专利名称：暗纹东方鲀B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因组学、生物信息学、基因操作、蛋白质和细胞领域，具体涉及暗纹 东方飩B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆、表达和鉴定技术。
背景技术：
人B淋巴细胞刺激因子(hTALL-Ι)是1999年新发现的一种与人体免疫调控密切相 关的肿瘤坏死因子家族成员，主要在外周血单核细胞、脾脏、淋巴结和骨髓中表达。hTALL-1 具有很强的B细胞趋化性，体外它作为B细胞增殖和分化的共刺激因子，能诱导活化的B 细胞分泌大量的IgG、IgA、IgM等，对于休眠B细胞，hTALL-Ι虽不能独立激活使之进入细 胞周期循环，但通过上调细胞表面的抗凋亡蛋白Bcl-2、BcI-Xl的表达，延长休眠B细胞的 寿命。体内它可以促进脾脏内Tl-B细胞向T2-B细胞以及成熟B细胞的发育。hTALL-Ι的 正常表达是GC形成、抗体亲和力成熟、记忆性B细胞形成及B细胞正常发育的必须条件。 TALL-I-/-小鼠的次级淋巴器官囊外及过渡区B细胞完全缺失。hTALL-Ι刺激B细胞增殖、 分化并分泌抗体，成熟的B细胞及其产生的抗体构成了机体抵御感染和抑制肿瘤滋生的关 键组分。由于hTALL-Ι的免疫增强特异活性，自从被发现以来就显示了巨大的临床应用前 景。2000年11月，美国FDA已正式批准重组人hTALL-Ι进入人体临床试验，用于治疗普通 变异免疫缺乏症(CVID)患者。根据GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库搜索结果得知，目 前只有人、鼠、鸡、鸭、斑马鱼等的TALL-I cDNA已被克隆，并分别已在GenBank数据库中申 请了序列号，序列号分别是 AF116456、AF119383、AF506010、DQ445092 及 FJ587513。暗纹 东方飩B淋巴细胞刺激因子(fTALL-1) cDNA还未被克隆出来，关于暗纹东方飩TALL-I基因 的研究在整个国内外还处于完全空白状态。暗纹东方飩是十分重要的鱼类，由于B淋巴细 胞刺激因子(TALL-I)具有较强的免疫增强能力，基因工程暗纹东方飩TALL-I蛋白有可能 开发成一种能增强鱼类免疫能力的生物制剂，用于体质弱、免疫功能低下的鱼，增加河飩类 抗病能力。近年来，随着对细胞因子研究的不断深入和分子生物学技术的发展，鱼类细胞 因子得以克隆及重组表达，许多细胞因子基因工程药物面市，给治疗鱼类疾病提供了新的 手段，同时创造了巨大的经济和社会效益，因此，重组河飩鱼TALL-I蛋白具有潜在的巨大 市场应用价值。同时，B淋巴细胞刺激因子(TALL-I)是新发现的免疫系统重要调控因子，对 暗纹东方飩TALL-I的研究有助于探索鱼类的免疫调控机制，推动其免疫系统研究的发展。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种从暗纹东方飩提取的B淋巴细胞刺激因子 cDNA,并提供暗纹东方飩B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法及重组技术。本发明从暗纹东方飩中克隆到B淋巴细胞刺激因子cDNA，它具有SEQ ID NO. 1所 示的序列。
本发明的暗纹东方飩B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法如下
(1)根据暗纹东方飩基因组B淋巴细胞刺激因子的序列设计引物
正义寡核苷酸引物 fTALL-11 :5，- ATGGGACCAGTGAGGGTAGGTTT-3，(SEQ ID NO. 3) 反义寡核苷酸引物 fTALL-12 :5’ - TTAACCCAGTTTGATAGCACCCA-3，(SEQ ID NO. 4 )
(2)从暗纹东方飩脾脏提取总RNA；
(3)通过RT-PCR方法，以上述引物fTALL-11及fTALL-12为特异性引物，扩增出一段 cDNA序列，克隆入pMD19-T载体，并对其碱基序列进行测定，
上述暗纹东方飩B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法具体操作如下 (1)根据暗纹东方飩基因组B淋巴细胞刺激因子全长⑶S两端设计的正义寡核苷酸引 物 fTALL-11 (5，- ATGGGACCAGTGAGGGTAGGTTT-3，)与反义寡核苷酸引物 fTALL-12 (5，-TTAACCCAGTTTGATAGCACCCA-3，)。(2)应用组织RNA提取试剂盒(天根生物公司)，按照操作手册，提取出暗纹东方飩 脾脏细胞的总RNA，
(3)应用两步RT-PCR方法，以上述fTALL-11及fTALL-12为特异性引物，扩增出全长 cDNA序列，全长为789bp，克隆入pMD19_T载体，并对其碱基序列进行测定。第一步逆转录的 反应条件为以总RNA为模板，在25 μ 1反应体系中，加入5 XM-MLV反应缓冲液5 μ 1、IOmM dNTP 混合物 1· 5μ 1、RNase inhibitor (HRPl) 1 μ l、M_MLV(RNase F)逆转录酶(Takara 公司)lyl、01igo (dT) 18 primer Ιμ 、及 RNA 模板 3 μ 1，补水至 25 μ 1，42°C 保温 lh。 第二步进行用两个特异性弓I物进行30个PCR循环(940C变性30s，56 V退火30s，72°C延伸 lmin)，最后于72°C延伸7 min。RT-PCR产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂 盒回收约789bp的DNA条带，克隆入pMD19-T载体，挑取8个阳性克隆进行碱基序列测定。将所得序列与GenBank数据库序列进行相似性搜索，发现与已知的虹鳟鱼、斑马 鱼TALL-I序列相似率分别是68. 2%,56. 14%、，可以确定该序列是暗纹东方飩B淋巴细胞刺 激因子(fTALL-Ι)的全长cDNA，其开放阅读框如SEQ ID NO. 1所示。对该基因的进一步研究表明该基因主要表达在暗纹东方飩免疫器官中，包括脾 脏及肾脏。该基因的重组融合蛋白具有fTALL-Ι的高活性功能；该基因编码的蛋白对暗纹 东方飩B淋巴细胞具有明显的促存活/增殖效应；对鼠的B淋巴细胞都具有促存活/增 殖的生物学功能；充分表明本发明克隆得到的基因就是暗纹东方飩B淋巴细胞刺激因子 (fTALL-Ι)的 cDNAo上述暗纹东方飩B淋巴细胞刺激因子(fTALL-Ι)的cDNA的重组应用，通过现有基 因工程方法，生产重组fTALL-Ι，作为河飩鱼免疫增强剂。所说的暗纹东方飩B淋巴细胞刺激因子cDNA通过现有基因工程和细胞工程方法， 转入河飩鱼体内，增加其免疫力，在饲养中应用。
图1是暗纹东方飩TALL-I全长cDNA碱基序列及推测编码氨基酸序列。图2是暗纹东方飩TALL-I与绿河飩、斑鳟鱼、虹鳟鱼、斑马鱼TALL-I全长氨基酸 序列同源性比较图。其中波浪线代表furin酶切位点；虚线代表跨膜区；双线代表flap环； 粗横线代表保守区域；深色阴影代表保守的三个半胱氨酸。
图3是暗纹东方飩TALL-I胞外区结构模型。深灰色代表β折叠，白色代表其他 氨基酸残基。a和b代表暗纹东方飩的卡通模型和球体模型结构。c和d代表人的卡通模 型和球体模型结构。图4是暗纹东方飩TALL-I mRNA在各组织中的表达水平分析图。GAPDH作为内参。图5是融合蛋白His-fsTALL-Ι在BL21 (DE3)中的诱导表达，Ni+柱纯化的 SDS-PAGE鉴定及鼠抗His6-tag的western-blotting鉴定结果，图中泳道1是未经 IPTG诱导的全菌，泳道2是经IPTG诱导4. 5小时后的全菌蛋白，泳道3是经Ni+柱纯化 后目的蛋白，泳道4是经sumo蛋白酶切后的目的蛋白，泳道5是鼠抗His6-tag单抗的 western-blotting 鉴定结果。图6是本发明克隆的基因对暗纹东方飩B淋巴细胞的促存活作用结果示意图。说 明不同浓度的sumo-fsTALL-Ι作用暗纹东方飩B淋巴细胞48小时后，对暗纹东方飩B淋巴 细胞可见显著的促存活作用，且呈剂量依赖效应。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发 明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。实施例1
暗纹东方飩(Takifugu obscures )，人工饲养。(1)引物设计以绿河飩的TALL-I序列为种子序列在红鳍东方飩的基因组数 据库中找出B淋巴细胞刺激因子全长cDNA序列。将绿河飩和红鳍东方飩的序列比对 精心选取出两段高保守区域用来设计同源克隆的正义寡核苷酸引物fTALL-11 (5’ -ATGGGACCAGTGAGGGTAGGTTT-3，，如 SEQ ID NO. 3 所示)与反义寡核苷酸引物 fTALL-12 (5，-TTAACCCAGTTTGATAGCACCCA-3，如 SEQ ID NO. 4 所示)。(2)提取总RNA 应用RNA抽提试剂盒(天根公司)按照其操作手册提取出约0. 5 克暗纹东方飩脾脏细胞的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外 分光光度计测定其浓度。(3)应用RT-PCR方法，以上述fTALL-11及fTALL-12为特异性引物，扩增出 fTALL-1 cDNA的一段序列，全长为789bp，克隆入pMD19_T载体，并对其碱基序列进行测定。 第一步逆转录的反应条件为以总RNA为模板，在25 μ 1反应体系中，加入5 XM-MLV反应缓 冲液5 μ l、10mM dNTP混合物 1· 5μ 1、RNase inhibitor (HRPl) 1 μ l、M_MLV(RNase『)逆 转录酶(Takara 公司)1μ l、01igo (dT)18 primer Ιμ 、及 RNA 模板 3“1，补水至25口1， 42°C保温lh。第二步进行用两个特异性引物进行30个PCR循环(94°C变性30s，56°C退火 30s，72°C延伸lmin)，最后于72°C延伸7 min。RT-PCR产物用的琼脂糖凝胶电泳分离 后，用胶回收试剂盒回收约789bp的DNA条带，克隆入pMD19-T载体，经含Amp抗生素(50mg/
5ml)的琼脂糖平板筛选转化子，挑取出8个阳性克隆送往上海英骏测序公司进行碱基序列 测定，得到如图1所示的fTALL-Ι全长cDNA碱基序列及推测编码氨基酸序列。(6)同源检索将所得序列向http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/提交克隆得 到的cDNA序列在GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库进行相似性搜索及 同源性分析，如图3所示，发现与已知的虹鳟鱼(ABC84582)、斑鳟鱼(NP_001135232)、绿河 M (ENSTNIP00000016931)TALL-I氨基酸序列相似性分别是98%、92%、55%、44%，可以确定该 序列是暗纹东方飩B淋巴细胞刺激因子(gTALL-Ι)的全长cDNA。并且其开放阅读框具有 SEQ ID NO. 1序列，碥码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。实施例2
fTALL-Ι基因在各组织的表达水平分析
采用实施例1中的提取RNA的方法，分别提取了暗纹东方飩肝(liver)、肾(kidney)、 脾(sp 1 een)、心(heat)、鳃(gi 11)、肠(intestine )的总 RNA，运用定量 RT-PCR 法对 fTALL-I 基因在各组织的表达水平进行了研究，结果如图4所示，fTALL-Ι基因主要表达在暗纹东 方飩类免疫器官中，包括脾脏及肾脏。试验中暗纹东方飩GAPDH作为内参，采用的引物为 RT-Gl (5，- CACCTCCAAGAAGGTGGAAA-3，，SEQ ID NO. 5)和 RT-G2 (5，-CTCTCGTGGAAAACGGTGAT-3，，SEQ ID NO. 6)。RT-PCR 体系如实施例 1。可溶性fTALL-Ι重组载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达
以实施例1得到的fTALL-Ι全长cDNA为模板，设计引物SPl (5，-TTTGGCCGGGACAGACACGTT-3，(Stu / )，SEQ ID N0. 7)及 SP2 (5，- ACTGAGGGATCCTCAGA AGAGTCTGACGGCACCA -3，QiindIII), SEQ ID N0. 8)扩增出 fTALL-l cDNA 胞外可溶区段 (fsTALL-Ι)，引物分别引入酶切位点份 I RHindIII,亚克隆入pSUMO载体，构建成重组载 体pSUMO-fsTALL-Ι。将此重组载体转入大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)，胞浆内可高可溶性 表达出目的蛋白sumo-fsTALL-Ι，此融合蛋白经促存活与增殖试验(图6，7)，活性检测证实 具有fsTALL-Ι的高活性功能。重组目的蛋白的的Ni+亲和纯化
IPTG诱导含有重组载体pSUMO-fsTALL-Ι的大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3) 4. 5小时 后，4°C收菌，冰上超声破碎(工作10s，暂停10s，共99次)表达菌体，40C，13,000 X g，20min 离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni+-NTA柱。简要过程是3体积Binding Buffer 平衡Ni+-NTA柱后，手动上样含可溶性重组蛋白的上清，6体积Wash Buffer (50mM咪唑， 0.5M NaCl,20mM Tris-HCl pH8. 0)洗去未结合上Ni+-NTA柱的杂蛋白，最后6体积Elute Buffer(lM 咪唑，0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl ρΗ8· 0)洗脱目的蛋白，20mM Tris (ρΗ8· 0)透 析除盐，以SGS-PAGE检测蛋白纯度，如图5 (泳道3)所示，表达得到的目的蛋白经Ni+柱亲 和纯化得到纯度达95%的活性目的蛋白。western 印迹分析
Western-blot中所用一抗为羊抗His6单抗，二抗为辣根过氧化酶标记的鼠抗羊IgG。 其简要步骤是将诱导的产物先行SGS-PAGE，然后以浸入式法将蛋白电转移至硝酸纤维素 膜(NC膜)上，用记号笔标记蛋白marker各条带，然而依次经5%脱脂奶粉室温封闭lh，与 一抗孵育lh，与HRP标记的二抗IgG孵育lh，每步完成后均严格洗膜，最后化学显影。结果 如图5所示在目的蛋白位置出现了特异性条带。
fTALL-I对鼠B淋巴细胞促存活作用实验
采用淋巴细胞分离液常规无菌分离小鼠B淋巴细胞(约98%为B淋巴细胞)，用 RPMI1640调节细胞密度至5 X IO7个/mL.将B细胞悬液加入96孔培养板，每孔100 μ 1。向 每孔内加入不同浓度的sumo-fsTALL-1, 37°C，5% CO2培养48h后每孔加入10 μ 1 5mg/mL MTT, 37°C，5% CO2继续培养4h，加入100 μ 1 DMSO(二甲基亚砜)溶解沉淀物，37°C过 夜，测定各孔OD57tl值.实验设三复孔，取其平均值，并计算标准误差。在体外通过MTT细 胞毒试验检测fTALL-Ι对小鼠B淋巴细胞的促存活作用，如图6所示，结果表明本发明克隆 得到的fTALL-1对小鼠B淋巴细胞具有明显的促存活效应，与鸭、鸡、人、鼠TALL-I的生物 学功能相同，且呈现剂量依赖效应，即当sumo-fsTALL-Ι为12Pg/ml时fTALL-Ι的促增殖作 用最强。实施例3:
将实施例1获得的暗纹东方飩B淋巴细胞刺激因子cDNA通过现有基因工程方法，生产 重组fTALL-1，作为暗纹东方飩类免疫增强剂。实施例4
将实施例1获得的暗纹东方飩B淋巴细胞刺激因子cDNA通过现有基因工程方法，转入 暗纹东方飩体内，增加其免疫力，在饲养中应用。按照本发明的方法可以通过现有基因工程技术，修饰暗纹东方飩B淋巴细胞刺激 因子基因并用于所述研究和生产。
权利要求
1.暗纹东方飩B淋巴细胞刺激因子CDNA，其特征在于，它的序列如SEQID NO. 1所示。
2.—种权利要求1所述的暗纹东方飩B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法如下(1)根据B淋巴细胞刺激因子的保守序列设计引物正义寡核苷酸引物 fBAFFl :5’ -ATGGGACCAGTGAGGGTAGGTTT-3’ 反义寡核苷酸引物 fBAFF2 :5’ -TTAACCCAGTTTGATAGCACCCA-3’(2)从暗纹东方飩脾脏提取总RNA，(3)通过RT-PCR方法，以上述引物fBAFFl及fBAFF2为特异性引物，扩增出一段cDNA 序列，克隆入PMD19-T载体，挑取阳性克隆进行碱基序列测定。
3.一种权利要求1所述的暗纹东方飩B淋巴细胞刺激因子cDNA的重组应用，是通过现 有基因工程方法，生产重组暗纹东方飩B淋巴细胞刺激因子，作为鱼类免疫增强剂。
4.暗纹东方飩B淋巴细胞刺激因子，其特征在于，具有SEQID N0.2所示的序列。
全文摘要
本发明涉及暗纹东方鲀B淋巴细胞刺激因子(fuguTALL-1)cDNA及其克隆方法和重组应用,属于生物基因工程领域。暗纹东方鲀B淋巴细胞刺激因子的基因具有SEQIDNO.1所示的序列。其克隆方法如下根据B淋巴细胞刺激因子的保守序列设计引物；从暗纹东方鲀脾脏提取总RNA；通过两步RT-PCR方法，扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD19-T载体，挑取阳性克隆进行测序。所述暗纹东方鲀B淋巴细胞刺激因子的cDNA可通过现有基因工程方法，生产重组fuguTALL-1，作为河鲀鱼免疫增强剂。
文档编号A61P37/04GK102121010SQ201010598068
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者张双全, 艾洪新 申请人:南京师范大学