与crm197有关的方法和组合物的制作方法
【专利说明】与CRM197有关的方法和组合物
[0001] 1 引言 本发明提供了产生白喉毒素的新型方法。特别地，本发明提供了产生无毒形式的白喉 毒素例如CRM197的新型方法。本发明还提供了包含白喉毒素或无毒形式的白喉毒素例如 CRM197的新型组合物。
[0002] 2 背景 CRM197蛋白质是安全有效的用于糖类的T细胞依赖性载体，并且目前用于许多不同 的称为缀合物疫苗的疫苗制剂中。白喉毒素是在由噬菌体β197感染后通过细菌白喉 棒状杆菌（产生的蛋白质内毒素。白喉毒素("DT"）和 CRM197两者均为许多疫苗的组分，所述疫苗如例如针对百日咳博德特氏杆菌（你ri/aieWa 破伤风梭菌（白喉棒状杆菌、乙型肝炎病毒和B型 流感嗜血杆菌(W0 9324148、W0 9700697、W0 02055105)。另 外，由于其与其结合可溶形式HB-EGF的能力有关的潜在抗肿瘤活性，已存在对CRM197日益 增长的兴趣（US2006/0270600A1)。
[0003]CRM197通过被不产生毒素的噬菌体i3197tox感染的白喉棒状杆菌产生。 0 197t〇X通过产生毒素的β棒状噬菌体的亚硝基胍诱变进行制备（Uchida，T.等人1971， NatureNewBiology233:8-11)。CRM197蛋白质是无毒形式的白喉毒素，但在免疫上与白 喉毒素无法区别。DT具有58. 350kDa的质量（CRM197 = 58. 415kDa)，并且由N末端A结 构域和C末端B结构域（21和37kDa)组成，所述N末端A结构域和C末端B结构域通过 连接Cysl86和Cys201的二硫桥连接。A片段在从其二硫键合的配偶体B片段释放后是毒 性的。全毒素通过在位置191-3处的连接肽处的轻度蛋白酶解产生切口是A片段活化的 必要条件。B片段没有明显的酶促活性，但是毒性所需的，可能是由于将全毒素靶向靶细 胞膜（BrokerM，CostantinoP，DeToraL，McIntoshED，RappuoliR:Biochemicaland biologicalcharacteristicsofcross-reactingmaterial197 (CRM197)，anon-toxic mutantofdiphtheriatoxin:useasaconjugationproteininvaccinesandother potentialclinicalapplications.Biologicals,2011,39 (4) :195-204. )〇
[0004] 受感染的白喉棒状杆菌培养物跨越胞质膜分泌CRM197蛋白质离开细胞进入培养 基内。CRM197蛋白质具有与白喉毒素大约相同的分子量，但通过结构基因中的单碱基变化 (鸟嘌呤至腺嘌呤）而与其不同。该单碱基变化引起成熟蛋白质中的氨基酸置换(谷氨酸置 换甘氨酸，G52E)，并且消除白喉毒素的毒性特性（GianniniG，RappuoliR，RattiG:The amino-acidsequenceoftwonon-toxicmutantsofdiphtheriatoxin:CRM45and CRM197.Nucleic Acids Res1984,12 (10) :4063-4069)〇
[0005]制备DT和CRM197 的方法在US4709017、US5843711、US5601827 和US5917017 中得到描述。目前存在用于CRM197的工业制备的三种不同系统。两种系统基于感染噬菌 体的白喉棒状杆菌细胞的使用。最近的开发由焚光假单胞菌 中的重组表达系统组成。该方法采用在遗传优化的荧光假单胞菌菌株中至周质的分泌方 法，使用配备用于分泌到周质内的信号肽的CRM197基因（US20110287443)。
[0006] 例如，从在好氧条件下在基于酪蛋白氨基酸和酵母提取物的培养基中生长的白喉 棒状杆菌菌株C7 (B197)和/或白喉棒状杆菌菌株C7 (B197)pPx350培养物中分离白喉毒 素。培养基组分的调整显示为改善得率（US4925792、W0 2006 100108)。CRM197或DT从 培养上清液中收获，并且通过超滤浓缩。硫酸铵沉淀是第一个纯化步骤，并且阴离子交换层 析是第二个纯化步骤。
[0007] 然而，用于疫苗中的大量的CRM197蛋白质的生产已由于低蛋白质丰度而受阻（TO 2006 100108)。
[0008] 使用不产生毒素的棒状噬菌体β197的双重溶素原加强CRM蛋白质生产的技 术已得到开发（IsolationandcharacterizationofC. diphtheriaenontandem doublelysogenshyperproducingCRM197.RRappuoli,Appl. Environ. Microbiol. S印tember1983 46:560-564 ;颁给R.Rappuoli的美国专利号 4, 925, 792 ;以及 Integrationofcorynebacteriophagesbetatox+，omegatox+，andgammatox-into twoattachmentsitesontheC. diphtheriaechromosome.RRappuoli，JLMichel 和JRMurphyJ你cierioZMarch1983 153:1202-1210)。Rappuoli报告了比来自单 重溶素原高直到三倍的来自双重和三重溶素原的CRM197得率。通过单重溶素原的CRM197 的生产水平是足够的，但对于利用CRM197蛋白质的疫苗生产在经济上不能令人满意。必须 指出为了增加白喉棒状杆菌中的表达效率的双重和三重溶素原菌株构建是需要费力的筛 选阶段的长期过程。
[0009] 开发了用于在白喉棒状杆菌中重组表达CRM197的质粒(美国专利5614382、 1995/5614382 _1997)。这使得能够增加基因的拷贝数(高达5-10个/细胞)，而无需选择 生成多溶素原的细菌菌株。
[0010] 如在被菌体β197tox感染的棒状杆菌属（菌株的情况下， CRM197在具有低亚铁含量的专门培养基中表达。尽管细菌菌株遗传处理所需的时间量中的 降低，但通过与使用双重溶素原的比较，CRM197的输出未显著增加。
[0011]DT的替代表达宿主细胞包括伤寒沙门氏菌（疫苗株cvd 908-htra(OrrN，GalenJE,LevineMM:Expressionandimmunogenicityofamutant diphtheriatoxinmolecule，CRM197,anditsfragmentsinS. typhivaccinestrain CVD908-htrA.In fee t Immun1999，67 (8) :4290-4294 )。沙门氏菌属是 革兰氏阴性菌和与大肠杆菌（AcoJi)相似的表达宿主。来自evd908-htra中的多种构 建体(含、不含信号肽)的表达水平很低，并且可溶性和免疫原性很弱。利用溶血素操纵子的 替代的非Sec依赖性易位系统改善可溶性DT的表达，但水平仍很低。
[0012] 关于在大肠杆菌中生产CRM197的报告显示可溶性CRM197的低得率和在包涵体 中的不溶性产物的形成。截短方法已用于增强表达至更高水平的尝试中。（BishaiWR， MiyanoharaA,MurphyJR:CloningandexpressioninE. coliofthreefragments ofdiphtheriatoxintruncatedwithinfragmentB.Journal of Bacteriology 1987,169 (4):1554-1563)。
[0013] 使用含有编码CRM197的突变白喉毒素基因的CRM197单链表达质粒用于在 大肠杆菌中表达（BishaiWR，RappuoliR，MurphyJR:High-levelexpressionofa proteolyticallysensitivediphtheriatoxinfragmentinEscherichia coli. Journal〇/ 你cieriWo# 1987,169 (11) :5140-5151;Bishai1987)。在该出版物中，CRM197的转录受内源和组成型Ptox启动子控制。另外，C末端与α黑色素细胞刺激激素 融合的DT("ΑΒΜ508"）通过用于表达的热诱导型Ρ?3"ω?1启动子或Pi3e启动子进行表达。
[0014]Bishai1987推测由于高水平蛋白质诱导的分泌器官干扰引起在诱导周质DT/ CRM197变体表达后的生长停止。这可以是周质蛋白质表达中的一般问题，其已先前得到 观察且导致蛋白质的低体积得率（BensonSA，HallMN，SilhavyTJ:Geneticanalysis ofproteinexportinE. coliK12.Annual Review of Biochemistry1985， 54:101-134)。分泌器官的干扰和不溶性蛋白质的形成提示大肠杆菌细胞不能提供CRM197 生物发生的生产性易位和折叠环境。
[0015] 因此，Bishai1987推理周质表达将避免易位子干扰。因此，Bishai1987去除用 于将表达导向细胞质内的信号肽。仅在低温下且当细胞质蛋白酶缺失时，细胞质表达构建 体才的确获得可溶性产物。在高温下且当存在蛋白酶时，生产是无效的且导致聚集体。
[0016]Bishai1987未能显示可溶蛋白质CRM197融合蛋白，即具有用于周质靶向的信号 肽的高水平生产。在考马斯染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶中，含有ABM508表达构建体的提取 物显示对应于ABM508的强烈蛋白质条带，而表达CRM197 (所述CRM197从天然启动子表达 具有野生型信号肽）的细胞未显示在58kDa的预期大小处关于CRM197的明显条带。
[0017] 因此，周质表达不视为有效的生产策略，并且迄今为止不存在对于可溶性和正确 折叠的CRM197或DT生产建立的有效的大肠杆菌周质表达系统。
[0018] 通过用于CRM197的第一种基于大肠杆菌的表达系统提供了生产系统，其基于 包涵体中的不溶性CRM197的细胞质表达，随后为蛋白质的增溶、纯化和重折叠（W02010 150230)。当应用另外的蛋白酶解步骤时，不含另外的氨基酸的野生型CRM197可以仅用这 种系统获得。
[0019] 信号肽诱导对周质的蛋白质分泌，并且对蛋白质生物发生具有多种效应。（Powers T，WalterP:Co-translationalproteintargetingcatalyzedbytheE. coli signalrecognitionparticleanditsreceptor.The EMBO Journal1997,16 (16) :4880-4886. )(SchierleCF，BerkmenM，HuberD，KumamotoC，BoydD，BeckwithJ: TheDsbAsignalsequencedirectsefficient,cotranslationalexportofpassenger proteinstotheE. coliperiplasmviathesignalrecognitionparticlepathway. Journal of Bacteriology 2QQ?>,lSh(19) :5706-5713)〇
[0020] 3 概述 本文提供的是在大肠杆菌表达菌株中以高得率(例如至少〇. 5mg/1)产生可溶性、折叠 的全长CRM197的方法。特别地，信号肽用于指导蛋白质分泌到周质空间内。
[0021] 本文提供的是用于产生CRM197的方法，其中该方法包括培养包含编码CRM197的 核酸的大肠杆菌细胞，其中CRM197融合至异源信号肽，所述异源信号肽将CRM197靶向大肠 杆菌细胞的周质。在更特定的实施方案中，CRM197的野生型信号肽已缺失。在甚至更特定 的实施方案中，CRM197的野生型信号肽已替换为异源信号肽。异源信号肽可以选自来自下 述的信号肽：大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌外膜孔蛋白（OmpA)、大肠