一种雷公藤多苷提取物及其提取方法

专利名称：一种雷公藤多苷提取物及其提取方法
技术领域：
本发明涉及一种植物提取物及其提取方法，具体的涉及一种雷公藤多苷提取物及其提取方法。
背景技术：
雷公藤属在我国主要分布于长江流域以南山区和东北长白山区，民间广泛流传用作为治疗关节炎、跌打损伤、皮肤病等的草药，也用于农药。在临床上国内对雷公藤的研究取得了显著的成效和突破，从治疗风湿性关节炎已发展到治疗红斑狼疮、银屑病、肾炎和肿瘤研究等多种常见病和疑难杂症，由于其应用面广、疗效显著，且对疑难顽症具有独特治疗作用而逐渐成为国内外、中医、西医、中西医各专家瞩目和研究的热点。
中医学中，雷公藤的传统提取方法采用水煎浓缩。此方法投料量有限，温度要求高，操作有较高要求，产量低，不适合工业化生产。现有的应用于工业化生产的雷公藤提取物的提取方法主要有下述几种1.提取法将雷公藤药材用水煎煮提取。该方法污染，水用量大，能耗大。
2.乙醇提取法将雷公藤用乙醇提取，之后用氯仿萃取并浓缩至干。生产效率极低，乙醇投料大且损耗大，不易于大规模工业生产。
3.乙酸乙酯提取法将雷公藤用乙醇提取，之后用乙酸乙酯萃取，再用氯仿萃取并浓缩至干。
上述3种方法提取的产品质量不好，其中药效成分雷公藤甲素等萜类化合物的提取率低。
4.柱层析法该方法产品纯度较高，但投料量小，大规模生产操作要求高，不易于大规模工业应用。
自二十世纪80年代初期发现雷公藤疗效后，许多药厂纷纷生产雷公藤提取物产品。但是，由于目前对雷公藤制剂的药理研究很少，缺乏正规的药理资料，且对于药效成分无统一的质量控制标准，各厂家生产的雷公藤制剂所含组分和药效成分含量不尽相同，因此，市面上的雷公藤制剂的药理效果和毒副作用有很大的差异。其中，很多产品药理效果不好，且毒副作用大。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的提取方法提取的雷公藤多苷中药效成分含量不高，产品质量不好，或者工艺不易于大规模工业生产等问题，而提供一种产品药效成份高，药理效果好，且操作简便，成本低，生产周期短，对环境污染少，易应用于大规模的工业生产的雷公藤多苷提取方法，以及其雷公藤多苷产品。
本发明的方法采用水提并醇提，吸附与柱层析并行的提纯工艺，具体包括如下步骤(1)提取粗品将雷公藤粉末用水煮提取，再用醇或醇的水溶液提取，将提取液合并，浓缩至醇含量小于或等于体积百分比20％，之后用有机溶剂萃取，制得含粗品的萃取液，浓缩至干得粗品。本发明的方法在粗提部分选择水煮和醇的水溶液分别提取，将有效成分更多的提取保存了出来，并减少了用水量。
其中，雷公藤可选用叶、花、根、茎各部，较佳的选用木质部，经精选研碎后制得粉末。
其中，所述的水煮提取的次数较佳的为1～3次；水的用量较佳的为雷公藤粉末重量的3～10倍；水煮的温度较佳的为50～100℃；水煮的时间较佳的为30～60分。
其中，所述的醇或醇的水溶液提取的次数较佳的为1～3次；所述的醇可选自低级醇，较佳的为甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇；醇的水溶液中醇的浓度较佳的为体积百分比40％以上；醇或醇的水溶液的用量较佳的为雷公藤粉末重量的6～10倍；醇的水溶液提取的温度较佳的为20～50℃；醇的水溶液提取的时间较佳的为8～24小时。
其中，所述的萃取的次数为较佳的为1～3次；使用的有机溶剂较佳的选自石油醚、低级卤代烷烃、环烷烃、烷烃、低级脂肪酮或酯；有机溶剂的用量为较佳的为提取液浓缩后体积的1～3倍；每次萃取的时间较佳的为30～60分钟。
雷公藤多苷粗品为疏松红棕色粉末，收率约为5～18wt‰。采用不同有机溶剂进行萃取所得的粗品的收率如表1所示。
表1采用不同有机溶剂进行萃取所得的粗品收率

(2)粗品精制用有机溶剂溶解粗品，加入吸附剂进行吸附，过滤，将滤饼用梯度有机溶剂的溶液进行洗脱，收集有效部分的洗脱液，浓缩，再进行柱层析，用梯度有机溶剂的溶液进行洗脱，收集含有效成分的洗脱液，浓缩至干，即得精制雷公藤多苷。本发明方法中的吸附过程能够有效提高产品纯度，操作简单，便于大规模工业化操作，能够有效节省劳动力成本，缩短生产周期，节约时间成本；梯度洗脱提高了柱层析的分离效果，成品质量有效提高。
其中，溶解雷公藤多苷粗品所用的用有机溶剂较佳的为石油醚、卤代烷烃、环烷烃、烷烃、低级脂肪酮或酯。
其中，所述的吸附剂较佳的为硅胶、中性氧化铝、纤维素或硅藻土；吸附剂的用量较佳的为粗品质量的10～20倍。；吸附的时间为较佳的为30～60分。
吸附后过滤，将滤饼用梯度有机溶剂的溶液进行洗脱，收集有效部分的洗脱液。其中，所述的有机溶剂较佳的选自石油醚、卤代烷烃、环烷烃、烷烃、低级脂肪酮或酯，所述的梯度有机溶剂的溶液较佳的为梯度在体积百分比1～20％间的卤代烷烃或烷烃的醇溶液，或梯度在体积百分比1～20％的环烷烃的丙酮溶液，或能够达到同样展开效果的其它梯度有机溶剂；所述的卤代烷烃较佳的为二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿或四氯化碳；所述的环烷烃较佳的为环己烷或环戊烷；所述的烷烃较佳的为己烷或戊烷；所述的低级脂肪酮较佳的为丙酮或甲乙酮；所述的酯较佳的为乙酸乙酯。较佳的梯度洗脱的有机溶剂的溶液及其用量为以每克吸附剂为参照，1％的梯度，用量为3～4毫升；3％的梯度，用量为1.5～2毫升；5％的梯度，用量为2～3毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均为3～5毫升；15％的梯度，用量为4～6毫升；百分比为体积百分比。
其中，所述的有效部分的洗脱液以采用薄层层析和紫外364nm下检测，与标准品对照进行确认。将洗脱液浓缩后，制得干浸膏，可再加入有机溶剂，按上述方法进行二次吸附洗脱。吸附洗脱后进行浓缩，最好浓缩至干，再加入有机溶剂溶解，进行后续的柱层析。
柱层析的方法按常规操作进行，使用梯度有机溶剂的溶液进行洗脱，收集含有效成分的洗脱液。其中，每个梯度的有机溶剂的溶液的用量和时间，梯度有机溶剂的溶液的种类和配比，较佳的梯度洗脱的有机溶剂的溶液及其用量同前述。洗脱后的有效部分的洗脱液的确认同前述。
将柱层析后的洗脱液浓缩至干，即制得精制雷公藤多苷产品。采用不同有机溶剂进行梯度洗脱所得的精制雷公藤多苷产品的收率如表2所示。
表2采用不同有机溶剂进行梯度洗脱所得的精制雷公藤多苷产品的收率

本发明的方法中，所用的醇和其他有机溶剂可全部回收循环使用，从而减少了成本，对环境友好。
本发明还涉及由上述方法制得的雷公藤多苷提取物，以及含有该雷公藤多苷提取物的药物组合物。该药物组合物包含治疗有效量的本发明的雷公藤多苷和药学上可接受的载体。本发明中，所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，如稀释剂，赋形剂(如水等)，粘合剂(如纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等)，填充剂(如淀粉等)，崩裂剂(如碳酸钙、碳酸氢钠)。另外，还可以在组合物中加入其他辅助剂，如香味剂和甜味剂等。
本发明的药物组合物，可以通过静脉注射、皮下注射或口服的形式施加于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制备成常规的固体制剂如片剂、粉剂或胶囊等；用于注射时，可将其制备成注射液。本发明的药物组合物的各种剂型可以采用医学领域常规的方法进行制备。其中雷公藤内酯甲的含量可为不少于重量百分比0.01％。上述药物组合物施加于需要治疗的患者的一般剂量可为1～1.5mg雷公藤多苷成分/公斤体重/天，具体可根据患者的年龄和病情等变化。
本发明所用试剂及原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于本发明的方法采用水提并醇提，吸附与柱层析并行的提纯工艺，制得的雷公藤多苷药效成分含量高，且操作简便，成本低，生产周期短，所用有机试剂可全部回收循环使用，对环境友好，易应用于大规模的工业生产，具有较高的工业应用价值。由本发明的方法制得的雷公藤多苷药效成分含量高，且含量比例适度，药理效果好，毒副作用小。


图1为效果实施例中雷公藤甲素标准曲线。
图2为效果实施例中雷公藤内酯甲标准曲线。
具体实施例方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1雷公藤木质部经拣选、处理为小块，由粉碎机粉碎为粉末。称取150Kg粉末，置于多用提取锅中，用5倍重量的水搅拌均匀，在提取锅中直接通蒸汽加热至80℃-100℃，蒸煮1h，待冷却至常温，收集滤液。再加6倍重量的乙醇，浸泡8h，温度30℃，放出乙醇提取液，以同样的方法再次加入乙醇，浸泡一次，合并提取液。
提取液抽至蒸馏锅，首先打开冷凝器和冷却器的进水阀门，再慢慢将反应锅夹道的冷却水放出，控制好蒸汽的流量和锅内温度70-100℃左右，直至药液中含乙醇浓度小于体积百分比20％为止。
加入与浓缩液等体积的氯仿回流提取三次，每次提取60min后，使氯仿萃取液和原乙醇提取液分出上下两层，放出氯仿萃取液，将三次萃取液合并，脱水过滤，常压蒸馏回收氯仿。控制好锅内温度和压力，减压抽真空，真空度-0.07MPa以下，浓缩得疏松红棕色粉末即为雷公藤多苷粗品提取物。
将上步的雷公藤多苷粗粉用氯仿，先溶解成溶液，然后缓缓加入混有氯仿的硅胶(100-200目)中，硅胶的用量为粗品质量的15倍，搅拌进行吸附1h，过滤抽干，滤液为无效成份。
滤饼以1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(体积百分比)的氯仿乙醇溶液梯度洗脱，溶液用量以每克吸附剂为参照，1％的梯度，用量为3.5毫升；3％的梯度，用量为1.8毫升；5％的梯度，用量为2.5毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均为4毫升；15％的梯度，用量为5毫升。采用薄层层析和紫外364nm下检测，与标准品对照确认有效洗脱梯度。过滤抽干，将有效滤液浓缩，回收氯仿，浓缩后得干浸膏。将干浸膏再加入氯仿稀释成溶液，重复进行二次吸附洗脱，减压抽真空浓缩后得干浸膏，待柱层析备用。
在直径9cm左右层析柱中，先装入氯仿少许，然后推入药棉(做成球状)置于柱底部铺平。湿法装硅胶，排尽柱内气泡，静置24h以上压实，开活塞放出硅胶剂上面多余的氯仿，粒体开始收缩，自然压紧柱体。
将柱中加入干浸膏的稀释液，分别加入1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(体积百分比)的氯仿乙醇液进行梯度洗脱，溶液用量以每克吸附剂为参照，1％的梯度，用量为3.5毫升；3％的梯度，用量为1.8毫升；5％的梯度，用量为2.5毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均为4毫升；15％的梯度，用量为5毫升。用分瓶收集洗脱液。将收集的小瓶洗脱液分别点样于硅胶G板上进行薄层层析后，用紫外分析仪相应波长下鉴别洗脱液是否含有效成分，收取有效瓶样，将有效瓶样的洗脱液浓缩抽干得有效成份。将分取的有效成份经干燥、化验、配比，混合过100目筛，包装，即为成品雷公藤多苷原粉。其中，雷公藤甲素的含量为0.15wt％，雷公藤内酯甲的含量为0.32wt％。将所用所有有机试剂回收循环使用。
雷公藤多苷粉的检验方法，采用薄层层析法，与标准品对照一致，成份相同。多苷粉采用LD50急性毒性试验LD50＝155±15mg/Kg，理化性质雷公藤多苷为黄色或棕黄色粉末，味苦，熔点100～120℃。雷公藤多苷按江苏省卫生厅苏卫药萍字[84]第76号文执行。
实施例2雷公藤木质部经拣选、处理为小块，由粉碎机粉碎为粉末。称取150Kg粉末，置于多用提取锅中，用3倍重量的水搅拌均匀，在提取锅中直接通蒸汽加热至50℃-60℃，蒸煮40分，待冷却至常温，收集滤液。重复用水提取2次。再加10倍重量的体积百分比90％甲醇水溶液(体积百分比)，浸泡24h，温度20℃，放出甲醇提取液。合并提取液。
提取液抽至蒸馏锅，首先打开冷凝器和冷却器的进水阀门，再慢慢将反应锅夹道的冷却水放出，控制好蒸汽的流量和锅内温度70-100℃左右，直至药液中含甲醇浓度小于体积百分比10％为止。
加入3倍浓缩液体积的石油醚回流提取一次，提取40min后，使石油醚萃取液和原提取液分出上下两层，放出石油醚萃取液，脱水过滤，常压蒸馏回收石油醚。控制好锅内温度和压力，减压抽真空，真空度-0.07MPa以下，浓缩得疏松红棕色粉末即为雷公藤多苷粗品提取物。
将上步的雷公藤多苷粗粉用石油醚先溶解成溶液，然后缓缓加入混有石油醚的中性氧化铝(100-200目)中，中性氧化铝的用量为粗品质量的10倍，搅拌进行吸附1h，过滤抽干，滤液为无效成份。
滤饼用％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(体积百分比)的石油醚乙醇溶液梯度洗脱，溶液用量为以每克吸附剂为参照，1％的梯度，用量为3毫升；3％的梯度，用量为1.5毫升；5％的梯度，用量为2毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均为3毫升；15％的梯度，用量为4毫升。采用薄层层析和紫外364nm下检测，与标准品对照确认有效洗脱梯度。过滤抽干，将有效滤液浓缩，回收石油醚，浓缩后得干浸膏，待柱层析备用。
在直径10cm左右层析柱中，先装入石油醚少许，然后推入药棉(做成球状)置于柱底部铺平。湿法装硅胶，排尽柱内气泡，静置24h以上压实，开活塞放出硅胶剂上面多余的石油醚，粒体开始收缩，自然压紧柱体。
将柱中加入干浸膏的稀释液，分别加入1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(体积百分比)的石油醚乙醇液进行梯度洗脱，溶液用量为以每克吸附剂为参照，1％的梯度，用量为3毫升；3％的梯度，用量为1.5毫升；5％的梯度，用量为2毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均为3毫升；15％的梯度，用量为4毫升。用分瓶收集洗脱液。将收集的小瓶洗脱液分别点样于硅胶G板上进行薄层层析后，用紫外分析仪相应波长下鉴别洗脱液是否含有效成分，收取有效瓶样，将有效瓶样的洗脱液浓缩抽干得有效成份。将分取的有效成份经干燥、化验、配比，混合过100目筛，包装，即为成品雷公藤多苷原粉。其中，雷公藤甲素的含量为0.12wt％，雷公藤内酯甲的含量为0.30wt％。将所用所有有机试剂回收循环使用。
实施例3雷公藤木质部经拣选、处理为小块，由粉碎机粉碎为粉末。称取150Kg粉末，置于多用提取锅中，用10倍重量的水搅拌均匀，在提取锅中直接通蒸汽加热至95℃-100℃，蒸煮30分，待冷却至常温，收集滤液。重复用水提取1次。再加6倍重量的体积百分比40％异丙醇水溶液(体积百分比)，浸泡15h，温度50℃，放出异丙醇提取液，重复再提取两次，合并提取液。
提取液抽至蒸馏锅，首先打开冷凝器和冷却器的进水阀门，再慢慢将反应锅夹道的冷却水放出，控制好蒸汽的流量和锅内温度70-100℃左右，直至药液中含异丙醇浓度小于体积百分比5％为止。
加入2倍浓缩液体积的环己烷回流提取两次，每次提取50min后，使环己烷萃取液和原提取液分出上下两层，放出环己烷萃取液，将三次萃取液合并，脱水过滤，常压蒸馏回收环己烷。控制好锅内温度和压力，减压抽真空，真空度-0.07MPa以下，浓缩得疏松红棕色粉末即为雷公藤多苷粗品提取物。
将上步的雷公藤多苷粗粉用环己烷，先溶解成溶液，然后缓缓加入混有环己烷的纤维素(100-200目)中，纤维素的用量为粗品质量的18倍，搅拌进行吸附50分，过滤抽干，滤液为无效成份。
滤饼1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(体积百分比)的环己烷丙酮溶液梯度洗脱，溶液用量为以每克吸附剂为参照，1％的梯度，用量为4毫升；3％的梯度，用量为2毫升；5％的梯度，用量为3毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均为5毫升；15％的梯度，用量为6毫升。采用薄层层析和紫外364nm下检测，与标准品对照确认有效洗脱梯度。过滤抽干，将有效滤液浓缩，回收环己烷，浓缩后得干浸膏，再进行二次吸附洗脱，浓缩后的干浸膏，待柱层析备用。
在直径12cm左右层析柱中，先装入环己烷少许，然后推入药棉(做成球状)置于柱底部铺平。湿法装硅胶，排尽柱内气泡，静置24h以上压实，开活塞放出硅胶剂上面多余的环己烷，粒体开始收缩，自然压紧柱体。
将柱中加入干浸膏的稀释液，分别加入1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(体积百分比)的环己烷丙酮溶液进行梯度洗脱，溶液用量为以每克吸附剂为参照，1％的梯度，用量为4毫升；3％的梯度，用量为2毫升；5％的梯度，用量为3毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均为5毫升；15％的梯度，用量为6毫升。用分瓶收集洗脱液。将收集的小瓶洗脱液分别点样于硅胶G板上进行薄层层析后，用紫外分析仪相应波长下鉴别洗脱液是否含有效成分，收取有效瓶样，将有效瓶样的洗脱液浓缩抽干得有效成份。将分取的有效成份经干燥、化验、配比，混合过100目筛，包装，即为成品雷公藤多苷原粉。其中，雷公藤甲素的含量为0.10wt％，雷公藤内酯甲的含量为0.25wt％。将所用所有有机试剂回收循环使用。
实施例4雷公藤木质部经拣选、处理为小块，由粉碎机粉碎为粉末。称取150Kg粉末，置于多用提取锅中，用8倍重量的水搅拌均匀，在提取锅中直接通蒸汽加热至70℃-80℃，蒸煮50分，待冷却至常温，收集滤液。再加8倍的体积百分比60％正丁醇水溶液，浸泡20h，温度25℃，放出正丁醇提取液，以同样的方法再次加入体积百分比60％正丁醇水溶液，浸泡一次，合并提取液。
提取液抽至蒸馏锅，首先打开冷凝器和冷却器的进水阀门，再慢慢将反应锅夹道的冷却水放出，控制好蒸汽的流量和锅内温度70-100℃左右，直至药液中含正丁醇浓度小于体积百分比10％为止。
加入同浓缩液等体积的己烷回流提取三次，每次提取30min后，使己烷萃取液和原提取液分出上下两层，放出己烷萃取液，将三次萃取液合并，脱水过滤，常压蒸馏回收己烷。控制好锅内温度和压力，减压抽真空，真空度-0.07MPa以下，浓缩得疏松红棕色粉末即为雷公藤多苷粗品提取物。
将上步的雷公藤多苷粗粉用己烷，先溶解成溶液，然后缓缓加入混有己烷的硅藻土(100-200目)中，硅藻土的用量为粗品质量的18倍，搅拌进行吸附30分，过滤抽干，滤液为无效成份。
滤饼1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(体积百分比)的己烷的甲醇溶液梯度洗脱，溶液用量为以每克吸附剂为参照，1％的梯度，用量为3.5毫升；3％的梯度，用量为1.6毫升；5％的梯度，用量为2.8毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均为4.5毫升；15％的梯度，用量为5.5毫升。采用薄层层析和紫外364nm下检测，与标准品对照确认有效洗脱梯度。过滤抽干，将有效滤液浓缩，回收己烷，浓缩后得干浸膏，再进行二次吸附洗脱，浓缩至干，待柱层析备用。
在直径8cm左右层析柱中，先装入己烷少许，然后推入药棉(做成球状)置于柱底部铺平。湿法装硅胶，排尽柱内气泡，静置24h以上压实，开活塞放出硅胶剂上面多余的己烷，粒体开始收缩，自然压紧柱体。
用少量己烷溶解洗脱后浓缩的干粉，加入柱中，分别加入1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(体积百分比)的己烷的甲醇溶液液进行梯度洗脱，溶液用量为以每克吸附剂为参照，1％的梯度，用量为3.5毫升；3％的梯度，用量为1.6毫升；5％的梯度，用量为2.8毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均为4.5毫升；15％的梯度，用量为5.5毫升。用分瓶收集洗脱液。将收集的小瓶洗脱液分别点样于硅胶G板上进行薄层层析后，用紫外分析仪相应波长下鉴别洗脱液是否含有效成分，收取有效瓶样，将有效瓶样的洗脱液浓缩抽干得有效成份。将分取的有效成份经干燥、化验、配比，混合过100目筛，包装，即为成品雷公藤多苷原粉。其中，雷公藤甲素的含量为0.11wt％，雷公藤内酯甲的含量为0.25wt％。将所用所有有机试剂回收循环使用。
实施例5雷公藤木质部经拣选、处理为小块，由粉碎机粉碎为粉末。称取150Kg粉末，置于多用提取锅中，用8倍重量的水搅拌均匀，在提取锅中直接通蒸汽加热至60℃-70℃，蒸煮40分，待冷却至常温，收集滤液。再加8倍的体积百分比80％乙醇水溶液，浸泡10h，温度20℃，放出正丁醇提取液，以同样的方法再次加入体积百分比80％乙醇水溶液，浸泡一次，合并提取液。
提取液抽至蒸馏锅，首先打开冷凝器和冷却器的进水阀门，再慢慢将反应锅夹道的冷却水放出，控制好蒸汽的流量和锅内温度70-100℃左右，直至药液中含乙醇浓度小于体积百分比10％为止。
加入同浓缩液等体积的乙酸乙酯回流提取三次，每次提取60min后，使乙酸乙酯萃取液和原提取液分出上下两层，放出乙酸乙酯萃取液，将三次萃取液合并，脱水过滤，常压蒸馏回收乙酸乙酯。控制好锅内温度和压力，减压抽真空，真空度-0.07MPa以下，浓缩得疏松红棕色粉末即为雷公藤多苷粗品提取物。
将上步的雷公藤多苷粗粉用丙酮，先溶解成溶液，然后缓缓加入混有丙酮的硅藻土(100-200目)中，硅藻土的用量为粗品质量的20倍，搅拌进行吸附30分，过滤抽干，滤液为无效成份。
滤饼1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(体积百分比)的四氯化碳的乙醇溶液梯度洗脱，溶液用量为以每克吸附剂为参照，1％的梯度，用量为3毫升；3％的梯度，用量为1.7毫升；5％的梯度，用量为2.2毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均为4.2毫升；15％的梯度，用量为4.5毫升。采用薄层层析和紫外364nm下检测，与标准品对照确认有效洗脱梯度。过滤抽干，将有效滤液浓缩，回收四氯化碳，浓缩后得干浸膏，再进行二次吸附洗脱，浓缩至干，待柱层析备用。
在直径8cm左右层析柱中，先装入己烷少许，然后推入药棉(做成球状)置于柱底部铺平。湿法装硅胶，排尽柱内气泡，静置24h以上压实，开活塞放出硅胶剂上面多余的己烷，粒体开始收缩，自然压紧柱体。
用少量四氯化碳溶解洗脱后浓缩的干粉，加入柱中，分别加入1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(体积百分比)的四氯化碳的乙醇溶液进行梯度洗脱，溶液用量为以每克吸附剂为参照，1％的梯度，用量为3毫升；3％的梯度，用量为1.7毫升；5％的梯度，用量为2.2毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均为4.2毫升；15％的梯度，用量为4.5毫升。用分瓶收集洗脱液。将收集的小瓶洗脱液分别点样于硅胶G板上进行薄层层析后，用紫外分析仪相应波长下鉴别洗脱液是否含有效成分，收取有效瓶样，将有效瓶样的洗脱液浓缩抽干得有效成份。将分取的有效成份经干燥、化验、配比，混合过100目筛，包装，即为成品雷公藤多苷原粉。其中，雷公藤甲素的含量为0.10wt％，雷公藤内酯甲的含量为0.25wt％。将所用所有有机试剂回收循环使用。
效果实施例高效液相色谱测定雷公藤甲素和雷公藤内酯甲含量(仪器Agilent.1100Series高效液相色谱仪)(一)雷公藤甲素测定1、对照品溶液的制备取雷公藤甲素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每毫升约含50ug的溶液。
2、供试品溶液的制备取各厂家雷公藤多苷片各50片，取约1.5克，精密称定，加入乙酸乙酯10mL溶解，称重，超声提取，再称重加乙酸乙酯补足损失量，摇匀，离心(3000r/min)。精密吸取上清液5mL，加至用乙酸乙酯湿法装好的中性氧化铝(3g内径1cm，70-350目)柱上(室温条件下)，用乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发仪蒸除乙酸乙酯，残渣以甲醇转移至5mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
3、测定精密吸取供试品溶液10μL，照HPLC法(中国药典2005年版一部)操作。色谱条件柱温30℃，流动相甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾(3565)，流速1.00mL/min。在225nm波长处测定供试品和对照品的峰面积，计算即得。
(二)雷公藤内酯甲测定1、对照品溶液的制备取雷公藤内酯甲对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每毫升中约含0.1mg的溶液。
2、试品溶液的制备取各厂家雷公藤多苷片各50片，取约1.5克，精密称定，加入乙酸乙酯10mL溶解，称重，超声提取，称重并加入乙酸乙酯补足损失量，离心(3000r/min)。精密吸取上清液5mL至已用乙酸乙酯湿法装好的中性氧化铝(3g，内径1cm，70-350目)柱上(室温条件下)，用乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发除去乙酸乙酯，残渣以甲醇转移至5mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
3、测定精密吸取供试品溶液20μL，照HPLC法(中国药典2005年版一部附录)操作。色谱条件柱温30℃，流动相甲醇-乙晴-水(60∶25∶15)，流速1.0mL/min。在210nm波长处测定供试品和对照品的峰面积，计算即得。
标准曲线的制备分别精密称取雷公藤甲素和雷公藤内酯甲对照品8.15mg、6.04mg，用甲醇溶解并定容至25mL作为储备液。分别精密吸取储备液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL和0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0置5mL量瓶中，按色谱条件与系统适用性试验。分别绘制曲线，并计算得回归方程Y1＝1714.2X+0.7818，Y2＝507.02X-0.0258；R1＝1.0000，R2＝0.9998。表明在0.163～1.630μg、0.484～4.840μg之间两者有较好的线性关系(见图1和图2)。
表1 雷公藤甲素标准曲线测定

表2 雷公藤酯甲标准曲线测定

表3给出了由实施例1的方法5个批次制得的雷公藤多苷原粉制得的雷公藤多苷片和其他生产企业生产的雷公藤多苷片中雷公藤甲素和雷公藤内酯甲的含量对比。
表3 不同生产企业雷公藤多甙片甲素、内酯甲含量对比表

由表3数据看出，本发明的雷公藤多苷提取物制得的雷公藤多苷片与其他生产企业生产的雷公藤多苷片相比，其中所含雷公藤甲素和雷公藤内酯甲的含量及比例有较大不同，处于适中的范围。由以上两种可检测成分为代表表明，本发明的雷公藤多苷提取物制得的雷公藤多苷片中药效成分含量及比例适中。
由下述双倍剂量雷公藤多苷治疗原发性肾病综合症的实验表明由本发明的方法制得的雷公藤多苷药理效果好，毒副作用小。
1 对象和方法1.1病例选择18例患者均符合以下条件①临床表现为单纯NS，无或仅有很少量镜下血尿，肾功能正常，无感染及血栓等并发症。其中一部分患者曾用激素治疗；②组织学改变为系膜增生性病变；③无肝功能异常，外周血白细胞计数正常；④排除继发性肾小球肾炎。其中男性13例，女性5例，平均年龄24.4±8.6岁，病程半个月～12年。治疗前的临床情况见表1。
18例患者的肾活检组织学诊断①IgA肾病(IgAN)8例，有5例以往曾接受激素治疗，2例敏感，3例无效；②IgM肾病(IgMN)4例，2例用过激素敏感；③系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)6例，以往3例用过激素，1例敏感，2例无效。
1.2 治疗方法1.2.1 T II 泰州制药厂生产雷公藤多甙片(本发明的雷公藤多苷片)1.2.2 给药方案起始剂量2mg/(kg.d)分三次餐后口服(一般为10mg/片，4片，每日三次)，持续4周后改为1.5mg/(kg.d)×4周后减至1mg/(kg.d)维持。
1.3观察项目①临床观察浮肿、尿量变化，消化道反应，有无皮疹等；②实验室检查尿量，尿蛋白定量；外周血象；肝肾功能及血浆蛋白等每周检查一次，部分患者治疗前进行尿蛋白SDS-PAGE平板电泳，分析尿蛋白组成。
1.4疗效判断①缓解尿蛋白消失或降至微量，定量在0.4g/24h以下；②改善尿蛋白比治疗前减少50％以上；③无效未达上述标准。
2 结果2.1双倍剂量T II对NS的疗效本组18例原发性肾小球肾炎，治疗后的临床情况见表4。共有15例得到完全缓解，占83.3％(见表5)。8例IgAN中7例缓解(占87.5％)，1例改善。6例MsPGN中5例缓解(83.3％)，4例IgMN 3例缓解(75.0％)。18例中有5例以往曾用足量激素治疗无效但经大剂量T II治疗后获得缓解。本组中有1例IgMN和1例MsPGN对T II无效。在缓解的15例中，治疗1周即缓解者有4例，治疗2周缓解者有8例，因此共有12例(占缓解组的80％)在治疗2周内尿蛋白消失(见表6)。原有浮肿、尿少的患者在服用T II后，可见明显的利尿反应，浮肿很快消失。在1例T II治疗无效的IgMN，尽管蛋白尿没有明显减少，但尿量明显增加，浮肿也迅速消退。
表4 一般临床情况及实验室检查结果

表5 T II对不同病理类型NS的疗效

表6 患者症状缓解出现时间

2.2 T II疗效与尿蛋白成份的关系11 例患者治疗前进行了尿液SDS2PAGE平板电泳检查，发现缓解组患者的尿蛋白主要为白蛋白，无高分子及小分子蛋白质，而非缓解组尿蛋白组成中含有较多分子量＜2万的蛋白质(占8.5±4.6％)，同时存在较多大分子尿蛋白(占21.0±14.7％)。
2.3 双倍剂量T II治疗的副反应治疗中仅有个别病例有恶心、呕吐或有食欲下降等胃肠不适，本组18例患者均能很好地耐受双倍剂量T II治疗。客观检查少数病例在治疗初期SGPT短暂轻度升高(仅1例＞100U/L)，继续治疗后又恢复正常，无血清胆红素升高。无一例出现白细胞减少至215×109/L以下，仅1例WBC降至3.1×109/L，但未影响治疗。在观察期内，所有病例肾功能保持正常(见表7)。
表7 治疗的副反应(n＝18)

2.4 双倍剂量治疗后的复发情况2例患者在使用T II 2mg/(kg.d)4周，临床症状缓解后将T II剂量迅速减至1mg/(kg.d)，给药2周后NS均复发。另2例患者在尿蛋白缓解后随访过程中因上感蛋白尿加重，继续应用双倍剂量治疗后尿蛋白消失。其余病例正在随访中，尚未见复发者。
权利要求
1.一种雷公藤多苷的提取方法，其特征在于包括如下步骤(1)提取粗品将雷公藤粉末用水煮提取，再用醇或醇的水溶液提取，将提取液合并，浓缩至醇含量小于或等于体积百分比20％，之后用有机溶剂萃取，制得含粗品的萃取液，浓缩至干得粗品；(2)粗品精制用有机溶剂溶解粗品，加入吸附剂进行吸附，过滤，将滤饼用梯度有机溶剂的溶液进行洗脱，收集有效部分的洗脱液，浓缩，再进行柱层析，用梯度有机溶剂的溶液进行洗脱，收集含有效成分的洗脱液，浓缩至干，即得精制雷公藤多苷。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的水煮提取的次数为1～3次；所述的醇或醇的水溶液提取的次数为1～3次；所述的萃取的次数为1～3次；步骤(2)中，所述的向含粗品的萃取液中加入吸附剂进行吸附，过滤，将滤饼用梯度有机溶剂进行洗脱，收集有效部分的洗脱液的步骤的次数为1～2次。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的水煮的温度为50～100℃ 水煮的时间为30～60分。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的醇或醇的水溶液提取的温度为20～50℃；醇或醇的水溶液提取的时间为8～24小时。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的水的用量为雷公藤粉末重量的3～10倍；所述的醇或醇的水溶液的用量为雷公藤粉末重量的6～10倍；所述的萃取用的有机溶剂的用量为提取液浓缩后体积的1～3倍。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的醇的水溶液中醇的浓度为体积百分比40％以上。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的萃取每次的时间为30～60分钟。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，所述的吸附剂为硅胶、中性氧化铝、纤维素或硅藻土。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，所述的吸附剂的用量为粗品质量的10～20倍。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，所述的吸附的时间为30～60分。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的有机溶剂为石油醚、卤代烷烃、环烷烃、烷烃、低级脂肪酮或酯。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，所述的梯度有机溶剂的溶液为梯度在体积百分比1～20％间的卤代烷烃或烷烃的醇溶液，或梯度在体积百分比1～20％的环烷烃的丙酮溶液，或能够达到同样展开效果的其它梯度有机溶液。
13.如权利要求11或12所述的方法，其特征在于所述的卤代烷烃为二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿或四氯化碳；所述的环烷烃为环己烷或环戊烷；所述的烷烃为己烷或戊烷；所述的低级脂肪酮为丙酮或甲乙酮；所述的酯为乙酸乙酯。
14.如权利要求1或12所述的方法，其特征在于权利要求1的步骤(1)中或权利要求12中，所述的醇为甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，所述的梯度有机溶剂的溶液及每个梯度的溶液的用量为以每克吸附剂为参照，1％的梯度，用量为3～4毫升；3％的梯度，用量为1.5～2毫升；5％的梯度，用量为2～3毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均为3～5毫升；15％的梯度，用量为4～6毫升；百分比为体积百分比。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，所述的有效部分的洗脱液以采用薄层层析和紫外364nm下检测，与标准品对照进行确认。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于将所述的醇和/或有机溶剂回收，循环使用。
18.如权利要求1所述的方法制得的雷公藤多苷。
19.含有如权利要求18所述的雷公藤多苷的药物组合物。
全文摘要
一种雷公藤多苷的提取方法，包括(1)提取粗品将雷公藤粉末用水煮提取，再用醇或醇的水溶液提取，合并提取液，浓缩至醇含量≤体积百分比20％，再用有机溶剂萃取，浓缩至干得粗品；(2)粗品精制用有机溶剂溶解粗品，加入吸附剂进行吸附，过滤，将滤饼用梯度有机溶剂的溶液进行洗脱，收集有效部分的洗脱液，浓缩，再进行柱层析，用梯度有机溶剂的溶液进行洗脱，收集含有效成分的洗脱液，浓缩至干即可。本方法操作简便，成本低，生产周期短，所用试剂可循环使用，对环境污染少，易应用于大规模的工业生产。本发明还公开了由上述方法制得的雷公藤多苷及其药物组合物。该产品药效成分含量高，含量比例适度，药理效果好。
文档编号A61P13/00GK101088519SQ20071004385
公开日2007年12月19日 申请日期2007年7月17日 优先权日2007年7月17日
发明者林健 申请人:上海美通生物科技有限公司, 江苏美通制药有限公司