一种检测CALR基因突变的内参扩增引物组合物及其扩增体系的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种检测calr基因突变的内参扩增引物组合物及其扩增体系和扩增检测方法。

背景技术：

骨髓增殖性肿瘤(mpn)是骨髓中一种或多种髓系细胞增殖和外周血中成熟及不成熟细胞增加的克隆性造血干/祖细胞疾病。近年来，多个分子标志物，如jak2、mpl和tet突变等相继被发现，这些标志物的发现对于理解mpn的分子发病机制具有重要意义，也有助于对这类疾病的患者进行诊断和治疗。但是，有30％～45％的携有野生型jak2/mpl的原发性血小板增多症(et)或原发性骨髓纤维化(pmf)患者仍然存在诊断困难，新近报道的钙网蛋白基因(calr)突变将能部分填补这一空白，有望成为诊断骨髓增殖性肿瘤又一种新的分子标志物。

calr是一种主要位于内质网的有多重功能的钙离子结合和储存蛋白分子伴侣，通过协助蛋白质正确折叠和维持细胞钙离子稳态而参与调节细胞增殖、凋亡、黏附、免疫等过程。calr基因定位于染色体19p13.2，它有9个外显子和9个蛋白结构域，calr基因突变是由第九外显子插入和缺失引起，导致一个碱基对的读码框移位，继而产生一种具有缺乏内质网保留序列(kdel氨基酸序列)的新型的c-羧基末端的蛋白。到目前为止，已经检测到多于40种不同的calr突变体，其中最常见的两种变异体分别为：由52个碱基缺失引起的1型变异体(p.l367fs*46)和由5个碱基ttgtc插入引起的2型变异体(p.k385fs*47)，它们分别占所有突变体的53％和32％，研究者在体外实验中发现，过度表达的1型突变体增强了白介素-3表达，也促进了stat5磷酸化作用并且引起信号传导的激活，这种激活作用能被jak抑制剂阻滞，这说明calr和jak2突变可能有类似的机制。

calr基因突变的检测主要依赖于探针实时pcr法或测序法等，以上方法耗时耗力、报告周期长，且在灵敏度方面存在缺陷，所需检测设备昂贵，检测时必须要有专门的设备和训练有素的技术人员，对技术平台要求高，不易于广泛推广。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，在已经建立一种针对calr基因1型和2型突变进行快速检测的环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)体系的基础上，提出一种检测calr基因突变的内参扩增体系，与calr基因的突变体系配套使用，以保证检测结果的准确性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种检测calr基因突变的内参扩增引物组合物，其包括如seqidno：1所示的f3引物、如seqidno：2所示的b3引物、如seqidno：3所示的fip引物、如seqidno：4所示的bip引物、如seqidno：5所示的lf引物以及如seqidno：6所示的lb引物。

优选地，所述calr基因突变包括calr基因1型突变和calr基因2型突变。

本发明的第二个目的是提供一种含有上述内参扩增引物组合物的检测calr基因突变的内参扩增体系。

优选地，所述内参扩增体系还包括反应缓冲液、bstdna聚合酶、钙黄绿素、去离子水、dna模板。

优选地，所述内参扩增体系的总体积为25μl，其包括2×反应缓冲液(rm)12.5μl，引物f3：1μl，引物b3：1μl，引物fip：0.5μl，引物bip：1μl，引物lf：1μl，引物lb：1μl，bstdna聚合酶1μl，钙黄绿素(fd)1μl，去离子水3.0μl，dna模板2μl。

优选地，在所述内参扩增体系中，所述f3引物和b3引物的终浓度均为0.2μmol/l；所述fip引物和bip引物的终浓度均为1.6μmol/l；所述lf引物和lb引物的终浓度均为0.8μmol/l。

可理解的是，在满足恒温扩增反应的条件下，上述反应混合体系中各试剂的浓度及用量均可进行适当的调整，但采用上述体积及浓度的试剂，其扩增效果最佳，检测结果更为准确。

本发明的第三个目的是含有上述内参扩增体系的检测calr基因突变的试剂盒。

本发明的第四个目的是提供一种采用上述内参扩增引物组合物的用于非诊断和治疗目的的检测calr基因突变的方法，该方法以被测样本的dna模板，采用seqidno：1～seqidno：6所述的引物进行lamp反应，然后进行可视化判读来鉴定样本是否为calr基因突变阳性。

优选地，所述lamp反应的条件为：55～70℃，30～60min；更优选地，所述lamp反应的条件为：63～68℃，60min；最优选地，所述lamp反应的条件为：65℃，60min。

优选地，所述lamp反应所用的设备为能够稳定提供65℃恒温的设备，例如普通pcr仪或恒温金属浴等。

本发明的第五个目的是提供一种上述内参引物组合物扩增的calr基因突变的靶序列，其由seqidno：7所示序列组成，并且提供一种含有上述calr基因突变的靶序列的重组质粒，该重组质粒为含seqidno：7所示序列的ta克隆质粒。

上述引物及靶序列的碱基序列如下表1所示。

表1检测calr基因突变的内参引物及靶序列的核苷酸序列表

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述的检测calr基因突变的内参扩增体系及其扩增方法，与calr基因的突变体系配套使用，该内参扩增体系既可以对突变型的calr基因进行快速检测，也可以对野生型的calr基因进行扩增，作为calr突变检测试剂盒的内参质控体系，在质量控制的提升方面具有重要意义。

附图说明

图1是calr基因突变lamp体系特异性的验证示意图；

图中附图标记为：

a1：临床野生型基因组dna为模板；a2：临床calr-1型突变基因组dna为模板；a3：临床calr-2型突变基因组dna为模板；a4：10⁸copies/ml的质粒样本；a5：10⁵copies/ml的质粒样本；a6：10⁴copies/ml的质粒样本；a7：10³copies/ml的质粒样本；a8：阴性对照样本。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例为本发明所采用的calr基因突变的靶序列，以及用于检测calr基因突变的内参扩增引物。

在calr基因的相对保守序列区域，选取靶片段设计引物，并进行优化筛选后，设计适当的特异性引物。

靶片段长度为214bp，具体序列为：

ttgcagacaagccaggatgcacgcttttatgctctgtcggccagtttcgagcctttcagcaacaaaggccagacgctggtggtgcagttcacggtgaaacatgagcagaacatcgactgtgggggcggctatgtgaagctgtttcctaatagtttggaccagacagacatgcacggagactcagaatacaacatcatgtttggtcccgacatct(seqidno：7)；

引物序列为：

f3：5'-ttgcagacaagccaggatg-3'(seqidno：1)；

b3：5'-agatgtcgggaccaaacatg-3'(seqidno：2)；

fip：5'-tgaactgcaccaccagcgtcctctgtcggccagtttcg-3'(seqidno：3)

bip：5'-gcagaacatcgactgtgggggtctgagtctccgtgcatgt-3'(seqidno：4)；

lf：5'-gcctttgttgctgaaaggct-3'(seqidno：5)；

lb：5'-cggctatgtgaagctgtttcc-3'(seqidno：6)。

实施例2

本实施例为本发明检测calr基因突变的内参扩增体系、试剂盒及扩增检测方法。

本发明所述的检测calr基因突变的试剂盒包括内参扩增体系，该内参扩增体系的总体积为25μl，其包括2×反应缓冲液(rm)12.5μl，引物f3：1μl(终浓度0.2μmol/l)，引物b3：1μl(终浓度0.2μmol/l)，引物fip：0.5μl(终浓度1.6μmol/l)，引物bip：1μl(终浓度1.6μmol/l)，引物lf：1μl(终浓度0.8μmol/l)，引物lb：1μl(终浓度0.8μmol/l)，bstdna聚合酶1μl(8u)，钙黄绿素(fd)1μl，去离子水3.0μl，dna模板2μl。

采用上述试剂盒进行lamp反应，lamp反应条件为：65℃，60min；所用的设备为普通pcr仪或恒温金属浴等能够稳定提供65℃恒温的设备；然后进行可视化判读来鉴定样本是否为calr基因突变阳性，具体为结果判断：反应结束后，反应液的颜色由原来的淡黄色变为绿色，即判定为反应阳性。

构建含靶序列的ta克隆质粒，制备梯度浓度的双份样本，具体浓度为10³copies/ml，10⁴copies/ml，10⁵copies/ml，10⁶copies/ml，10⁷copies/ml，10⁸copies/ml，用所建立的calr基因通用lamp反应体系(内参扩增体系)进行检测，均能检出；用所建立的calr基因通用lamp反应体系(内参扩增体系)对临床野生型和突变型的样本，均能高效的稳定检出。检测性能良好，结果示如图1所示，a1-a7样本的体系经60min扩增后，均变绿变浑浊，呈现阳性结果，a8为阴性对照，经60min扩增后，无任何变化，依然淡黄色澄清，呈现阴性结果。

由上述实施例可知，本发明所述的检测calr基因突变的内参扩增体系及其扩增方法，与calr基因的突变体系配套使用，该内参扩增体系既可以对突变型的calr基因进行快速检测，也可以对野生型的calr基因进行扩增，作为calr突变检测试剂盒的内参质控体系，在质量控制的提升方面具有重要意义。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

sequencelisting

<110>复旦大学附属华山医院；中国科学院苏州生物医学工程技术研究所

<120>一种检测calr基因突变的内参扩增引物组合物及其扩增体系

<160>7

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aacaaaggccagacgctggtggtgcagttcacggtgaaacatgagcagaacatcgactgt120

gggggcggctatgtgaagctgtttcctaatagtttggaccagacagacatgcacggagac180

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