专利名称：与白喉毒素免疫相关的蛋白质分子的药物应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质分子在用于治疗动脉粥样硬化以及用于治
疗和/或预防与动脉粥样硬化相关的另外的病理特征(pathologies ) 中的应用。
背景技术：
心血管系统的病理特征现在是中等至高度工业化国家中死亡 的最重要原因之一。
动脉粥样硬化是一种心血管病理特征，其特征在于动脉的石更化 和变狭窄，当变老时，其发生在大多凄t人中。动月永粥样石更化通常并 不显示症状直到在血管内的流动已严重受损。动月永粥样石更化的典型 症状包括胸痛，其时涉及冠状动脉，或力逸痛，其时涉及腿动脉。动 脉粥样硬化的可能并发症包括卒中(中风)、坏死、以及冠状动脉
病(其一种症状是心绞痛)H半随局部^:血和一更死)。
基于上述，4艮显然仍然非常需要制备可用于治疗动脉粥样石更化 以及相关的病理4寺4正的药物。
发明内容
本发明的 一个目的是在治疗动脉粥样硬化和相关病理特4正方 面提供新的可能性。
根据本发明，提供了用于治疗动脉粥样硬化和相关病理特征的 方法以及白喉毒素衍生物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗
动月永粥辨J更4b和相关病理特4正，如在本描述后面的独立4又利要求中 所要求的，以及，优选地，在直接或间接从属于独立权利要求的任 何单个权利要求中所要求的。
除非有相反的明确陈述，下列术语具有以下指出的含义。
在本文中，两个氨基酸序列之间的"同 一性百分比"和"同 一性
%，，是指在最佳序列对比(optimum alignment)时在两个序列的相应 位置中相同氨基酸残基的百分比。
为了确定两个氨基酸序列或核酸的"同 一性百分比"，对序列进 行相互序列对比以达到最佳比较。可以将间隙(gap )(即，删除或 插入)引入到序列中。然后比较在相应位置的氨基酸。当在第一序 列的位置被在第二序列中占据相应位置的相同氨基酸占据时，分子 在所述位置是相同的(即，^立置是相同的)。两个序列之间的同一 性百分比是序列共有的相同位置数目的结果[即，同一性百分比=(相 同位置的数目/位置的总数)x ioo]。根据一种优选的实施方式，序 列具有相同长度。
比较的序列可以呈现(存在)间隙。
可以借助于数学算法来获得同 一性百分比。用于两个序列比较 的数学算法的 一 个非限制性实例是Karlin和Altschul的算法[(1990),Proc. Natl Acad Sci USA 87: 2264-2268],其由Karli和Altschu1[(1993). Proc. Natl Acad Sci USA 90: 5873-5877]加以改进。这样的算法结合 在Altschul，s BLASTn和BLASTp程序中[Altschul, et al， (1990). J Mol Biol 215: 403-410]。
为了在存在一个或多个间隙的情况下同样获得序列对比，可以 使用这样的方法，其将相对较高罚分(处罚，penalty)赋予给每个 间隙并将较低罚分赋予给间隙中的每个另外的氨基酸残基或核苷 酸(这样的另外的氨基酸残基或核苷酸被定义为间隙的延伸)。显 然，高罚分将确定具有更小数目间隙的优化序列对比。
适合于实现这种类型的序列对比的程序的实例是Altschul等人 描述的BLAST程序[(1997). Nucleic Acids Res 25: 3389-3402]。为 此，可以和默i人参凄t一起4吏用BLASTn e BLASTp程序。当4吏用 BLAST程序时，通常采用矩阵BLOSUM62。
用于获得最佳序列对比的程序的优选的和非限制性实例是 GCG Winsconsin Bestfit包[University of Winsconsin, USA; Devereux et al.(1984). Nucleic Acids Research 12:387]。在这种情况下同才羊4吏用 了默认参凄t,即，对于氨基酸的序列，预见对于间隙-12的罚分以 及对于每个延伸-4的罚分。
在本文中，"同源位置"是指具有两个同源氨基酸的位置，即赋 予类似理化性质的氨基酸。例如，属于相同组的氨基酸如芳香族 的(Phe、 Trp、 Tyr)，酸性的(Glu、 Asp),才及性的(Gln、 Asn),石咸性 的(Lys、 Arg、 His)，月旨肪力臭的(Ala、 Leu、 Ile、 Val),具有一个羟基 基团(Ser、 Thr)，具有短侧链(Gly、 Ala、 Ser、 Thr、 Met)。可以预 期，这样的同源氨基酸之间的置换将不会改变蛋白质的表型(氨基 酸的保守性(preservative)置换)。保守性置换的具体实例在本技术领域是众所周知的并描述在各种著作中[例如，Bowie et al. (1990). Science 247:1306-1310]。
在本文中，"严格条件"是指，优选地，在50°C下，用緩冲液 SSC ( 0.15 M氯化钠溶液和20 mM 4宁4蒙酸钠)和0.1 % SDS (十二 烷基硫酸钠)洗涤1小时。可替换地，过去已描述了"严格条 件，，[Ausubel F M et al. eds. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Tnc. and John Wiley & Sons Inc. New York]。
在本文中，"药用衍生物"是指盐或复合物(即， 一种化合物， 其中一个或多个分子或离子与一个或多个金属原子或金属离子形 成一个或多个配价4建)，其保持初始分子的生物性能。用于制备这 样的衍生物的方法的非限制性实施包括下列各项将无才几酸(例如， 盐酸、氢溴酸、 一琉酸、 -畴酸等)或有才几酸(例如，乙酸、草酸、马 来酸、间石黄酸(metasulfonic acid)、水杨酸、琥珀酸、4宁碎蒙酸等) 加入到初始分子的游离碱中；用金属阳离子(例如，碱金属的阳离 子或铝的阳离子等)置换初始分子的质子酸；将最初化合物的质子 酸转移到有机石咸(例如，二甲胺、三乙胺等)中；以及配位于这样 的有枳J威。除非有相反的^L定，为本发明主题的分子理解为包4舌它 们的"药用衍生物"。
将参照附图，通过举例方式来描述本发明的非限制性实施方 式，其中
图1和图2分别示出了用CRM197治疗前后在实施例3的患者 上获得的彩色多普勒图像。
具体实施例方式
根据本发明的第 一方面，提供了 一种用于治疗哺乳动物的动脉 粥才羊石更化和/或用于治疗或预防与哺乳动物的动"永粥样^更化相关的
病理特征的蛋白质分子；以及蛋白质分子在用于治疗哺乳动物的动 月永粥才羊^更^ft和/或用于治疗或予贞防与哺乳动物的动力永粥辨^更4b相关 的病理特征中的应用。尤其是，根据本发明的另一方面，提供了蛋 白质分子在用于制备用于治疗哺乳动物的动脉粥样硬化和/或用于 治疗或预防与哺乳动物的动脉粥样硬化相关的病理特征的药物制 剂中的应用。
与动"永粥样石更化相关的病理特4正包括卒中、坏死以及冠状动 脉病(伴随局部缺血和梗死)。尤其是，局部缺血还可以是肾缺血、 月申在夹血、以及脑血管在夹血。
蛋白质分子与CRM197的序列具有，优选地，至少90%的同一 性，包括第一和第二二硫桥(disulfide bridge),两个片段，两者借 助于第一二碌^桥^皮此相连，并且在位置52处具有谷氨酸。
CRM197是由白喉杆菌的突变株产生的毒素[Uchida T， Pappenheimer AM Jr， Greany R (1973). Diphtheria toxin and related proteins. I. Isolation and properties of mutant proteins serologically related to diphtheria toxin. J Biol Chem 248: 3838-3844],基本上是非 毒性的(参见Uchida等人，上文)，目前被用作幼儿疫苗的载体(尤 其是，参见，Bartolozzi G， Rappuoli R.. I vaccini, UTET， 2001. pp 114, 164 )，与白喉毒素的区别是在位置52处存在谷氨酸而不是甘氨酸， 并且以Sigma-Aldrich^出售(用于实-睑室用)，其具有编号CAS 92092-36-9禾口纟扁号MDL MFCD00166638。 ^口众戶斤周^口的，白口侯毒 素是由白喉杆菌产生的毒素。已描述了白喉蛋白质的序列和结构 [Delange R J， Drazin R E, and Collier R J (1976). Amino画acid sequenceof fragment A， an enzimatically active fragment from diphtheria toxin. Proc Nat Acad Sci USA 73: 69-72， and: Falmagne P, Capiau C， Lambotte P et al. (1985). The complete amino acid sequence of diphtheria toxin fragment B. Correlation with its lipid-binding properties. Biochim Biophys Acta 827: 45-50〗。可以通过由Park H W 和Williams A W[J Exp Med 1:164-185]描述的相同方法并利用先前 提及的白喉杆菌的突变抹(参见Uchida等人，上文)来产生 CRM197。
根据格外优选的实施方式，蛋白质分子与CRM197的序列应具 有至少92%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%以及100%的同 一性。在蛋白质分子和CRM 197显示一个或多个不同^f立置的'清况 下，优选i也，这些不同4立置中的至少一个应是同源的；更^尤选;t也， 该不同位置应是同源的。
优选地，蛋白质分子包括在位置186处的第一半胱氨酸以及在 位置201处的第二半胱氨酸。通过第一二硫桥将第一和第二半胱氨 酸连4妄在一起。蛋白质分子包括在4立置461处的第三半胱氨酸和在 位置471处的第四半胱氨酸。借助于第二二硫桥，将第三和第四半 月光氨酸连〗妻在一起。
蛋白质分子通过下述起作用将本身附着于HB-EGF[Raab Q Klagsbmn H (1997). Heparin-binding EGF-like Growth Factor, Biochim Biophys Acta 1933: 179-199]以及以这才羊的方式刺激免疫系 纟充以吸引(引i秀，attract) 4元体禾口白纟田月包(Harrison's Principles of Internal Medicine, ninth edition, pp 672-674 )。 HB-EGF是一种肝素结 合生长因子，其能够激活EGFR (表皮生长因子受体)的两种亚型 (HER1和HER4)并通常过度表达在某些病理过禾呈如动"永粥才羊石更 <匕中[Miyagawa JI， Higashiyama S, Kawata S, et al. (1995). Localization of heparin-binding EGF-like growth factor in the smoothmuscle cells and macrophages of human atherosclerotic plaques. J Clin Invest 95: 404-411]。
因此，优选地，该分子能够在严格条件下将本身附着于 HB-EGF ，以及以这才羊的方式刺激免疫反应以吸引抗体和/或白细月包。
根据本发明的另一方面，提供了一种药物制剂，该药物制剂包 含如上所定义的蛋白质分子、或其药用衍生物之一，以及U武形剂和 /或药用稀释剂。
根据本发明的另 一方面，提供了 一种用于治疗哺乳动物的动脉
粥才羊石更^:和/或治疗或予贞防与哺乳动物的动力永粥4羊石更4b相关的病理 特征的方法。该方法预知将有效剂量的如上文所定义的蛋白质分子 纟会予哺乳动物。
优选地，通过皮下注射给予蛋白质分子。以这种方式，可以大 大地降低超敏感受治疗者中立即免疫反应的危险。
根据优选的实施方式，该方法包括第一阶段的给药，其中每第 一规定的期间将一剂量的分子给予患者。第 一规定的期间在两天到 四天之间。优选地，第一夫见定的期间为大约三天。第一阶,殳的《合药 的持续时间在十天到三十天之间。优选地，第一阶,殳的持续时间应 为大约十八天。
优选地，该方法包括第二阶段的给药，其是在第一阶段的给药 之后。在第二阶段，在每个第二规定的期间以后给予一剂量的分子。
第二规定的期间在一个月到三个月之间。更优选地，第二^L定的期
间为大约二个月。第二阶段的持续时间在四个月到八个月之间。更 优选地，第二阶段的持续时间应是大约八个月。优选地，每个单一剂量在0.5到4.0 mg之间，更优选地，在0.5 到3.6 mg之间，甚至更4尤选i也在0.5 5'J 3.0 mg之间。
优选地，该方法包括在第一阶段的给药以前的预治疗阶段，目 的在于确定呈现即刻型超每文感性(ITH)或迟发型超每丈感性(DTH) 的患者。先前已详细描述了预治疗阶萃殳[Buzzi S, Rubboli D, Buzzi G， et al. (2004). CRM197 (non-toxic diphtheria toxin): effects on advanced cancer patients. Cancer Immunol Immunother 53:1041-1048]。 当在给 予蛋白质后的几分钟内在注射部位发展痒疹和红斑反应时，以及当 IgE的7jc平高于500ng/mL时，则显示ITH习犬态。
当在《合予蛋白质后24小时内在注射部位发展痒渗和红斑反应 时，则显示DTH状态。
在本文中完全参考上述引用的参考文献(论文，教科书等)的 内容，以获得完整4皮露内容。
根据随后 一 些仅说明性的和非限制性的实施例的描述，本发明 的进一 步的特4正将是显而易见的。
尤其是，以下实施例说明上面所定义的蛋白质分子的使用如何 惊人地？I起动脉粥样硬化性斑块非常相关的减小，因此可以改善相 关的病理特征。以下实施例还表明，上面所定义的蛋白质分子具有 极低的毒性(如上文Uchida等人已经说明的)。
实施例1
稀释CRM197直到在经灭菌的磷酸緩冲液(10-mM磷酸钠緩 冲液，pH 7.2 )中达到3.0 mg/mL的浓度，其中石粦酸纟爰冲液包含10% 蔗糖作为稳定剂。将最终产物等分在无热原小瓶中并贮存在-20。C 下。实施例2
用剂量为3.5 mg的CRM197治疗患有右颈内动脉55。/。狭窄(超 声检查)的68岁老人，其中CRM197如在实施例1中所描述的加 以配制并隔天给予，6次。每两个月《会予患者进一步的剂量，如第 一剂量，时间为6个月。18月以后，超声彩色多普勒表明最初狭窄 减少27% (通过已经由相同内科医生使用的超声仪^r测和监测了本 i兌明书中引用的所有颈动月永狭窄的病例)。
实施例3
用剂量为3.5 mg的CRM197对患有右颈内动月永(混合性斑块) 40%《夹窄(NASCET )和总左颈动乐;K ( common left carotid )(寿欠扭王^:) 67.8°/。狭窄的74岁老人进4亍治疗，其中CRM197如在实施例1中所 描述的加以配制并隔天给予，6次(左颈内动月永和右颈总动月永4又显 示内膜变厚)。每两个月，将进一步的剂量，如第一剂量，给予患 者，6次。对于白喉毒素和CRM197，患者显示出体液免疫和中等 迟发型超敏感性。治疗以后，由患者呈现的仅有副作用是在注射部 位发展痒务红斑。
治疗以后，对患者定期一佥查58个月。在开始治疗14个月以后， 观测到左颈总动脉的狭窄减少8%。在开始治疗25个月以后，观测 到左颈总动脉的狭窄减少15%。在开始治疗58个月以后，观测到 右颈内动脉的狭窄减少71.5%以及左颈总动脉的狭窄减少93.3%。
图1涉及在治疗前进4亍的左颈总动"永的超声4企查。该超声4企查 4吏得可以确定动月永切片的总面积为0.59 cm2、整个切片的周长为2.8 cm、清晰的血流面积(腔)为0.19cm2、清晰面积(腔)的百分比 为32.2%、以及纟夹窄面积、的百分比为67.8%。图2涉及在治疗后58个月进行的左颈总动月永的超声4全查。该 超声检查使得可以确定动脉切片的总面积为40.62 mm2、清晰的血 流面积(腔)为38.68 mm2、清晰面积(腔)的百分比为95.5%、 以及狭窄面积的百分比为4.5%。
实施例4
用剂量为1.7 mg的CRM197对患有右颈内动月永(混合性斑块) 65%狭窄(NASCET)和左颈内动月永(混合性斑块)40%狭窄 (NASCET)的74岁老年妇女进行治疗，其中CRM197如在实施 例1中所描述的加以配制并隔天给予，6次。每两个月给予进一步 的剂量，如第一剂量，时间为6个月。
只于于白喉毒素和CRM197，患者未显示出免疫活性。
在开始治疗8个月以后，观测到右颈内动脉的狭窄减少46%， 而左颈内动月永的3夹窄减少50%。
实施例5
用剂量为1.7 mg的CRM197只于患有右颈内动月永59%3夹窄 (NASCET)和左颈内动脉(分别为软斑块和^5更斑块))20%狭窄 (NASCET)的79岁老人进行治疗，其中CRM197如在实施例1
中所描述的加以配制并隔天给予，6次。每两个月，将进一步的剂
量，如第一剂量，给予患者，时间为6个月。
对于白喉毒素和CRM197,患者并没有显示出4壬何免疫活性。
在开始治疗8个月以后，观测到右颈内动脉的狭窄减少90%以 及左颈内动脉的狭窄减少30%。实施例6
用剂量为1.7 mg的CRM197 5十患有右颈内动月永60%狭窄 (NASCET)和左颈内动脉(混合性斑块)55%狭窄(NASCET) 的65岁妇女进行治疗，其中CRM197如在实施例1中所描述的加 以配制并隔天给予，6次。每两个月，将进一步的剂量，如第一剂 量，给予患者，时间为6个月。
对于白。娱毒素和CRM197,患者并;;殳有显示出^f壬^r免疫活性。
在开始治疗60个月以后，纟現测到右颈内动月永的3夹窄减少30% 以及左颈内动月永的狭窄减少25%。
实施例7
用剂量为3.5 mg的CRM197 ^f患有右颈内动万永60%3夹窄 (NASCET)和左颈内动月永(混合性斑块)40%3夹窄(NASCET) 的78岁妇女进4亍治疗，其中CRM197如在实施例1中所描述的加 以配制并隔天》会予，6次。每两个月，将进一步的剂量，如第一剂 量，给予患者，时间为6个月。
对于白喉毒素和CRM197，患者显示出强体液免疫。
在开始治疗60个月以后，观测到右颈内动脉的狭窄减少40% 以及左颈内动月永的3夹窄减少30%。
权利要求
1. 蛋白质分子在用于制备用于治疗哺乳动物的动脉粥样硬化的药物制剂中的应用所述分子与CRM197的序列具有至少90％的同一性，包括第一和第二二硫桥、两个片段，通过所述第一二硫桥将它们连接在一起，以及具有在位置52处的谷氨酸。
2. 根据权利要求1所述的应用， 序列具有至少95%的同一性。
3. 根据权利要求2所述的应用， 序列具有至少97%的同一性。
4. 根据权利要求3所述的应用， 序列具有至少98%的同一性。
5. 根据权利要求4所述的应用， 序列具有至少99%的同一性。其中，所述分子与CRM197的其中，所述分子与CRM197的其中，所述分子与CRM197的其中，所述分子与CRM197的
6. 根据前述权利要求之一所述的应用，其中，在所述分子和 CRM197具有一个或多个不同位置的情况下，这些不同位置中 的至少一个是同源位置。
7. 根据权利要求6所述的应用，其中，所有所述不同位置是同源 的。
8. 根据权利要求5所述的应用，其中，所述分子是CRM197。
9. 根据前述权利要求之一所述的应用，其中，所述分子包括在位 置186处的第一半胱氨酸和在位置201处的第二半胱氨酸；所 述第一和第二半胱氨酸通过所述第一二石克桥而连接在一起。
10. 才艮据前述片又利要求之一所述的应用，其中，所述分子包4舌分别 在位置461和471处的、通过所述第二二辟u桥连4妄在一起的第 三和第四半胱氨酸。
11. 蛋白质分子在用于制备用于治疗哺乳动物的动脉粥样-更化的 药物制剂中的应用，所述蛋白质分子能够在严格条件下将本身 附着于HB-EGF以及能够以这样的方式刺激免疫系统的应答 以吸引抗体和/或白细i包。
12. 根据权利要求11所述的应用，其中，所述分子根据权利要求 1至10之一进4亍限定。
13. 蛋白质分子在用于制备用于治疗和/或预防哺乳动物的卒中的 药物制剂中的应用，所述蛋白质分子根据权利要求1至12之 一进行限定。
14. 蛋白质分子在用于制备用于治疗和/或预防哺乳动物的梗死的 药物制剂中的应用，所述蛋白质分子根据权利要求1至12之 一进行限定。
15. 蛋白质分子在用于制备用于治疗和/或预防哺乳动物的冠状动 脉病理特征的药物制剂中的应用，所述蛋白质分子根据权利要 求1至12之一进行限定。
16. 蛋白质分子在用于制备用于治疗和/或预防哺乳动物的坏死的 药物制剂中的应用，所述蛋白质分子根据权利要求1至12之 一进4于限定。
17. 蛋白质分子在用于制备用于治疗和/或预防局部缺血的药物制 剂中的应用，所述蛋白质分子根据权利要求1至12之一进行 限定。
18. 如根据权利要求1至12所限定的蛋白质分子在用于治疗和/ 或预防哺乳动物的动月永粥才羊-更4b中的应用。
19. 如根据权利要求1至12之一所限定的蛋白质分子在用于治疗 和/或预防根据权利要求13至17所限定的病理特征中的应用。
20. 如才艮据一又利要求1至12之一所限定的用于治疗和/或预防哺乳 动物的动脉粥样硬化的蛋白质分子。
21. 如根据权利要求1至12之一所限定的用于治疗和/或预防根据 斗又利要求13至17所限定的病理特4i的蛋白质分子。
22. 包含根据权利要求1至12中任一项所限定的蛋白质分子或其 药用衍生物之一 以及赋形剂和/或药用稀释剂的药物制剂。
23. 用于治疗哺乳动物的动脉粥样硬化的方法，所述方法将根据权 利要求1至12所限定的有效剂量的蛋白质分子给予所述哺乳 动物。
24. 用于治疗如根据权利要求13至17之一所限定的病理特征的方 法，所述方法将根据权利要求1至12所限定的有效量的蛋白 质分子给予所述哺乳动物。
25. 根据权利要求23或24所述的方法，其中，通过皮下注射给予 所述分子。
26. 才艮据—又利要求23至25之一所述的方法，所述方法包括第一阶 段的给药，其中每个第 一规定的期间将一剂量的所述分子给予 患者，最初4寺续时间为10至30天，所述第一身见定的期间为两 天至四天。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中，所述第一阶,殳的给药的 持续时间为大约18天。
28. 根据权利要求24或25所述的方法，以及包括第二阶段的给药， 其中，在每个第二^见定的期间以后给予一剂量的所述分子，所 述第二规定的期间是1至3个月，所述第二阶段的给药的持续 时间是4至8个月。
29. 根据权利要求25至27之一所述的方法，其中，所述剂量是 0.5至4.0 mg。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中，所述剂量是0.5至3.0 mg。
全文摘要
提出了与白喉毒素免疫相关的蛋白质分子，用于治疗动脉粥样硬化和进一步相关的病理特征。
文档编号A61K35/66GK101460180SQ200680054823
公开日2009年6月17日 申请日期2006年5月31日 优先权日2006年5月31日
发明者西尔维奥·布齐 申请人:西尔维奥·布齐