一种西瓜果皮条纹的SNP标记、检测方法及应用与流程

文档序号：11246451阅读：735来源：国知局

本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种西瓜果皮条纹的snp标记、检测方法及应用。

背景技术：

西瓜(citrulluslanatusl.)是葫芦科重要的水果型经济作物，因其种植面积和年消费量被评为世界第五大水果，其汁多甘甜、消暑止渴，是夏季消费量最大的水果之一。我国是西瓜最大的生产和消费国，据联合国粮农组织(fao,http://faostat.fao.org)数据统计，2014年我国西瓜的总栽培面积为186万公顷，总产量高达7505万吨；同时，西瓜产业发展数据显示，我国西瓜的种植面积和产量均保持稳中有升的良好趋势。因此，西瓜作为我国重要的瓜类作物之一，在农业结构产业调整和农村经济发展中发挥着重要的作用。

果皮条纹作为重要的外观品质之一，对改良西瓜的商品性具有重要作用，因此长期以来一直是育种家的研究重点。通过传统育种方对西瓜果皮条纹性状的选择需要在果实生长期进行，存在鉴定周期长、效率低的缺点，而利用分子标记辅助选择育种(mas,molecularmarker-assistedselection)则可在苗期完成对条纹性状的选育，不仅省时省力，而且还可以提高选育的准确性和效率，因此建立西瓜果皮条纹性状的分子标记辅助选择体系，对提高育种效率和加速育种进程具有重要意义。

近年来，随着研究的不断深入，对西瓜果皮条纹的研究取得了一定进展。heebum等的研究表明，西瓜的果皮条纹和果皮颜色是由三个独立的基因调控，即：果皮有条纹对无条纹为显性，由单显性基因s调控；深绿色果皮对绿色果皮为显性，由基因d调控；黄色果皮对绿色果皮为显性，由基因dgo调控，此结论与weetman提出的模型“西瓜果皮条纹和果皮颜色(深绿色和浅绿色果皮)由同一位点的三个等位基因(g>g^s>g)调控”完全不同，另外研究还表明果皮条纹颜色(如黄色条纹)和果皮颜色(黄色果皮)可能是同一个或者相邻的两个基因调控。进一步，park等利用基因组重测序技术对上述三个基因进行了初定位，其中控制西瓜果皮条纹有无性状的单显性基因s被成功初定位到6号染色体21.78mb到25.77mb区域内，物理距离约为3.99mb，而基因d和dgo则被分别定位到8号和4号染色体上。kim等以另两个不同果皮条纹类型的材料“arkamanik”(边缘弥散型、浅绿色宽条纹)和“ts34”(边缘清晰型、黑色中宽条纹)为亲本，成功构建分离群体，遗传分析发现此亲本中果皮条纹是由多基因控制的数量性状，利用bsa技术(bulkedsegregantanalysi混池分析法)成功将一个主效qtl位点定位到6号染色体24.03mb到26.32mb区域范围内。另外，gama等构建了亲本材料“brsopara”(果皮覆边缘清晰型条纹)和“pérola”(果皮覆边缘弥散型条纹)的分离群体，通过遗传分析发现西瓜果皮的清晰条纹性状由单显性基因调控，利用微卫星多态性标记将相关基因定位到西瓜第6号染色体上，并开发连锁分子标记mcpi_05和mcpi_16，但这两个分子标记与目标基因的遗传距离分别为1.5cm和1.8cm。但上述标记还存在分析群体相对较小，连锁距离相对较远等问题，还不足以克隆其调控基因位点的候选基因。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明实施例提供了一种西瓜果皮条纹的snp标记、检测方法及应用，主要目的是提供一个与西瓜果皮条纹紧密连锁的分子标记fd01071，用该分子标记在苗期可准确检测出西瓜植株的果皮是否会有条纹，为西瓜果皮条纹分子标记辅助技术体系的建立提供帮助。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种西瓜果皮条纹性状相关的snp标记，所述snp标记的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示；其中，seqidno.1所示的核苷酸序列与西瓜果皮条纹性状高度连锁，seqidno.2所示的核苷酸序列与西瓜果皮无条纹性状高度连锁。

另一方面，本发明实施例提供了一种用于检测上述snp标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示。

再一方面，本发明实施例提供了一种用于检测snp标记的试剂盒，所述试剂盒包含上述引物对。

又一方面，本发明实施例提供了上述snp标记、上述引物对及上述试剂盒在西瓜育种中的应用。

又一方面，本发明实施例提供了一种检测西瓜果皮条纹性状的方法，通过检测待测西瓜是否含有的上述snp标记以确定所述西瓜的果皮条纹性状。

作为优选，所述方法具体包括：

提取待测西瓜的基因组dna；

利用权利要求2所述的引物对，对西瓜的基因组dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；

对所述pcr扩增产物进行测序以获得测序结果，或对pcr产物用限制性内切酶ecori进行酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳显示结果；

对比所述测序结果或凝胶电泳显示结果与权利要求1所述的snp标记以确定所述待测西瓜的条纹性状。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过利用bsr-seq技术鉴定snps，根据鉴定的snps和公布的西瓜基因组数据开发分子标记，并扫描f2分离群体，结合群体植株的果皮条纹表型，开发与条纹调控基因连锁更加紧密的分子标记。目前，已经开发的分子标记fd01071与条纹调控基因位点连锁紧密，因而对西瓜果皮条纹性状分子标记辅助育种体系的建立更有帮助。本发明的分子标记可以简便、快速、高通量地应用于西瓜育种实践。

附图说明

图1为本发明实施例提供的有条纹(w006)和无条纹果皮(c118)的表型示意图；

图2为本发明实施例提供的分子标记fd01071在亲本(w006和c118)、f1及f2代植株中的多态性电泳图谱。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

实施例1

如图1所示，选择西瓜种质材料w006果皮表面覆有深绿色、中宽清晰条纹，材料c118果皮无此条纹，以w006和c118为亲本，杂交获得f1代植株，f1代植株自交构建f2分离群体；

用ctab法提取亲本、f1及f2分离群体的叶片总dna：取上部幼嫩叶片在液氮中快速研磨成粉末状，放于1.5ml的离心管中；加入预热的800μlctab提取缓冲液，65℃水浴30min；加入等体积氯仿异戊醇，其中氯仿与异戊醇的体积比为24：1，混匀后12000r/min离心15min；将上清液转入新的离心管，加等体积异丙醇，轻轻混匀，冰浴1h以上；12000r/min离心15min；倒去上清液，用体积分数为75％的乙醇冲洗沉淀两次，干燥后，加入te缓冲液200μl溶解后，加入10μg/ml的rna酶去除rna，37℃水浴30min；在0.8％琼脂糖凝胶电泳，以50ng/μl的λdna为标准，估计所得dna的浓度；后用te稀释终浓度为100ng/μl，存于-20℃备用；

在已种植f2分离群体中，选取30株条纹果皮植株，取发育程度一致的西瓜果皮组织，分别抽提总rna后等量混合形成条纹池(stripespool)；同样的方法，选30株无条纹果皮植株，取发育程度一致的西瓜果皮组织，分别抽提总rna后等量混合形成无条纹池(non-stripespool)；用illumina平台的hiseq2500双末端测序技术对两个混合池进行rna-seq测序，其中pairend(双末端)各125bp，测序深度约为60x，每个池的测序数据约为6g，共12g；然后，用已开发好的程序(perl语言编写的脚本，marker_snps_v1.pl)对两个池的rna-seq数据进行分析，流程如下：将两个混合池的rna-seq数据通过bowtie2软件比对西瓜参考基因组上(http://www.icugi.org)，再利用tophat、samtools软件寻找两个池中等位基因的snps；

根据鉴定的snps位点及其在参考基因组上的侧翼序列设计引物，参见seqidn0.3和seqidn0.4，以抽提的双亲本、f1和f2分离群体dna为模板进行pcr扩增(pcr片段包含的snps)，pcr扩增程序为：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃30s，35cycles；72℃5min。用相应的限制性内切酶对pcr产物进行切割，使用2％琼脂糖凝胶电泳显示结果，亲本、f1和子代的多态性条带具体参见图2，扩增产物的序列为seqidn0.1和seqidn0.2；从条纹植株中扩的pcr片段无法被酶切，在琼脂糖凝胶上显示长度为889bp的条带，而从无条纹植株中扩增的pcr产物可被酶切成两个小的片段，502bp和387bp的条带，片段长度加起来与无法被酶切的长度相同；因此即得到可区分果皮有条纹植株和无条纹植株的多态性分子标记。

本发明得到分子标记(名称为fd01071)的两条核苷酸序列seqidn0.1和seqidn0.2，长度都为889bp，在染色体上的具体位置为，chr06:25834268-25835156。

本发明的得到的核苷酸序列如seqidn0.1与西瓜果皮条纹形状高度连锁；

本发明的得到的核苷酸序列如seqidn0.2与西瓜果皮无条纹形状高度连锁。

利用本发明的分子标记检测西瓜条纹形状的方法：提取待测西瓜的基因组dna，利用上述设计的引物对，对西瓜的基因组dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物，对pcr扩增产物进行测序得到其核苷酸序列，比较检测的核苷酸序列和seqidn0.1序列是否一致，如一致(条带不可被限制性内切酶ecori切开)，表示该植株的西瓜果皮会有清晰、中宽条纹，如若不一致，而与seqidn0.2序列一致(条带可被限制性内切酶ecori切开)，则表示该植株的西瓜果皮无条纹。

本发明人在现有公开的西瓜有纹或无纹的分子标记的大的范围内，再进一步缩小西瓜果皮有纹或无纹的分子标记的序列和在染色体上的具体位点，有助于西瓜育种选择。

本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。

以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

sequencelisting

<110>西北农林科技大学

<120>一种西瓜果皮条纹的snp标记、检测方法及应用

<160>4

<210>1

<211>889

<212>dna

<213>西瓜

<400>1

gctgcggcattgctacctaccaacacatcgccagtagtttattcttgatttttaactctt60

ctttgcctaacaaccgggaatattttcgcctttggtctatctatttggattttttttttt120

ttggaagtattttagaactttgattatctgagtctttttccctaaaatttgaccgattca180

tcagaatactgttgaaattcgtgaataagaaattgtgcttgagtttgactcgttctttag240

aattggaatatgttcggagtgtgacgcaatcgtttattattttagtagatttattgtctt300

gtgaaaagattcaggagtggttgaataaatctgaacctggagaaggggctcttagggccg360

tcgatctctaatttgattccaacacctttaaatatggagatggactattgtttgattcac420

tttagacagcgtttgagtgtaacgcttttttattctcaggtgcatcatccattagggagt480

gcagaaccatagttcataaaagaatttactgttcttcacagcctcctcctccagcttggc540

ctggacgagcgatcgcagagccgggatataagaaatgggaaggccagaagcctatctcca600

ttgtaggatccactggctccattggaactcaggtcagttggatttgacatctgctagagc660

aagacaaaactcttttcttctgtccacaattaatattttttttgtctcaagagaggagaa720

gacatgtctctttcaggaaaaagattgaaagaatcaacaattttttttttctttgcaaat780

tacttgttagtccctcaacagtttcttacttacaattagtggttctacagacattggata840

ttgtggcagagaatcctgagaaatttagagttgtggcacttgcagctgg889

<210>2

<211>889

<212>dna

<213>西瓜

<400>2