氨酸(1μCi/孔)并保温过夜。快速冻融细胞后将细胞收集到滤膜上，然后用β计数检测掺入到细胞内的放射活性。
结果可见，纯化的带有接头序列的嵌合毒素蛋白质以剂量依赖方式，明显地抑制各种肿瘤细胞系的蛋白质合成，从而发挥其细胞毒活性(参见表1)。另外，使用人肝癌细胞系HepG-2(由中国药品生物制品检定所提供)作为靶细胞所进行的比较实验结果进一步表明，本发明的DAB389-L-EGF嵌合毒素的ID50值约比不带有接头序列的相应导向性嵌合白喉毒素的ID50低2～3倍(参见图4)。
表1.DAB389-L-EGF和DAB389-EGF对不同人肿瘤细胞的体外细胞毒作用IC50(μg/ml)细胞系来源 DAB389-L-EGFDAB389EGFHepG-2肝癌 2.34 4.56Hct-8 结肠癌 1.36 3.87Mcf-7 乳腺癌 0.88 2.76A549 肺癌 0.65 1.64Hela 宫颈癌 0.98 3.54实施例4DAB389-L-EGF嵌合蛋白质对体内生长的移植瘤的抑制活性本实施例旨在观察本发明的嵌合毒素对裸鼠体内生长的移植瘤的抑制作用，借以检测本发明的嵌合毒素对体内生长的肿瘤靶细胞的导向和杀伤活性。
将溶于100μl PBS的2.5×105个人肝癌细胞系HepG-2(由本室保存)经皮下注射到各Balb/c小鼠体内。当5天后可看到或触及到裸鼠皮下肿瘤时，将动物随机分成3组(每组10只)。实验组动物每天各注射10μg DAB389-L-EGF，阳性对照组每天各注射10μg DAB389-EGF。阴性对照组动物则每天各接受等体积的PBS。对所有动物均经腹腔内注射途径给药，每天1次，共注射15天。每天测量并计算肿瘤大小。第18天处死动物，对动物的移植瘤和心、肝、肾、脾和脑组织进行病理学检查。
结果显示，治疗结束时各组之间的肿瘤大小有很大差异。注射DAB389-L-EGF的小鼠皮下肿瘤约比注射DAB389-EGF的动物肿瘤小2.5～3倍，并且比只注射PBS的阴性对照组小4～8倍(参见图5)。另外，治疗15天后，动物所有器官均未见任何明显的病理学改变。由此可见，为了改善肿瘤靶细胞对嵌合毒素的毒素部分和导向部分的敏感性，使嵌合毒素更好地发挥其受体(EGFR)结合和细胞毒活性及靶细胞杀伤能力，在其毒素部分和导向部分之间插入一个用于构建单链抗体的相似接头序列，将大大改善整个分子的β片层折迭，从而使之更加有效地发挥其上述功能。
序列表(1)一般信息(I)申请人中国人民解放军军需大学(II)发明名称带有接头序列的受体导向性嵌合毒素(III)序列数7(IV)通讯地址(A)联系人朱平(B)街道西安大路175号(C)城市长春(D)国家中华人民共和国(E)邮编130062(V)计算机可读形式(A)介体类型3.5英寸软盘(B)计算机IBMPC(C)操作系统WINDOW98(D)软件WORD98(VI)电讯信息(A)电话86-0431-7962109(B)传真86-0431-7965274(2)SEQ ID NO1的信息(I)序列特征(A)长度27bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO1CATGCCATGG GCGCTGATGA TGTTGTT(2)SEQ ID NO2的信息(I)序列特征(A)长度56bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO2CGGGATCCAC CTCCGCCTGA ACCGCCTCCA CCCGCATGCG TTTTATGCCC CGGAGA(2)SEQ ID NO3的信息(I)序列特征
(A)长度27bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO3CGGGATCCAA CTCCGACTCC GAATGTC(2)SEQ ID NO4的信息(I)序列特征(A)长度30bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO4CGGAATTCTT ATCTCAATTC CCACCACTTC(2)SEQ ID NO5的信息(I)序列特征(A)长度1167bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO5ATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGGTATACAAAAGCCAAAATCTGGTACACAAGGAAATTATGACGATGATTGGAAAGGGTTTTATAGTACCGACAATAAATACGACGCTGCGGAATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGAAAAGCTGGAGGCGTGGTCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAAGTGGATAATGCCGAAACTATTAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTCACTGAACCGTTGATGGAGCAAGTCGGAACGGAAGAGTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTGCTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGGGGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAGGCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACTTGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAAGATGCGATGTATGATTATATGGCTCAAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCAGTAGGTAGCTCATTGTCATGCATAAATCTTGATTGGGATGACATAAGGGATAAAACTAAGACAAAGATAGAGTCTTTGAAAGACCATGGCCCTATCAAAAATAAAATCAGCGAAAGTCCCAATAAAACAGTATCTGAGGAAAAAGCTAAACAATACCTAGAAGAATTTCATCAAACGGCATTAGAGCATCCTGAATTGTCAGAACTTAAAACCGTTACTGGGACCAATCCTGTATTCGCTGGGGCTAACTATGCGGCGTGGTCAGTAAACGTTGCGCAAGTTATCGATAGCGAAACAGCTGATAATTTGGAAAAGACAACTGCTGCTGTTTCGATACTTCCTGGTCTAGTTAGCGTAATGGGCATTGCAGACGGTGCCGTTCACCACAATACAGAAGAGATAGTGGCACAATCAATAGCTTTATCGTCTTTAATGGTTGCTCAAGCTATTCCATTGGTAGGAGAGCTAGTTGATATTGGTTTCGCTGCATATAATTTTGTAGAGAGTATTATCAATTTATTTCAAGTAGTTCATAATTCGTATAATCGTCCCGCGTATTCTCCGGGGCATAAAACGCATGCG
(2)SEQ ID NO6的信息(I)序列特征(A)长度30bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO6GGTGGA GGCG GTTCAGGCGG AGGTGGATCC(2)SEQ ID NO7的信息(I)序列特征(A)长度159bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO7AACTCCGACTCCGAATGTCCATTGTCCCACGACGGTTACTGTTTGCACGACGGTGTTTGTATGTACATCGAAGCTTTGGACAAGTACGCCTGTAACTGTGTTGTTGGTTACATCGGTGAAAGATGTCAATACAGAGACTTGAAGTGGTGGGAATTGAGA
权利要求
1.由毒素部分和导向部分组成的，并且在两者之间插入了适当接头序列的嵌合蛋白质，特征在于所说的毒素部分是白喉毒素分子，导向部分是表皮生长因子分子，且接头序列是(Gly4Ser)n。
2.根据权利要求1的嵌合蛋白质，其中所说的白喉毒素部分是由包括成熟白喉毒素催化和跨膜区的386个氨基酸及484-486位三个氨基酸组成的。
3.根据权利要求1的嵌合蛋白质，其中所说的表皮生长因子部分是成熟表皮生长因子的氨基酸1～53。
4.根据权利要求1的嵌合蛋白质，其中接头序列是(Gly4Ser)1-3。
5.根据权利要求1的嵌合蛋白质，其中接头序列是(Gly4Ser)2。
6.生产如权利要求1-5中的任何一项限定的嵌合蛋白质的方法，该方法包括(1)提供携带DAB389-L-EGF之DNA编码序列的重组表达载体；(2)用步骤(1)的重组载体转化适当的宿主细胞；(3)在适于表达DAB389-L-EGF嵌合蛋白质的条件下培养步骤(2)的被转化的宿主细胞；(4)收获并纯化所得到的嵌合蛋白质。
7.含有如权利要求1-5中的任何一项限定的嵌合蛋白质及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
8.如权利要求1-5中的任何一项限定的嵌合蛋白质在生产抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及通过接头序列连接的,由毒素分子和导向分子组成的嵌合蛋白质。更具体地说,本发明涉及借助一个简单的5～15肽接头序列连接的,由作为细胞毒性剂部分的白喉毒素和作为导向部分的表皮生长因子组成的嵌合毒素,其制备方法及其作为肿瘤治疗剂的应用。
文档编号A61K38/18GK1422868SQ0113870
公开日2003年6月11日 申请日期2001年11月23日 优先权日2001年11月23日
发明者张国利, 朱平, 吴广谋 申请人:中国人民解放军军需大学