一种荧光定量PCR技术检测意大利蜜蜂王浆主蛋白MRJP2基因表达的方法与流程

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及涉及用于检测意大利蜜蜂mrjp2基因表达的特异性引物，一种荧光定量pcr技术检测意大利蜜蜂王浆主蛋白mrjp2基因表达的方法。

背景技术：
：

蜂王浆是由蜂群中青年工蜂头部的咽下腺和上颚腺分泌而来，呈现为一种黏稠的乳浆状物质，蜂王浆富含多种对机体有益的物质，其中蛋白质约占干质量的50％，包括水溶性蛋白质和水不溶性蛋白质。水溶性蛋白质占蜂王浆中总蛋白质含量的46％～89％，为蜂王浆蛋白质的主要部分，称为蜂王浆主蛋白(majorroyaljellyproteins，mrjps)。

王浆主蛋白成分为一个蛋白质家族，迄今为止，研究人员已经发现10个成员(mrjp1～mrjp9和mrjpψ)，分子量在49-87kda，其中5种蛋白质，即mrjp1–mrjp5，占蜂王浆总蛋白的82％-90％。

mrjps作为蜂王浆中的主要活性成分，不仅具有促进细胞增殖、抑菌、抗氧化、抗疲劳等功效，还具有多种生物学功能，如参与决定蜂群中雌性蜂的级型分化，为幼虫的发育提供必要的可利用氮元素，以及可能在蜜蜂行为调控中起作用等。但是mrjps中各个成员之间的功能不同，所以针对mrjps中单一组分的研究很有必要。

mrjps家族中，mrjp1和mrjp2是被研究比较全面的成员，二者含量约占蜂王浆总蛋白的47％。mrjp2是蛋白质家族的第2个成员，其在蜂王浆主蛋白中含量中等，为16％左右。mrjp2的分子量为49-52.7kda，等电点为6.2～7.9，属于一种弱碱性糖蛋白。simúth等研究发现mrjp2可以刺激小鼠巨噬细胞释放肿瘤坏死因子(tnf-α)，提出其抗癌应用的潜在生理价值。bíliková等研究发现mrjp2能够抑制芽孢杆菌属(paenibacialuslarvea)的生长，提示蜂王浆中功能蛋白组分mrjp2在药物研究方面的应用前景。

我国是养蜂大国，蜂群数量和蜂产品产量、出口量均居世界第一，目前，中国蜂蜜年产量40多万吨，占世界蜂蜜总产量1/4以上。近年来其质量安全问题多次曝光，已经受到政府部门和社会各界的高度重视和普遍关注。蜂产品质量安全隐患主要包括抗生素残留、重金属污染以及滥用添加剂等方面。其中，蜂产品中抗生素残留问题较为严重。蜂产品抗生素残留主要是蜂病防治过程中用药不科学造成的，在意大利蜜蜂养殖过程中，蜜蜂常受白垩病的困扰，蜜蜂白垩病是由于蜂球菌危害引起的，给养蜂业造成很大威胁。蜂农常用苯菌灵药物来防治蜜蜂白垩病。

苯菌灵别名为1-正丁胺基甲酰-苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯，是一种高效、低毒的广谱杀菌物质，多应用于农业生产中病虫害的防治工作，在使用和分析处理过程中，容易转化为多菌灵，多菌灵属于新型苯胺类苯并咪衍生物，化学性质稳定，降解半衰期较长，能持久地残留在使用部位，易致累积效应对生态环境和人类健康造成威胁，若使用不当，可对生育能力、危害胎儿、损害遗传基因，三项人体健康造成影响。

苯菌灵是防治蜂群白垩病的常用药物，施药期间对于蜂群所产蜂王浆的品质是否有影响，是关系蜂产品安全生产的大问题。通过观测蜜蜂体内mrjps的表达水平，可以从一定的程度上反应蜂群所产蜂王浆的质量。本专利检测的mrjp2在蜂王浆mrjps占有较大的比例，荧光定量pcr检测饲喂苯菌灵前后蜂群体内mrjp2的相对表达水平，对于苯菌灵的药物使用量，蜂产品的安全生产都具有重要的意义。

实时荧光rt-pcr技术是在常规pcr技术的基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光rt-pcr不仅实现了常规pcr从定性到定量的飞跃，而且与常规pcr相比，实时荧光pcr技术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光rt-pcr技术全封闭反应，无须pcr后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。目前，已广泛应用于分子生物学和医学研究等领域。随着实时荧光rt-pcr试剂盒的进一步开发，近年来，实时荧光rt-pcr技术在动物生态防治中也得到了广泛的应用。

技术实现要素：
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本发明中意大利蜜蜂mrjp2实时荧光rt-pcr检测方法的建立，为快速检测蜂王浆品质建立了一个参考指标。研究饲喂抗生素对意大利蜜蜂体内mrjp2基因表达量的影响，研究结果不仅为探究意大利蜜蜂疾病的治疗策略提供理论基础，也为研究抗生素苯菌灵对蜂王浆的品质影响提供一定的参考，这对于意大利蜜蜂的疾病防治和蜂产品的安全都具有重要意义。

本发明的目的是公开一种荧光rt-pcr技术检测意大利蜜蜂王浆主蛋白mrjp2基因表达的方法：

设计一种采用荧光定量pcr技术检测意大利蜜蜂mrjp2基因表达的特异性引物，其特征在于包括符合荧光pcr反应特点的特异上下游引物：

mrjp2-f：5'-tcgcttctcacggtttgtatt-3'

mrjp2-r：5'-agtgattgatgctcgttccag-3'

本发明所述特异性引物快速检测意大利蜜蜂mrjp2基因表达的方法，其特征在于按如下步骤进行：

(1)使用下述引物进行该基因的检测：

符合荧光pcr反应特点的该序列特异上下游引物：

mrjp2-f：5'-tcgcttctcacggtttgtatt-3'

mrjp2-r：5'-agtgattgatgctcgttccag-3'

(2)总rna的提取：采用各种通用的rna提取方法，从意大利蜜蜂成体中提取总rna；

(3)cdna合成：以意大利蜜蜂总rna为模板合成cdna，反应体系为20μl；

(4)实时荧光pcr：以上述合成的cdna为模板，上述(1)中mrjp2-f和mrjp2-r、β-actin-f和β-actin-r为特异性引物，进行实时荧光pcr扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的ct值取平均数。

(5)苯菌灵处理前后意大利蜜蜂mrjp2的相对表达量计算：

实时荧光pcr后，当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，采用2^－δδct法计算苯菌灵处理前后mrjp2基因的相对表达量差异。

本发明所述的检测方法，其中每条引物分别配制成浓度为100μm的贮存液，工作浓度为2μm。

本发明进一步公开了采用荧光rt-pcr技术检测抗生素苯菌灵处理前后意大利蜜蜂mrjp2基因的相对表达量，旨在制备检测抗菌肽mrjp2在意大利蜜蜂免疫系统调控中的作用。实验结果表明：图5为抗生素苯菌灵处理前后意大利蜜蜂mrjp2基因的相对表达量。从图中看出，在苯菌灵胁迫的情况下，意大利蜜蜂体内的mrjp2的相对表达量呈下降的趋势，这说明药物苯菌灵对于蜂王浆内的mrjp2表达确实有影响。

本发明提供的特异性引物快速检测意大利蜜蜂mrjp2基因表达的方法，与现有技术相比的有益效果是：

(1)本发明采用的实时荧光rt-pcr技术与常规pcr相比，实时荧光pcr技术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光pcr技术全封闭反应，无须pcr后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。实时荧光rt-pcr技术也免除了常规pcr中的电泳、定量扫描等后续繁琐步骤，大大缩短了实验时间。

(2)在通过qrt-pcr的方法研究抗生素苯菌灵处理前后mrjp2基因表达的变化，结果显示苯菌灵胁迫下意大利蜜蜂体内的mrjp2基因的表达水平下调，说明苯菌灵确实对蜜蜂体内mrjp2基因表达有影响。

(3)因此本发明研究结果可为探究意大利蜜蜂白垩病的治疗策略提供理论基础，这对于意大利蜜蜂的疾病防治具有重要意义。

说明书附图：

图1为内参基因β-actin扩增曲线；

图2为内参基因β-actin溶解曲线；

图3为mrjp2的扩增曲线；

图4为mrjp2的溶解曲线；

图5为抗生素苯菌灵处理前后意大利蜜蜂mrjp2基因的相对表达量。

具体实施方式：

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员参照本发明的精神，可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售。本发明中所述的意大利蜜蜂总rna的提取、cdna的合成、实时荧光rt-pcr等方法都是本领域成熟的技术，试剂盒等实验药品和试剂都可以从生产商家购买。

实施例1：

获得意大利蜜蜂mrjp2基因序列

打开beebase(http://hymenopteragenome.org/beebase/)数据库，在搜索栏输入关键词mrjp2，搜索到mrjp2一个结果。点击mrjp2得到其beebase数据库基因号为gb55212。点击进入基因描述页面，选中ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库的链接，进入ncbi，得到其基因编号为loc406091，ref-seq的mrna编号为nm_001011580.1，protein编号为np_001011580.1，即得到mrjp2的cds以及氨基酸序列。

实施例2：

意大利蜜蜂总rna的提取

选取2组(每组3个平行样)健康的意大利蜜蜂进行抗生素对mrjp2表达量影响的探究实验。实验组三个蜂群依照苯菌灵药物使用说明，饲喂一周。实验组三个蜂群饲喂同量的糖水，饲喂一周。处理后选取适量的意蜂工蜂，并保存于-20℃冷冻。

(1)取10头意蜂工蜂置于无菌研钵内，倒入液氮并迅速用研磨棒充分研磨，研磨后将粉末转入1.5ml中，再加1000μlrnaisoplus溶液入离心管，静置5min。

(2)将200μl氯仿加入离心管，剧烈振荡5-10min，静置5min。

(3)4℃下12000rpm离心10min，将上层无色水相转入新无菌离心管中，加入500μl异丙醇，轻柔颠倒混匀，放置10min，12000rpm离心10min。

(4)小心倒掉管中液体，保留沉淀，加入1000μl75％乙醇洗涤沉淀。4℃下7500rpm离心5min，再重复一次乙醇洗涤沉淀操作。

(5)小心弃去上清液，室温干燥2min。将rna沉淀溶于50μldepc水中。

(6)所得沉淀即为意蜂总rna，产物立即使用或冷冻保存于-80℃。

实施例3：

cdna的合成

以实施例2所述意大利蜜蜂总rna作为模板。取一消毒的0.2ml离心管，加入以下反应体系(20μl体系)：

(1)在冰浴的nuclease-freepcr管中加入以下试剂：rna按照800ng反转。

(2)轻轻混匀后离心3～5s，反应混合物在65℃温浴5min后，冰浴2min，然后离心3～5s。

(3)将试管冰浴，再加入下列试剂：

5×rtbuffer4.0ul

thermoscientificribolockrnaseinhibitor(20u)0.5ul

revertaidpremiumreversetranscriptase(200u)31.0ul

(4)轻轻混匀后离心3～5s

(5)在pcr仪上按照下列条件进行反转录反应

①25℃孵育10min

②cdna合成50℃30min

③终止反应85℃5min，处理后，置于冰上放置。

(6)将上述溶液-20℃保存。

实施例4：

荧光定量pcr反应体系和条件

(1)引物设计：

根据所述意大利蜜蜂mrjp2-1基因的全长序列，使用primer5软件设计适用于实时荧光rt-pcr检测的特异性引物，引物序列如下：

mrjp2-f：5'-tcgcttctcacggtttgtatt-3'

mrjp2-r：5'-agtgattgatgctcgttccag-3'

pcr产物预计长度为199bp

同时，根据转录组数据库里提供的意大利蜜蜂β-actin基因的cds序列设计用于实时荧光rt-pcr内对照的引物，引物序列如下：

β-actin-f：atgccaacactgtcctttctgg

β-actin-r：gacccaccaatccatacgga

pcr产物预计长度为135bp。

(2)实时荧光pcr：运用sybrgreen嵌合荧光法进行rt-pcr分析。使用cf96xpcr仪(bio-rad)进行pcr反应。以上述实施例3中合成的cdna为模板，使用mrjp2-f和mrjp2-r、β-actin-f和β-actin-r为特异性引物，进行实时荧光pcr扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的反应循环数)取平均数。

实时荧光pcr扩增体系设置如下：

实验样本：将cdna样品稀释8倍作为模板上机检测。

实时荧光pcr扩增参数设置如下：

仪器的操作

完成上述步骤后，把加好样品的96孔板放在abisteponeplus型荧光定量pcr仪中进行反应。

抗生素苯菌灵处理前后意大利蜜蜂mrjp2基因的相对表达量的计算：当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，采用2^－δδct法计算苯菌灵处理前后mrjp2基因的表达差异。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110>安徽省农业科学院蚕桑研究所

<120>一种荧光定量pcr技术检测意大利蜜蜂王浆主蛋白mrjp2基因表达的方法

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