专利名称：重组血管内皮生长因子-白喉毒素融合蛋白及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤的重组细胞毒素，尤其是涉及人血管内皮生长因子、白喉毒素的靶向毒素融合蛋白及其制备方法。
正常组织和肿瘤组织的一个显著不同，是正常组织中新生血管很少，而大小超过2.0mm3的肿瘤，其生长主要依赖于新生血管的形成。二者增生率的差异，为细胞毒素分子选择性地作用于肿瘤提供了生物学基础。
VEGF(vascular endotherial growth factor，VEGF)是一种特异性刺激血管内皮细胞增殖的细胞因子，主要作用是刺激血管内皮细胞的增殖、促进细胞迁移和抑制凋亡。其功能表现为诱导血管生成和增加血管通透性。目前已发现四种VEGF家族成员，即VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D。VEGF-A与VEGF-B均可结合于相同的酪氨酸激酶flt-1受体，VEGF-A还可与flk-1/KDR受体结合，在血管的发生和形成过程中起主要调节作用。
通常所说的VEGF为VEGF-A，基因定位于6号染色体短臂1区2带(6p12)，该基因长约14kb，由8个外显子和7个内含子构成，因不同的拼接方式产生5种异构体，分别含206，189，165，145和121个氨基酸。五种异构体中VEGF165和VEGF121最为丰富。
1993年Brown等和Plate等运用原位杂交表明flt-1和flk-1/KDR受体在肿瘤血管表面高度表达，而相邻正常组织的血管上皮细胞中VEGF的受体几乎无法检测出，因此VEGF可以用来将毒素多肽转运至增生的肿瘤组织中(Brown，L.F.，Berse，B.，Jackman，R.W.，et al.1993，Expression of vascular permeability factor(vascularendothelial growth factor)and its receptors in adenocarcinomas of the gastrointestinaltract.Cancer Res.，53，4727-4735.and Plate，K.H.，Breier，G.，et al.1993，Up-regulationof vascular endothelial growth factor and its cognate receptors in a rat glioma model oftumor angiogenesis.Cancer Res.，53，5822-5827.)。
白喉毒素((diphotheria toxin，DT)是一种常用的细胞毒素，其结构和功能研究得较为清楚，具有极高的毒素活性，通过阻断延伸因子EF2(elongation factor2，EF2)进入相应活性部位，可对真核细胞的蛋白合成产生不可逆的抑制或阻断作用。
靶向毒素的构建有两种方法，一种为化学偶联法，但是该方法所得靶向毒素容易引入氨基酸标签，改变毒素分子活性，带上非天然蛋白序列的靶向毒素应用于人体也容易引起免疫反应。另外，化学偶联法难以准确控制巯基化的定位和程度，从而可能产生异源性分子；毒素与配体的随机连接，容易发生受体和配体的空间阻碍；产量低，必须制备和纯化大量的蛋白用于偶联，代价高昂。
另一种方法为基因融合法，该方法克服了化学偶联的不足，近年来得到越来越多的应用，具体为将毒素与靶向分子通过一段连接多肽(Linker)构建为融合毒素，为了方便纯化，常用能与金属螯合柱结合的His标签，但His标签不是天然的蛋白序列，最后要用凝血酶等把它切去，但不可能切的干净，这样所得到的产物容易引起免疫反应。Linker的设计一直是个难题，因为要保证融合毒素的两个构成部分同时发挥各自的作用，Linker要有一定的长度保证两边的蛋白分子不会在空间上彼此影响；氨基酸的选择也不好选择，如果Linker氨基酸选择不当，容易带高静电，难以保证理想的效果。
本发明是通过如下技术方案来实现的采用基因工程的方法，构建一种靶向毒素融合蛋白，其包括白喉毒素多肽片段、血管内皮生长因子多肽片段以及位于两者之间的中间连接肽序列(
图1)。
其中，所述的白喉毒素氨基酸片段较好的为白喉毒素N端385-390个氨基酸序列，最好的为白喉毒素N端389个氨基酸序列。所述的血管内皮生长因子氨基酸片段较好的为血管内皮生长因子VEGF-A，最好的为VEGF165。所述的中间连接肽序列较好的是由6-15个甘氨酸或丝氨酸组成的，最好的是由Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser组成。
本发明靶向毒素融合蛋白是的构建和制备)包括以下步骤1.构建1)白喉毒素基因片段和血管内皮生长因子片段分别进行PCR扩增，所用引物引入了编码中间连接肽的核苷酸及酶切位点；2)上述PCR产物酶切后回收目的片段，然后连接转入表达质粒。2.制备1)上述得到的质粒转入大肠杆菌，在适宜的培养条件下表达。
2)离心收集菌体，超声裂解后经洗涤得到包涵体。
3)裂解包涵体，然后依次经透析、离子交换柱层析和凝胶过滤层析后得到纯化的融合蛋白。3.活性鉴定将一定浓度融合蛋白DT389-VEGF165加入表达VEGF165受体的EC细胞培养，镜下观察到随时间的延长，细胞开始出现脱落、病变、坏死。而不表达VEGF165受体的L929细胞及仅加入PBS的EC细胞生长正常，表明特异性的VEGF165受体是靶向毒素发挥细胞毒作用的中间环节。
在细胞实验中，靶向毒素DT389-VEGF165浓度从0.5mg/ml开始倍比稀释，发现在250ug/ml浓度以上时细胞在6h后即开始出现脱落，从125ug/ml浓度以下开始，细胞在24h左右才开始出现病变，在72h后，在390ng/ml浓度以上细胞均出现病变。
MTT染色表明，重组靶向毒素DT389一VEGF165从125ug/ml倍比稀释至390ng/ml，作用于细胞72h后，对细胞的生长抑制作用呈现出较明显的剂量反应关系(图4)。
本发明所得到的靶向毒素的靶细胞为血管内皮细胞，其遗传性质稳定不易变异，血管内皮细胞与血液邻接，药物易于到达。VEGF165为定向载体，可以产生选择性的细胞毒性效果。将毒素和VEGF构建为一条多肽单链，可以避免产生异源分子，在大肠杆菌中高效表达并降低生产成本。毒素分子的选择方面，由于DT具有很强的细胞毒性，因此在临床应用时能以较低的毒素剂量获得治疗效果。虽然多数人在儿童时期已经主动免疫获得了DT的中和抗体，但由于DT的毒性很强，单个的DTA片段进入细胞即可使之致死，因此对治疗剂量不会有太大的影响。在抗血管生成的治疗方面主要有两类药物，一类是抑制新生血管生成，另一类是血管定向的靶向药物，即以VEGF受体为靶向的融和毒素。前者在肿瘤生长初期具有抑制效果，但对于发展到一定程度的肿瘤，只能阻止其进一步增大，不能达到令其缩小的目的。后者能够破坏肿瘤的血管，是更有前景的治疗手段，除了适用于各种实体瘤的治疗外，在视网膜疾病、艾滋病等方面亦有潜在的应用价值。
扩增产物与pGEM-3ZF质粒分别经EcoRI和BamHI酶切后连接，测序鉴定正确。实施例2 VEGF165片段的扩增VEGF165全基因，PCR扩增，在引物两端分别加入酶切位点BamHI和PstI，5’带有部分连接肽序列。5’端引物如序列表中SEQ ID NO.3，3’端引物如序列表中SEQ ID NO.4。
扩增产物与T-Easy载体连接，测序鉴定正确。实施例3 白喉毒素389扩增片段和VEGF165扩增片段的连接分别以BamHI和PstI酶切DT389-3ZF和VEGF-Teasy，回收目的片段，连接得到DT3g9-VEGF-3ZF连接产物，在DT389与VEGF之间有一段编码(GGGS)2的连接序列。实施例4 融合基因的表达将DT389-VEGF-3ZF和原核表达质粒PBV220载体(《含PRPL启动子的原核高效表达载体的组建及其应用》。病毒学报1990年6月第6卷第2期Vol.6No.2June 1990，111-116)以EcoRI与PstI酶切后连接得到DT389-VEGF-220，其序列如序列表中的SEQ ID NO.5。转入大肠杆菌DH5α表达，具体条件为将含表达质粒的大肠杆菌菌种接种至LB培养基，30℃振摇至OD600＝0.4，按1∶50接种新鲜LB培养基，30℃振摇至OD600＝0.4，转至42℃继续振摇6小时，诱导产生白喉毒素389-血管内皮生长因子165融合蛋白，其序列如序列表中的SEQ ID NO.6。实施例5 融合蛋白的纯化1)表达菌液5000rpm 4℃离心10分钟，弃上清；2)超声裂解沉淀，分别以TrisCl，PBS，3M盐酸胍洗涤包涵体；3)按1g10ml加入8M尿素溶解包涵体，室温放置2小时；4)10000rpm离心10分钟，取上清；5)以2M尿素+50mMTrisCl(pH8.0)+1mMGSH+10mMGSSG复性体系复性，4℃复性24小时；6)以20mMTrisCl(pH8.0)透析24小时；7)以离子交换层析对复性产物纯化，最后过凝胶过滤层析得到纯化蛋白。
序列表SEQ ID NO.1序列特征(A)长度29bp；(B)类型核酸；(C)链性单链；(D)拓补结构线性分子类型寡核苷酸序列描述CGGAATTCAT ATGGGCGCTG ATGATGTTGSEQ ID NO.2序列特征(A)长度35bp；(B)类型核酸；(C)链性单链；(D)拓补结构线性分子类型寡核苷酸序列描述CGGGATCCTC CACCAGGTGC ATGCATGCGT TTTATSEQ ID NO.3序列特征(A)长度39bp；(B)类型核酸；(C)链性单链；(D)拓补结构线性分子类型寡核苷酸序列描述GGGATCCGGT GGAGGATCTG CACCCATGGC AGAAGGAGGSEQ ID NO.4序列特征(A)长度27bp；(B)类型核酸；(C)链性单链；(D)拓补结构线性分子类型寡核苷酸序列描述CCTGCAGTCA CCGCCTCGGC TTGTCACSEQ ID NO.5序列特征(A)长度1674bp；(B)类型核酸；(C)链性单链；(D)拓补结构线性分子类型cDNA序列描述ATG GAA AAC TTT TCT TCG TAC CAC GGG ACT AAA CCT GGT TAT GTA GAT TCC ATTCAA AAA GGT ATA CAA AAG CCA AAA TCT GGT ACA CAA GGA AAT TAT GAC GAT GATTGG AAA GGG TTT TAT AGT ACC GAC AAT AAA TAC GAC GCT GCG GGA TAC TCT GTAGAT AAT GAA AAC CCG CTC TCT GGA AAA GCT GGA GGC GTG GTC AAA GTG ACG TATCCA GGA CTG ACG AAG GTT CTC GCA CTA AAA GTG GAT AAT GCC GAA ACT ATT AAGAAA GAG TTA GGT TTA AGT CTC ACT GAA CCG TTG ATG GAG CAA GTC GGA ACG GAAGAG TTT ATC AAA AGG TTC GGT GAT GGT GCT TCG CGT GTA GTG CTC AGC CTT CCCTTC GCT GAG GGG AGT TCT AGC GTT GAA TAT ATT AAT AAC TGG GAA CAG GCG AAAGCG TTA AGC GTA GAA CTT GAG ATT AAT TTT GAA ACC CGT GGA AAA CGT GGC CAAGAT GCG ATG TAT GAG TAT ATG GCT CAA GCC TGT GCA GGA AAT CGT GTC AGG CGATCA GTA GGT AGC TCA TTG TCA TGC ATA AAT CTT GAT TGG GAT GTC ATA AGG GATAAA ACT AAG ACA AAG ATA GAG TCT TTG AAA GAG CAT GGC CCT ATC AAA AAT AAAATG AGC GAA AGT CCC AAT AAA ACA GTA TCT GAG GAA AAA GCT AAA CAA TAC CTAGAA GAA TTT CAT CAA ACG GCA TTA GAG CAT CCT GAA TTG TCA GAA CTT AAA ACCGTT ACT GGG ACC AAT CCT GTA TTC GCT GGG GCT AAC TAT GCG GCG TGG GCA GTAAAC GTT GCG CAA GTT ATC GAT AGC GAA ACA GCT GAT AAT TTG GAA AAG ACA ACTGCT GCT CTT TCG ATA CTT CCT GGT ATC GGT AGC GTA ATG GGC ATT GCA GAC GGTGCC GTT CAC CAC AAT ACA GAA GAG ATA GTG GCA CAA TCA ATA GCT TTA TCG TCTTTA ATG GTT GCT CAA GCT ATT CCA TTG GTA GGA GAG CTA GTT GAT ATT GGT TTCGCT GCA TAT AAT TTT GTA GAG AGT ATT ATC AAT TTA TTT CAA GTA GTT CAT AATTCG TAT AAT CGT CCC GCG TAT TCT CCG GGT CAT AAA ACG CAT GCA CCT GGT GGAGGA TCC GGT GGA GGA TCT GCA CCC ATG GCA GAA GGA GGA GGG CAG AAT CAT CACGAA GTG GTG AAG TTC ATG GAT GTC TAT CAG CGC AGC TAC TGC CAT CCA ATC GAGACC CTG GTG GAC ATC TTC CAG GAG TAC CCT GAT GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAGCCA TCC TGT GTG CCC CTG ATG CGA TGC GGG GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC CTGGAG TGT GTG CCC ACT GAG GAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATT ATG CGG ATC AAACCT CAC CAA GGC CAG CAC ATA GGA GGG ATG AGC TTC CTA CAG CAC AAC AAA TGTGAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAA GAA AAT CCC TGT GGG CCT TGCTCA GAG CGG AGA AAG CAT TTG TTT GTA CAA GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT TCCTGC AAA AAC ACA GAC TCG CGT TGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA AAC GAA CGTACT TGC AGA TGT GAC AAG CCG AGG CGG TGA CTG CAG GCA TGC AAG CTT GAG TATSEQ ID NO.6序列特征(A)长度549个氨基酸；(B)类型氨基酸；(C)拓补结构线性分子类型蛋白质序列描述Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser IleGln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Tbr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp AspTrp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser ValAsp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr TyrPro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile LysLys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr GluGlu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu ProPhe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala LysAla Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly GlnAsp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg ArgSer Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg AspLys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn LysMet Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr LeuGlu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys ThrVal Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala ValAsn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr ThrAla Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp GlyAla Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser SerLeu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly PheAla Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His AsnSer Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr His Ala Pro Gly GlyGly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His HisGlu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile GluThr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe LysPro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly LeuGlu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile LysPro His Gln Gly Gln His Ile Gly Gly Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys CysGlu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro CysSer Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys SerCys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu ArgThr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
权利要求
1.一种融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白包括白喉毒素氨基酸片段、血管内皮生长因子氨基酸片段以及位于两者之间的中间连接肽序列。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的白喉毒素氨基酸片段为白喉毒素N端385-390个氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的中间连接肽序列由6-15个甘氨酸或丝氨酸组成。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的白喉毒素氨基酸片段为白喉毒素N端385-390个氨基酸序列，所述的中间连接肽序列由6-15个甘氨酸或丝氨酸组成的。
5.如权利要求1或5所述的融合蛋白，其特征在于，所述的白喉毒素氨基酸片段为白喉毒素N端389个氨基酸。
6.如权利要求1或5所述的融合蛋白，其特征在于，所述的血管内皮生长因子氨基酸片段为血管内皮生长因子VEGF165。
7.如权利要求1或5所述的融合蛋白，其特征在于，所述的中间连接肽序列为Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser。
8.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的白喉毒素氨基酸片段为白喉毒素N端389个氨基酸，所述的血管内皮生长因子氨基酸片段为血管内皮生长因子VEGF165，所述的中间连接肽序列为Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser。
9.一种制备如权利要求1或5或9所述融合蛋白的方法，包括以下步骤(1)将白喉毒素片段和血管内皮生长因子片段分别进行PCR扩增，所用引物因引入了编码中间连接肽的核苷酸及酶切位点；(2)将上述PCR产物酶切后回收目的片段，然后连接转入表达质粒；(3)将上述得到的质粒转入大肠杆菌，在适宜的培养条件下表达；(4)离心收集菌体，超声裂解后经洗涤得到粗制包涵体；(5)依次经透析、离子交换和凝胶过滤后得到纯化的融合蛋白。
10.如权利要求1或5或9所述的融合蛋白，用于制备实体瘤治疗药物。
全文摘要
本发明涉及一种抗肿瘤的重组免疫毒素及其制备方法和应用。本发明构建了一种靶向毒素融合蛋白，其含有白喉毒素氨基酸片段、血管内皮生长因子氨基酸片段以及中间的连接肽。该融合蛋白的制备方法包括1)构建含有目标的质粒；2)将质粒转入大肠杆菌表达；3)离心收集菌体，超声裂解经洗涤得到粗制包涵体。4)透析、离子交换和凝胶过滤。本发明靶向毒素融合蛋白细胞毒强，应用剂量少，生产成本低；对生长初期肿瘤和一定发展程度的肿瘤均具有抑制效果；适用于各种实体瘤、视网膜疾病、艾滋病等。
文档编号C12P21/00GK1477129SQ0314808
公开日2004年2月25日 申请日期2003年6月30日 优先权日2003年6月30日
发明者张智清, 柴映爽, 姚立红, 陈爱珺 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所, 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制