专利名称：一种中药免疫调节剂及其制法和在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医用药品，具体涉及中药免疫调节剂和及其制备方法和以该中药免疫调节剂为活性成分的抗肿瘤药剂和制法。
背景技术：
迄今为止，恶性肿瘤是严重威协人类健康的常见病和多发病。目前，临床上对肿瘤的治疗尚无特别有效的药物。尽管手术治疗对某些早期肿瘤的医治取得了一定的效果，但对中晚期肿瘤的治疗效果并不理想，一些不便于施行手术的特殊部位的肿瘤，则使施行手术受到限制。化疗药物尽管有一定的抗肿瘤作用，但毒副作用大，时常加重病人痛苦，甚至不得不被停用。因此，寻找对肿瘤治疗有效且毒副作用低的抗肿瘤药物，是当前医学界的重大课题。免疫调节在肿瘤的防治中有着十分重要的作用，寻找有效的免疫调节剂，是当前攻克肿瘤的主要方向之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中药免疫调节剂，使其具有调节免疫功能的作用，能增强免疫功能。同时，本发明还提供一种以该中药免疫调节剂为有效成分的抗肿瘤中药，使其具有明显的抗肿瘤及增强免疫功能的疗效，并能与化疗药物及放疗发生增效和减毒作用，且无毒副作用的特点。
本发明提供的中药免疫调节剂是1重量份黄芪和1份量重刺五加混合煎煮的水煎液浓缩后，经乙醇沉淀，其沉淀物再经乙醇提取所得到的醇提物，其制备方法是将黄芪1重量份，刺五加1份量重混合加水煎煮2次，第一次加水量为原料量8-12倍，煎煮2小时，第二次加水量为原料量4-6倍，煎煮1小时，合并煎液，混匀，静置12至24小时，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.14-1.20的清膏，清膏在搅拌下加乙醇，使含醇量为80％，搅拌后静置12至24小时，过滤，将滤得沉淀物加90％配制量的水溶解、离心沉淀、过滤，滤液在搅拌下加乙醇使含量达30％～50％，静置24小时以上，过滤，滤液回收乙醇至浸膏。
本发明提供的抗肿瘤中药由上述中药免疫调节剂和制药上可接受的载体、赋形剂或添加剂组成，其制备方法是以黄芪、刺五加为原料，按以下方法制成的药剂(1)把黄芪1重量份，刺五加1份量重混合加水煎煮2次，第一次加水量为原料量8-12倍，煎煮2小时，第二次加水量为原料量4-6倍，煎煮1小时，合并煎液，混匀，静置12至24小时，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.14-1.20的清膏，放冷至室温。(参见实验I，正交试验设计优化处方剂量配比；实验II，正交试验设计优选最佳工艺条件)(2)清膏在搅拌下加乙醇，使含醇量为80％，搅拌后静置12至24小时，过滤，将滤得沉淀物加90％配制量的水溶解、离心沉淀、过滤，滤液在搅拌下加乙醇使含量达30％～50％，静置24小时以上，过滤，滤液回收乙醇至浸膏，加制药上可接收的载体、赋形剂或添加剂，制成药剂。胶囊或口服液。
经药效学研究证明，本发明提供的中药免疫调节剂和以该中药免疫调节剂为活性成分的抗肿瘤中药，具有明显的免疫调节作用和抗肿瘤作用，能延长Lewis肺癌(Lewis Lung carcinoma，LLC)小鼠(即荷LLC小鼠)平均生存时间，其疗效与Cy(Cyclophosphamide环磷酰胺)相似；对小鼠Lewis肺癌瘤重有明显抑制作用，其疗效接近环磷酰胺；本发明中药还可明显抑制Lewis肺癌小鼠自发肺转移；增强机体的体液免疫、细胞免疫及生物调节因子(IL-1，IL-2，IFN，TNF和NK细胞等)的作用；保护荷瘤动物血细胞及改善荷瘤动物一般状况等。此外，本发明中药还对化、放疗具有明显增效作用。
本发明通过正交试验设计优化了处方剂量配比，并优选了该复方有效部位群的提取分离的工艺过程及工艺条件，具体实验如下实验I正交试验设计优化处方剂量配比为了使处方两味药以更加科学合理的剂量配比组成，本研究对处方各药物剂量通过正交试验设计研究，并对其结果经SAS系统统计分析优选出其最佳配比，1.因素水平的确定处方两味主药，A(黄芪)和B(刺五加)在原临床应用研究及实验研究剂量(1.0∶1.2g/日)的基础上，每味药剂量分别上、下增减，各设计三个水平，试验方案见表I。
表I因素水平表 2.选择Lg(34)的正交表进行试验(表略)3.试验结果分析试验项目的因素、水平、试验结果见表II。
表II正交试验结果
经过SAS系统统计分析处理提示肝癌1、A、B两因素三个水平皆有显著性差异，呈正相关。
2、A3B3最好细胞增殖1、A、B两因素三个水平皆有显著性差异，但呈负相关。
2、A3B1最好。
综合两因素两项生物实验结果优选取A3B2的处方剂量配比。
提示每剂黄氏选取12g(A3)、刺五加根据不同用药目的，剂量在10-14g之间，根据本剂临床应用于防治肿瘤目的，故选取12g。
实验II正交试验优选最佳工艺条件1、因素、水平的确定影响工艺的因素较多，现选取水煎次数与时间、加水量、浓缩液(清膏)的相对密度和醇沉时醇的浓度等四个因素。结合生产实际每个因素设计三个水平。试验方案见表III。
表III因素水平表
2、选择正交试验表根据因素水平表选择L9(34)的正交表进行试验。(表略)3、试验结果分析试验项目的因素、水平、试验结果见表IV。
表IV正交试验结果
K1＝ 33.9537.3720.9114.14K2＝ 35.4426.1333.7231.36K3＝ 33.5738.6848.3357.45R＝ 1.87 12.0027.4243.31K21＝ 1152.60 1396.52 437.23 199.94K22＝ 1255.99 682.78 1137.03 983.45K23＝ 1126.94 1496.14 2335.79 3300.50Q＝K21+K22+K23＝ 392.84397.27434.45498.21S＝Q-G289.88294.31331.49395.20通过运用SAS系统方差分析结果显示，总体上有显著性差异，四个因素都有统计意义。
本试验结果以多糖含量直接看，第3号试验为最佳方案，其实验条件为A1B3C3D3。
从极差分析看RD(43.1)＜Rc(27.42)＞RB(12.00＞RA(1.87)其中因素D即醇沉时乙醇所达浓度的差异最明显，为影响工艺的最重要因素，其次是提取液浓缩后清膏的相对密度。至于水煎煮时用水量及提取次数则多多益善，但从节约用水和能源、降低成本考虑，应选择A2B1C3D3。为验证上述选择的结果，按A2B1C3D3，A2B3C3D3的条件重复实验，结果产品中多糖含量在24.44～28.95之间，故可选择提取工艺为水提取2次，首次加水量12倍、煎煮2小时，第二次加水量6倍，煎煮1小时，合并煎液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.14～1.20的清膏(80℃测)放冷。清膏在搅拌下加计算量的95％以上的乙醇，使含醇量为80％，滤取沉淀，加热水溶解，滤过。
实验III 生物活性指导优选提取、分离本发明中药免疫调节剂(有效部位群)的工艺条件
III.1提取分离工艺步骤见图1。
III.2以NK活性，细胞增殖试验活性(ConA和Lps)为检测指标，比较各处理步骤的所得物的生物活性，统计处理数据、分析结果并优选工艺方案及条件，共分三步完成，即实验IV-VI。实验IV其结果见表V。
表V水总提物与醇沉物生物活性比较组别NK ConA(SI) LPS(SI)正常对照组53.26±9.592.34±0.192.06±0.11模型对照组23.66±7.35△1.35±0.19△1.20±0.10△I号试药组 42.94±6.20※△△2.09±0.07※△△1.90±0.09※△△II号试药组49.00±7.89△△△○2.22±0.12△△△○2.02±0.14△△△○与正常对照组比较△P＜0.01△△P＜0.05△△△P＞0.05与模型对照组比较※P＜0.01○P＞0.05结论结果II号试药组生物活性明显强于I号组，说明经过醇沉，活性成分集中于II号，故选取此工艺过程及其条件。
III.3 以NK细胞活性指标检测III.1中II和III号各部位，并比较其生物活性，结果见表VI。表VI 醇沉物与醇液NK活性的比较组别 NK活性(％)正常对照组50.54±7.32模型对照组30.53±3.19※1II号试药组49.56±4.50※2III号试药组 44.85±5.06※3与正常对照组比较※1P＜0.01与模型对照组比较※2P＜0.01与II号试药组比较※3P＜0.05结论II号试药组NK活性明显强于III号，说明第一步醇处理后醇沉淀部分比醇液活性强，此步结果提示醇沉淀物的工艺条件为优，因而选取之。
实验IV第二次醇沉时所取醇浓度的优选方法选择三种醇浓度30％、40％和50％分别处理、对所得三个有效部位群，选用NK细胞活性及由ConA和LPS刺激引起的细胞增殖反应试验等三项活性指标测试，比较三种有效部位群的生物活性。结果见表VII。
表VII三种方法所得有效部位群的生物活性比较X±SDn＝12组别NK活性(％)ConA(SI)LPS正常对照组 53.36±9.362.32±0.192.06±0.11模型对照组 23.66±7.351.35±0.131.20±0.10IV30％乙醇组 44.64±8.282.03±0.141.80±0.23V40％乙醇组47.71±9.222.08±0.151.82±0.18VI50％乙醇组 44.63±8.332.17±0.141.90±0.13对以上三试药组生物活性运用SAS系统统计分析，结果提示组间无显著性差异，各生物活性指标与所用乙醇浓度无一致的相关性，因此根据不同治疗目的，可采用30％-50％乙醇进行处理。
本发明中药免疫调节剂的分离提取工艺流程图见图2。
本发明药效试验及其结果，分述如下1.对荷瘤小鼠体液免疫功能的影响小鼠随机按表VIII分组，按规范方法制备模型给药7天后，检测脾细胞的IgM及给药15天检测血清IgG的生成量，结果如下表VIII本发明中药对荷瘤小鼠IgM和IgG生成量的影响A值组别 剂量g/kg.dIgM IgG正常对照组 0.58±0.07 11.8±0.8肿瘤对照组 0.37±0.04※9.3±1.2※1本发明中药 6.88 0.40±0.05△1※110.0±1.2※113.75 0.45±0.05※1△311.2±1.4※2△327.50 0.54±0.06※2△311.9±1.0※2△3环磷酰胺 0.02 0.35±0.02 8.9±1.3※2△1与正常对照组比较※1P＜0.01※2P＞0.05与肿瘤对照组比较△1P＞0.05△3P＜0.01结论本发明中药治疗可使荷瘤小鼠低下的IgM和IgG恢复至接近正常水平，而环磷酰胺组反使IgG和IgM水平进一步下降。
2.对荷瘤小鼠细胞免疫功能的影响小鼠随机按表2分组，给药7天后，取脾脏按规范方法检测脾细胞ConA和LPS增殖反应，结果见表IX。
表IX 本发明中药对荷Lewis肺瘤小鼠细胞增殖反应的影响增殖反应X±S组别 剂量g/d.kgConA(SI) LPS(SI)正常对照组 17.3±2.39.7±1.8肿瘤对照组 11.5±1.5※15.6±0.9※1本发明中药6.88 12.1±2.1※16.0±0.9※113.75 14.8±2.2※28.1±1.4△127.50 16.8±3.0△1※9.3±0.8※△1环磷酰胺 0.02 11.2±1.6※1※5.4±0.7※1※与正常对照组比较※1P＜0.01※2P＜0.05※P＞0.05与肿瘤对照组比较△1P＜0.01结论本发明药物治疗可使荷瘤小鼠低下的ConA和LPS增殖反应水平恢复至接近正常水平，而环磷酰胺组使其低下的水平进一步下降。
3.对荷瘤小鼠生物调节因子的影响按表X分组，于给药7天及15天处死小鼠，分别检测各项指标表X本发明中药对荷瘤小鼠生物调节因子的影响X±S，n＝6
ConA终浓度为3μg/ml，LPS终浓度为6□g/ml，LPS终浓度为5μg/ml(测TNF时)，与正常对照相比※P＞0.05，※※P＜0.05，※※※P＜0.01与肿瘤对照相比△P＞0.05，△△P＜0.05，△△△P＜0.01结论13.75和27.50g/kg两剂量组治疗皆可明显促进荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1和肿瘤坏死因子，使其低下的IL-2恢复至接近正常水平。
4.对免疫抑制小鼠免疫功能的影响小鼠按表XI分组，给药14天后检测各项指标表XI本发明中药对小鼠NK活性，IL-2诱生水平，γ-IFN诱生水平、IgG及TNF诱生水平的影响
与正常对照组相比，※P＞0.05，※※P＜0.05，※※※P＜0.01；与肿瘤对照组相比，△P＞0.05，△△P＜0.05，△△△P＜0.01结论本发明中药可明显提高免疫抑制小鼠的NK活性，IL-2、γ-IFN和TNF的诱生水平和血清IgG的含量。
5.对荷瘤小鼠一般状况的影响5.1小鼠按表VII分组，给药15天后检测血液学各项指标，结果见表XII表XII本发明中药对荷瘤小鼠血液学指标的影响X±Sn＝10
与正常对照组相比，※P＞0.05，※※P＜0.05，※※※P＜0.01；与肿瘤对照组相比，△P＞0.05，△△P＜0.05，△△△P＜0.01结果，13.75-27.5g/kg.d，给药15天可使荷瘤小鼠外周血低下的RBC，Hb量，WBC及BPC数恢复至接近正常水平。
6.对荷瘤小鼠放疗的影响按表随机分组，给予放疗及药液，于第三天接种瘤细胞，除肿瘤对照组外，其余组于第6天、10天分别放疗一次，每次照射剂量4Gy，第16天处死观察各动物一般生活状态，瘤重NK细胞活性淋巴细胞转化程度等指标，结果见表XII及以下。
表VIII本发明中药对荷瘤小鼠放疗的增效作用n＝10淋巴细胞转化组别与剂量 瘤重 NK细胞活性ConA(SI) Lps(SI)肿瘤对照组 1.03±0.18 49.3±7.92.3±0.162.02±0.03放疗对照组 0.96±0.13 24.5±7.5※※1.46±0.14※1.27±0.16※放疗+本发明中药组 0.82±0.27※32.2±6.1※△2.09±0.1※△△1.91±0.14△△8Gy+13.75g/kg8Gy+27.50g/kg 0.82±0.23※39.2±9.4※△2.20±0.23○△1.89±0.13△与肿瘤对照组比较○P＞0.05※P＜0.05※※P＜0.01与放疗对照组比较△P＜0.05△△P＜0.01结果表示，本发明中药对荷瘤小鼠放疗疗效有增效趋势，同时可阻止放疗引起的免疫功能下降。同时观察到小鼠接种肿瘤细胞后体重下降肿瘤对照组及放疗组小鼠至试验后期毛色灰暗无华，给药组小鼠则大多色白，光泽依旧且活泼。
图1是本发明中药免疫调节剂优选工艺条件的提取分离工艺步骤图；图2是本发明中药免疫调节剂的分离提取工艺流程图。
具体实施例方式
实施例1(1)把黄芪1200克，刺五加1200克混合加水煎煮2次，第一次加水量为原料量12倍，煎煮2小时，第二次加水量为原料量6倍，煎煮1小时，合并煎液，混匀，静置24小时，过滤，滤液浓缩至相对密度(在80℃时)为1.20的清膏，放冷至室温；(2)清膏在搅拌下加乙醇，使含醇量为80％，搅拌后静置24小时，过滤，将滤得沉淀物加900毫升热水溶解、离心沉淀、过滤，滤液在搅拌下加乙醇使含量达50％，静置24小时，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味；
(3)加入各种赋形剂，经过加工，分别制成口服液，片剂，胶囊剂等各剂型。
实施例2(1)把黄芪1200克，刺五加1200克混合加水煎煮2次，第一次加水量为原料量12倍，煎煮2小时，第二次加水量为原料量6倍，煎煮1小时，合并煎液，混匀，静置24小时，过滤，滤液浓缩至相对密度(在80℃时)为1.20的清膏，放冷至室温；(2)清膏在搅拌下加乙醇，使含醇量为80％，搅拌后静置24小时，过滤，将滤得沉淀物加900毫升热水溶解、离心沉淀、过滤，滤液在搅拌下加乙醇使含量达30％，静置24小时，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味；(3)加入各种赋形剂，经过加工，分别制成口服液，片剂，胶囊剂等各剂型。
实施例3(1)把黄芪1200克，刺五加1200克混合加水煎煮2次，第一次加水量为原料量8倍，煎煮2小时，第二次加水量为原料量4倍，煎煮1小时，合并煎液，混匀，静置24小时，过滤，滤液浓缩至相对密度(在80℃时)为1.14的清膏，放冷至室温；(2)清膏在搅拌下加乙醇，使含醇量为80％，搅拌后静置12小时，过滤，将滤得沉淀物加900毫升热水溶解、离心沉淀、过滤，滤液在搅拌下加乙醇使含量达50％，静置24小时，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味；(3)加入各种赋形剂，经过加工，分别制成口服液，片剂，胶囊等各剂型。
实施例4(1)把黄芪1200克，刺五加1200克混合加水煎煮2次，第一次加水量为原料量8倍，煎煮2小时，第二次加水量为原料量4倍，煎煮1小时，合并煎液，混匀，静置24小时，过滤，滤液浓缩至相对密度(在80℃时)为1.14的清膏，放冷至室温；(2)清膏在搅拌下加乙醇，使含醇量为80％，搅拌后静置12小时，过滤，将滤得沉淀物加900毫升热水溶解、离心沉淀、过滤，滤液在搅拌下加乙醇使含量达30％，静置24小时，过滤，滤液减压回收乙醇至干浸膏，加入各种赋形剂，经过加工，分别制成口服液，片剂，胶囊剂等各剂型。
权利要求
1.一种中药免疫调节剂，其特征在于它是1重量份黄芪和1份量重刺五加混合煎煮的水煎液浓缩后，经乙醇沉淀，其沉淀物再经乙醇提取所得到的醇提物。
2.根据权利要求1所述的中药免疫调节剂，其特征在于，所说的煎煮是加水煎煮2次，第一次加水量为原料量8-12倍，煎煮2小时，第二次加水量为原料量4-6倍，煎煮1小时，合并煎液；所说的水煎液浓缩是将上述合并后的煎液混匀，静置12至24小时，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.14-1.20的清膏；所说的经乙醇沉淀和沉淀物再经乙醇提取是清膏在搅拌下加乙醇，使含醇量为80％，搅拌后静置12至24小时，过滤，将滤得沉淀物加90％配制量的水溶解、离心沉淀、过滤，滤液在搅拌下加乙醇使含量达30％～50％，静置24小时以上，过滤，滤液回收乙醇至浸膏得醇提物。
3.权利要求1所述中药免疫调节剂的制备方法是将黄芪1重量份，刺五加1份量重混合加水煎煮2次，第一次加水量为原料量8-12倍，煎煮2小时，第二次加水量为原料量4-6倍，煎煮1小时，合并煎液，混匀，静置12至24小时，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.14-1.20的清膏，清膏在搅拌下加乙醇，使含醇量为80％，搅拌后静置12至24小时，过滤，将滤得沉淀物加90％配制量的水溶解、离心沉淀、过滤，滤液在搅拌下加乙醇使含量达30％～50％，静置24小时以上，过滤，滤液回收乙醇至浸膏。
4.一种抗肿瘤中药，其特征在于它由权利要求1、2所述的中药免疫调节剂和制药上可接受的载体、添加剂或赋形剂组成。
5.一种抗肿瘤中药的制备方法，其特征在于它是以黄芪、刺五加为原料，按以下方法制成的药剂a.黄芪1重量份，刺五加1份量重混合加水煎煮2次，第一次加水量为原料量8-12倍，煎煮2小时，第二次加水量为原料量4-6倍，煎煮1小时，合并煎液，混匀，静置12至24小时，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.14-1.20的清膏，放冷至室温；b.清膏在搅拌下加乙醇，使含醇量为80％，搅拌后静置12至24小时，过滤，将滤得沉淀物加90％配制量的水溶解、离心沉淀、过滤，滤液在搅拌下加乙醇使含量达30％～50％，静置24小时以上，过滤，滤液回收乙醇至浸膏，加制药上可接收的载体或赋形剂或添加剂，制成药剂。
6.权利要求1、2所述的中药免疫调节剂在制备用于防治肿瘤药物或免疫调节药物中的应用。
全文摘要
一种中药免疫调节剂，它是等份量重的黄芪、刺五加混合煎煮的水煎液浓缩后，经乙醇沉淀，其沉淀物再经乙醇提取所得到的醇提物，具有调节机体免疫功能作用；以该免疫调节剂为活性成分的抗抗肿瘤中药，具有明显的抗肿瘤作用，能延长Lewis肺癌小鼠平均生存时间，对小鼠Lewis肺癌瘤重有明显抑制作用，并能明显抑制Lewis肺癌小鼠自发肺转移，增强机体的体液免疫、细胞免疫及生物调节因子的作用，保护荷瘤动物血细胞，对化、放疗具有明显增效作用。
文档编号A61P35/00GK1424057SQ01138269
公开日2003年6月18日 申请日期2001年12月10日 优先权日2001年12月10日
发明者马宝瑕, 杜光, 张锐 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院