专利名称：狗B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及狗B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆、 表达技术。
背景技术：
人B淋巴细胞刺激因子(hBAFF)是1999年新发现的一种与人体免疫调控密切相关 的肿瘤坏死因子家族成员，主要在外周血单核细胞、脾脏、淋巴结和骨髓中表达。hBAFF具有 很强的B细胞趋化性，体外它作为B细胞增殖和分化的共刺激因子，能诱导活化的B细胞分 泌大量的IgG、IgA、IgM等，对于休眠B细胞，hBAFF虽不能独立激活使之进入细胞周期循环， 但它通过上调细胞表面的抗凋亡蛋白BC1-2、BC1-X[的表达，可延长休眠B细胞的寿命。体 内它可以促进脾脏内Tl-B细胞向T2-B细胞以及成熟B细胞的发育。hBAFF的正常表达是 GC形成、抗体亲和力成熟、记忆性B细胞形成及B细胞正常发育的必须条件。BAFF-/-小鼠 的次级淋巴器官囊外及过渡区B细胞完全缺失。hBAFF刺激B细胞增殖、分化并分泌抗体，成 熟的B细胞及其产生的抗体构成了机体抵御感染和抑制肿瘤滋生的关键组分。由于hBAFF 的免疫增强特异活性，自从被发现以来就显示了巨大的临床应用前景。2000年11月，美国 FDA已正式批准重组人hBAFF进入人体临床试验，用于治疗普通变异免疫缺乏症(CVID)患 者ο根据GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库搜索结果得知，目前 人、鼠、猪、牛、羊、兔、鸡、鸭、鹅的BAFF cDNA已被克隆，并分别已在GenBank数据库中申请 了序列号，序列号分别是 AF116456、AF119383、EF041845、EU213012、FJ793192、EF202603、 AF506010.DQ445092及DQ874394。狗B淋巴细胞刺激因子(dBAFF) cDNA还未被克隆出来， 关于狗BAFF基因的研究在整个国内外还处于完全空白状态。狗不仅给我们提供鲜美的肉类、还能看家、放牧、并作为公安、军队的得力战将，保 护国家、人民的财产安全，被誉为“人类最忠实的朋友”。随着人们生活水平的提高，宠物狗 也逐渐与人们的生活息息相关，是饲养率最高的宠物。因此，狗的疾病的预防及控制已成为 大家关心的问题。由于B淋巴细胞刺激因子(BAFF)具有较强的免疫增强能力，基因工程狗 BAFF蛋白有可能开发成一种能增强狗类免疫能力的生物制剂，以增强犬类的免疫能力。近 年来，随着对细胞因子研究的不断深入和分子生物学技术的发展，大量的细胞因子得以克 隆及重组表达，许多细胞因子基因工程药物面市，给治疗疾病提供了新的手段，同时创造了 巨大的经济和社会效益，因此，重组dBAFF蛋白具有潜在的巨大市场应用价值。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种从狗提取的B淋巴细胞刺激因子cDNA，并 提供狗B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法及重组技术。本发明从狗中克隆到B淋巴细胞刺激因子cDNA，它具有SEQ ID NO. 1所示的序列。本发明的狗B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法如下(1)从狗脾脏组织提取总RNA
(2)利用RT-PCR方法通过同源克隆(homologycloning)策略并结合cDNA末端快速扩 增法(RACE)克隆狗全长BAFF cDNA序列SEQ ID NO. 1。上述狗B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法具体操作如下
(1)利用Trizol试剂一步法提取狗脾脏组织总RNA
(2)通过Clustalw软件分析人、鼠、鸡、鸭、鹅、猪BAFF cDNA保守区，设计 兼并弓丨物 dBAFFl :5，-TTGTNCCNTGGCTTCTNAGCTTTAA-3，(SEQ ID N0. 4) ；dBAFF2 5，-GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3’ (SEQ ID NO. 5)进行 PCR 扩增，得到!MObp 的片段 Pl。(3)用已得到的上述同源克隆片段Pl设计特异性引物(GST2 5'-CGCAAAGCTGGAAGAAGGAGATGAG-3' , SEQ ID N0. 6 ；GST3 5'-GTCCCATGGCAAAG GTGTTATCGGTG-3，，SEQ ID N0. 7)。3，RACE 扩增得到 BAFF 全长 cDNA 3，末端片段 P2 (包 括3’ UTR), 5' RACE扩增得到BAFF全长cDNA 5'末端片段P3 (包括5’ UTR)。将获得的 PI、P2、P3三条序列以BLAST2软件拼接，获得BAFF全长cDNA (SEQ ID NO. 1)。将所得序列与GenBank数据库序列进行相似性搜索，发现与已知的人、鼠、猪、牛、 羊、兔、鸡、鸭、鹅BAFF序列相似率都比较高，分别是83%、66%、62%、81%、81%、80%、37%、57%、 57%，可以确定该序列是狗B淋巴细胞刺激因子(dBAFF)的全长cDNA。对该基因的进一步研究荧光定量PCR分析dBAFF在各个组织(心、肝、脾、肺、肾) 中的表达表明，dBAFF主要在免疫器官表达，如脾，在小肠中表达量最低；该基因的重组融 合蛋白具有dBAFF的高活性功能；该基因编码的蛋白对小鼠淋巴细胞具有明显的促存活/ 增值效应。上述狗B淋巴细胞刺激因子(dBAFF)的cDNA的重组应用，通过现有基因工程方法， 生产重组dBAFF，作为狗的免疫增强剂，增强其免疫力，在饲养中应用。
图1是dBAFF全长cDNA碱基序列(GenBank NO. FJ793193)及对应的氨基酸序列 (□)和(★)标记的为终止密码子TGA
图2是dBAFF与牛、猪、人、兔、鼠BAFF全长氨基酸序列同源性比较图。跨膜区域用虚 线标注，方框和箭头所示为furin蛋白酶切位点，双线标注部位为Flap环，(★)为三个保守 的Cys残基，划线部分为TNF保守区。图3是dBAFF mRNA在各组织中的表达水平分析。GAPDH作为内参。图4是dBAFF的预测空间结构(左侧)，右侧为human BAFF的预测空间结构。图5是融合蛋白sumo-dsBAFF在BL2KDE3)中的诱导表达，Ni+柱纯化的SDS-PAGE 鉴定及鼠抗His6-tag的western-blotting鉴定结果。图中条带1是未经IPTG诱导的全菌 蛋白；2是经IPTG诱导4. 5小时后的全菌蛋白；3是经Ni+纯化后的目的蛋白；4是用sumo 蛋白酶酶切之后的蛋白dsBAFF ；5是用鼠抗Hk6单抗的western-blotting鉴定结果。图6是在体外通过MTT细胞毒试验检测sumo-dsBAFF对小鼠淋巴细胞促存活作用 的结果。如图所示，PBS为空白对照，10ug/ml SUM0-dsBAFFU0ug/ml SUMO+anti-mouse IgM 为阴性对照。图7是流式细胞术检测sumo-dsBAFF对小鼠淋巴细胞的促存活作用。左侧为只加PBS的空白对照，右侧为用16ug/ml SUMO-dsBAFF+anti-mouse IgM处理48小时后的检测结果。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发 明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。实施例1
8月龄中国太行狗；购自南京红太阳农场
(1)引物设计通过Clustal w软件分析人、鼠、鸡、鸭、鹅、猪BAFF cDNA 保守区，设计兼并引物 dBAFFl :5’-TTGTNCCNTGGCTTCTNAGCTTTAA-3’ ；dBAFF2 5’-GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3'。(2)提取总RNA 应用RNA抽提试剂TRIzol (Invitrogen公司)按照其操作手 册提取狗脾脏细胞的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光 光度计测定其浓度。(3) RT-PCR 以上述dBAFFl及dBAFF2为引物进行PCR扩增，得到!MObp的片 段P1。①逆转录
在DEPC处理的1. 5ml Eppendorf管中依次加入总RNA抽提物3 μ 1，Oligo d(T)18 1μ 1， 10mmol/L dNTP 2 μ 1，DEPC水5 μ 1置于；65 ° C，15min后立即冰浴5min ；再在上述体系 中加入 5 X RT 反应缓冲液 4 μ 1，RNase inhibitor 0· 5 μ 1 (20u)，AMV 反转录酶 2 μ 1，DEPC 水2. 5μ1至总体积为20μ1的反应液，于42 ° C反应1.5h，94 ° C，IOmin终止反应，置 于冰上； ②PCR
利用逆转录所得模板进行PCR，体系为5 O μ 1，10 μ mo 1 /L上、下游引物各2. 5 μ 1， 2. 5mmol/L dNTP 4 μ 1，25mmol/L MgCl2 3 μ 1，IOX 缓冲液 5 μ 1，cDNA 模板 5 μ 1，rTaq 酶 IylJnddH2O 27 μ I0 反应程序为94 ° C 5min，94 ° C 30s, 56 ° C 30s,72° C lmin, 30个循环，最后72 ° C孵育5min。反应完成后将产物于1%琼脂糖凝胶中电泳分离，用胶回收试剂盒回收得到约 340bp的DNA条带，克隆入pMDIS-T载体，经含Amp抗生素(50mg/ml)的琼脂糖平板筛选转 化子，挑出阳性克隆送往上海英骏测序公司进行碱基序列测定。(4) cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆狗全长BAFF cDNA序列。用已得到的上 述片段 Pl 设计特异性引物(GST2 5' -CGCAAAGCTGGAAGAAGGAG ATGAG-3，；GST3 5，-GTCCCA TGGCAAAGGTGTTATCGGTG-3，)。3，RACE 扩增得到 BAFF 全长 cDNA 3，末端片段 P2 (包括 3， UTR), 5' RACE扩增得到BAFF全长cDNA 5’末端片段P3(包括5’ UTR)。将获得的P1、P2、 P3三条序列以BLAST2软件拼接，获得BAFF全长cDNA。根据此BAFF全长cDNA序列，在5’端和 3，端分别设计引物 dBAFF3 (5，-ATGGATGGCTGCACAGAAGGCCAGC-3，)、dBAFF4 (5，-TCA CAGA A GC T TCAATGCACCAAAAAACG-3，)扩增 dBAFF 的编码区序列(SEQ ID NO. 2)，并对相 应的氨基酸序列进行序列比对，对系统关系及分子结构进行生物信息学分析。(5)同源检索将所得序列向 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ 提交克隆 得到的cDNA序列在GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库进行相似性搜 索及同源性分析，如图2所示，发现与已知的人(GenBank号NP-006564)、鼠(GenBank号 NP-296371)、牛(GenBank 号 ΝΡ-001107978 )、猪(GenBank 号 ΝΡ-001090967 )、兔(GenBank 号 NP-001093434)氨基酸序列相似性很高，分别为80、58、78、82和76%，其可溶部分氨基酸序 列相似性分别为91、82、96、95和91%，可以确定该序列是狗B淋巴细胞刺激因子(dBAFF)的 编码区cDNA SEQ ID NO. 2序列，碥码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。实施例2
狗BAFF基因在各组织的表达水平分析
采用实施例1中的提取RNA的方法，分别提取了狗心(heart)、肝(liver)、脾 (spleen)、肺(lung)、肠(intestine)的总RNA，并用逆转录酶逆转录成cDNA，以GAPDH为内 参，运用real time-PCR法对dog BAFF基因在各组织的表达水平进行了研究。目的基因的扩增引物为，dBAFFrl :5’-TCTTTGGGGATGAACTGA GC-3，； dBAFFr2 5'-CAGAAGCTTCAATGCACCAA-3' ；GAPDH 的扩 ±曾弓| 物为 dGAPD Hl: 5' -AGTCATCCATGACCACTTCGGCAT-3' ；dGAPDH2 5' -AAGCAGGG
ATGATGTTCTGGGCAGC-3’。以DEPC水为空白对照，每样做三个复孔。反应体系为Mix 12. 5 μ 1，H2O 9. 5 μ 1，Primerl 1 μ 1，Primer2 1 μ 1，templete 1 μ 1。反应程序为 95 °C /3 min,40 cycles (95 °C /30 s，60 V /1 min )。在每个样品的在扩增曲线的指 数增长区适当位置设定荧光检出界限值即阈值(threshold)就会得到阈值与扩增曲线的交 点Ct值，Ct值是指达到阈值时的循环圈数(threshold cycle)，该值与起始模板数的对数 值成反比线性关系。每个目的基因的Λ值与对应的GAPDH的Λ值的差为ΔΛ，各样品的 ΔΛ与表达量最低的样品的ΔΛ的差为Δ Δ Λ, dBAFF在各个样品中的相对模板数可表 示为1一。结果如图3所示，dBAFF主要表达在免疫器官表达，如脾，在小肠中表达量最 低。狗BAFF重组表达载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达
根据dog BAFF cDNA序列和pSUMO的^to I酶切位点，设计一对特异性PCR弓丨 物 ds-sul (5' -TGCCATTCAGGGGCCGGAAGAA-3')禾口 ds_su2 (5' -TCA T GGATCC TCA CAGAAGCTTCAATGCA-3’)，并在下游引物插入I酶切位点。将扩增片段亚克隆入pSUMO 载体，构建成重组载体pSUMO-dsBAFF。将此重组载体转入大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)， 胞浆内可高可溶性表达出目的蛋白SUMO-dsBAFF。经SDS-PAGE检测(图5)显示，此融合蛋 白的大小大约37kDa。用SUMO蛋白酶将标签SUMO切除后，得到大小约为17kDa的dsBAFF。重组目的蛋白的Ni+亲和纯化
IPTG低温诱导含有重组载体pSUMO-dsBAFF的大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3 )24小时后， 4°C收菌，冰上超声破碎(160W,工作4s，暂停8s，共99次)表达菌体，4°C，13，000 X g，20min 离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni+-NTA柱。简要过程是3体积Binding Buffer平衡Ni+-NTA柱后，手动上样含可溶性重组蛋白的上清，先后用10倍体积的Binding buffer 和 6 倍体积的 Washing buffer (20 mmol/L Lnidazole，0· 5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris HCl, pH 7. 9)洗去杂蛋白，最后用 Elute buffer (1 mol/L Imidazole，0. 5 mol/L NaCl，20 mmol/L TrisHCl, pH 7.9)洗脱目的蛋白，分管收集，PBS除盐。SDS-PAGE检测各收集管蛋 白纯度和紫外分光光度计测定蛋白浓度。如图5(条带3)所示，表达得到的目的蛋白经Ni+ 柱亲和纯化得到纯度达95%的活性目的蛋白。Western 印记分析
Western-blot中所用一抗为鼠抗Hk6单抗，二抗为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG。 其简要步骤是将样品先进行SGS-PAGE，然后以浸入式法将蛋白电转移至硝酸纤维素膜 (NC膜)上，用记号笔标记蛋白marker各条带，然而依次经5%脱脂奶粉室温封闭lh，与一 抗孵育lh，与HRP标记的二抗IgG孵育lh，每步完成后均严格洗膜，最后加TMB避光显色。 结果如图5 (条带5)所示在目的蛋白位置出现了特异性条带。dsBAFF空间结构预测
如图4所示，dsBAFF空间结构预测模型和hsBAFF空间结构模型比较，由此看出，其空 间结构与人BAFF已知结构非常相似。狗BAFF对狗淋巴细胞促存活作用实验 (1) MTT
将小鼠脾脏于盛有PBS溶液的小平皿中剪碎，充分研磨后过200目网筛，用PBS洗数 次，去除红细胞后加入淋巴细胞分离液进行分离得到小鼠淋巴细胞。将分离得到的小鼠淋 巴细胞用 RPMI 1640 (含 10%FCS，100U/ml penicillin/strep tomycin)培养液调整细胞 浓度至约5X IO6个/ml，在96孔板中每孔加入50 μ 1细胞，150 μ 1 RPMI 1640培养液。再 分组依次加入重组蛋白，重组蛋白的终浓度分别为2、4、6、8、10、12 μ g/ml, anti-IgM终浓 度均为 2 μ g/ml ；以 PBS 为空白对照，6 μ g/ml SUM0_dsBAFF、2 μ g/ml SUMO +anti-mouse IgM为阴性对照。在37° C、5%C02浓度条件下培养48h后每孔加入50μ 1 2 mg/mL MTT, 37° C，5%C02继续培养4h，离心，去上清，加入150 μ 1 DMSO微孔板震荡上震荡10分钟，使 结晶物溶解，测定各孔OD49tl值。实验设三复孔，取其平均值，并计算标准误差。结果如图6 所示，本实验克隆得到的SUMO-dsBAFF对小鼠淋巴细胞都具有明显的促存活效应，且呈现 剂量依赖效应。(2)流式细胞术FCM
将小鼠脾脏于盛有PBS溶液的小平皿中剪碎，充分研磨后过200目网筛，用PBS洗数 次，去除红细胞后加入淋巴细胞分离液进行分离得到小鼠淋巴细胞。将分离得到的小鼠淋 巴细胞(5X IO5)与 10 μ g/ml SUMO-dsBAFF +anti-mouse IgM 在 37° C，5% CO2 培养 48h 后用PBS洗三遍，再用10 μ g/ml的PI在37° C染色30min后用PBS洗三遍。用流式细 胞仪(BD bioseicnces)检测。以加PBS作为空白对照。结果如图7所示，与对照相比，在 anti-mouse IgM的共刺激作用下，融合蛋白SUMO-dsBAFF能够促进小鼠淋巴细胞的存活。实施例3
将实施例1获得的狗B淋巴细胞刺激因子cDNA通过现有基因工程方法，生产重组dog BAFF，作为犬类免疫增强剂。实施例4 将实施例1获得的狗B淋巴细胞刺激因子cDNA通过现有基因工程方法，转入动物体 内，增加其免疫力，在饲养中应用。 按照本发明的方法可以通过现有基因工程技术，修饰狗B淋巴细胞刺激因子基因 并用于所述研究和生产。
权利要求
1.狗B淋巴细胞刺激因子CDNA，其特征在于，具有SEQID NO. 1所示的序列。
2.—种权利要求1所述的狗B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法如下(1)TRIzol法提取狗脾脏总RNA；(2)设计兼并引物dBAFFl :5’-TTGTNCCNTGGCTTCTNAGCTTTAA-3’ ；dBAFF2 5' -GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3，；进行 PCR 扩增，得到!MObp 的片段 Pl ；(3)用得到的上述同源克隆片段Pl设计特异性引物GST2 5，-CGCAAAGCTGGAAGAAGGAGATGAG-3，；GST3 5'-GTCCCATGGCAAAG GTGTTATCGGTG-3，；3， RACE扩增得到BAFF全长cDNA 3’末端片段P2;5，RACE扩增得到BAFF全长cDNA 5’末 端片段P3 ；将获得的PI、P2、P3三条序列以BLAST2软件拼接，获得BAFF全长cDNA。
3.一种权利要求1所述的狗B淋巴细胞刺激因子cDNA的重组应用，是通过现有基因工 程方法，生产重组狗B淋巴细胞刺激因子，作为狗类免疫增强剂。
4.狗B淋巴细胞刺激因子，其特征在于，具有SEQID N0.2所示的序列。
全文摘要
狗B淋巴细胞刺激因子(dogBAFF)cDNA及其克隆方法和重组应用，涉及生物基因工程领域。狗B淋巴细胞刺激因子的基因具有SEQIDNO.1所示的序列。其克隆方法如下TRIzol法提取狗脾脏总RNA并进行逆转录；通过Clustalw软件分析人、鼠、鸡、鸭、鹅BAFFcDNA保守区设计兼并引物进行PCR扩增，获得340bp的扩增片段P；根据片段P设计特异性引物，通过RACEPCR克隆全长BAFFcDNA。所述狗B淋巴细胞刺激因子的cDNA可通过现有基因工程方法，生产重组dogBAFF，作为犬类免疫增强剂。
文档编号A61K39/00GK102121012SQ20101059831
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者张双全, 沈月芬, 王书乐 申请人:南京师范大学