专利名称：共刺激因子及融合蛋白的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及共刺激因子B7. I及B7. I融合蛋白的新用途。
背景技术：
宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，它是由人类乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,简称HPV)引起的，HPV病毒可直接通过皮肤接触传播,有十几年的潜伏期，故初期没有任何症状。在全球范围内，全球每年大约有50万女性罹患宫颈恶性肿瘤，死于宫颈恶性肿瘤的超过25万人。在发展中国家，宫颈癌则属于常见多发的妇科肿瘤，排行榜首。当宫颈癌的症状出现三个月后就诊者已有2/3为癌症晚期，因此宫颈瘤成为了威胁女生生命的头号杀手。
尽管宫颈瘤是迄今为止唯一找出治病原因的癌症，但是对于其治疗目前仍与一般肿瘤治疗方案一致，均采用化疗放疗，常规放化疗基本不具备针对肿瘤的特异性，放化疗在破坏癌细胞的同时对正常细胞也产生杀伤作用，从而对人体产生很大的毒副作用，同时还会导致宿主免疫系统的破坏，放化疗后易引起多种并发症而且肿瘤易复发，常规放化疗的特点造成肿瘤治疗的疗效和预后都不是很理想，目前肿瘤免疫治疗成为一种较为安全有效的方式。
肿瘤免疫治疗是直接或间接利用自身的免疫系统，抑制肿瘤细胞生长、转移、清除肿瘤细胞的方法，肿瘤免疫治疗机理与其它治疗手段相比，具有作用特异性高、范围广泛、 毒副作用小等特点。B7. I-Fc是免疫刺激因子融合蛋白(Aihong Liu, Peisheng Hu ；Clin Cancer Res 2005 ； 11 (23) December 1，2005，8492-8502)，它是由 CD80 胞外部分融合在人 Ig抗体恒定区的Fe片段N-端构成的融合蛋白，目前已经报道的B7. I-Fc中，Fe来自于免疫球蛋白IgG，特别是IgGl。B7. I-Fc融合蛋白在宿主的APC细胞将肿瘤抗原信息递呈给体内肿瘤免疫杀伤细胞的同时，共刺激因子B7. I与CD28结合激活T细胞，从而对肿瘤细胞产生系列免疫攻击，达到杀灭肿瘤细胞的作用。同时B7. I-Fc融合蛋白不仅能与CD28结合， 激活T细胞，也可与CTLA-4结合，终止T细胞的激活途径，从而避免出现T-细胞的过度激活。B7. I-Fc融合蛋白的这种双重作用，大大增强了以B7. I-Fc融合蛋白开发的抗肿瘤药物的安全可控性。据有关研究报道免疫共刺激因子融合蛋白B7. I-Fc作为一种肿瘤免疫治疗药物，其在结肠癌、乳腺癌、纤维肉瘤癌具有一定的治疗效果(CN200580042109. 0)。
目前，还未见将共刺激因子B7.I及B7. I融合蛋白用于治疗宫颈癌的相关报道。发明内容
本发明的目的在于提供共刺激因子B7. I及B7. I融合蛋白的新用途。
本发明提供了共刺激因子B7. I及B7. I融合蛋白在制备治疗宫颈癌、肉瘤或黑色素瘤的药物中的用途。
其中，所述的B7. I融合蛋白是B7. 1-Fc。
进一步地，B7. I-Fc是融合到IgG Fe上的B7. I。
进一步优选地，所述IgG为IgGl。
进一步地,所述的药物是治疗宫颈癌、肉瘤的药物。
进一步地，所述的药物是治疗宫颈癌的药物。
其中，所述的药物是以共刺激因子B7. I或B7. I融合蛋白为有效成分，加上药学上常用的辅料制备而成的制剂。
进一步地，所述的B7. I融合蛋白是B7. I-Fc0
更进一步地，所述B7. I-Fc由B7. I与IgG Fe连接而成。
进一步优选地，所述IgG为IgGl。
其中，所述的制剂为注射剂。
根据药理实验换算可知，所述的制剂中，每日用单位制剂中B7. I-Fc的含量为192_384ug。
免疫共刺激因子融合蛋白B7. 1-Fc，特别是B7. 1/IgGlFc，能够有效抑制宫颈癌或肉瘤的生长，特别是针对宫颈癌具有显著的治疗活性，其治疗作用与阳性药物相当，为临床用药提供了一种新的选择。
图1SDS-PAGE确认表达的B7. I-Fc的分子量谱图，其中，I为非还原的B7. I-Fc图谱、2为还原的B7. I-Fc图谱、3为标准分子量标记物；
图2HPLC纯度测定图谱
图3B7. I-Fc给药后U14荷瘤鼠体重变化
图4B7. I-Fc对小鼠宫颈癌(U14)肿瘤抑制作用
图5B7. I-Fc给药后S180荷瘤鼠体重变化
图6B7. I-Fc对小鼠肉瘤(S180)肿瘤抑制作用
图7B7. I-Fc给药后B16-F10荷瘤鼠体重变化
图8B7. I-Fc对小鼠黑色素瘤(B16-F10)肿瘤抑制作用具体实施方式
实施例I本发明中B7. I-Fc的制备
利用基因重组技术制备B7. I-Fc融合蛋白，按照生物领域技术人员熟知方法，通过PCR技术获得构建B7. I-Fc表达载体，转入小鼠骨髓瘤NSO细胞筛选获得长期稳定表达融合蛋白B7. I-Fc的工程细胞，然后通过流加培养获得高表达的B7. I-Fc培养上清，然后再通过蛋白A亲和层析和离子交换层析依次纯化获得高纯度融合蛋白，4°C保存。
本发明中B7. I-Fc的制备方法可以参照CN200580042109. 0中的制备方法，所述 B7. I-Fc是指B7. 1/IgGlFc，即B7. I和IgGlFc的融合蛋白，其序列表参见Aihong Liu, Peisheng Hu ；Clin Cancer Res 2005 ；11 (23)December 1,2005,8492-8502。
将制备得到的B7. I-Fc测定分子量，测定图谱见图I ;并通过HPLC测定其纯度，测定图谱参见图2。
实施例2免疫共刺激因子融合蛋白B7. I-Fc药效学实验
I、受试样品及剂量设计
名称免疫共刺激因子融合蛋白B7. 1/IgGlFc (简称B7. I-Fc)按实施例I制备
提供者军事医学科学院微生物流行病学研究所
性状无色、澄清液体
保存条件4°C保存
给药途径尾静脉注射
溶剂生理盐水
2、阳性对照
注射用环磷酰胺；紫杉醇
3、肿瘤细胞株
小鼠宫颈癌U14、小鼠肉瘤S180、小鼠黑色素瘤B16-F10，均可通过购买市售商品得到
4、动物
BALB/c小鼠，SPF/VAF级由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号 SCXK (京)2009-0004
5、饲养设施条件
中国医学科学院药物研究所动物实验中心屏障设施，许可证号 SYXK (京)2009-0004
6、实验方法
(I)肿瘤细胞培养及接种
小鼠宫颈癌U14、小鼠肉瘤S180、小鼠黑色素瘤B16-F10细胞体外培养至相当数量。消化、洗涤、离心，计数细胞，配制细胞密度为5xl06/ml细胞悬液。小鼠局部消毒后侧背部接种，注射体积0. Iml/只。
(2)给药剂量及给药方式
每日观察肿瘤生长变化，于接种后4天确认肿瘤生长时，将荷瘤鼠按瘤体积大小随机分组。设阴性对照组，肿瘤自然生长；阳性对照组为注射用环磷酰胺、紫杉醇给药组， 按人用剂量折算，小鼠以lOOmg/kg—1剂量，视肿瘤生长情况间断腹腔注射给药；融合蛋白 B7. I-Fc按照SOdOJOug/kg—1三个剂量尾静脉给药，每天I次，连续5天。每组小鼠15只， 并与当日全部给药。
(3)观察指标
实验过程中，每2-3日监测实验动物肿瘤长、宽径及体重。观察至接种后第30天左右颈椎处死小鼠，结束实验。实验结束时，剥离肿瘤，称瘤重，拍肿瘤对比照片，分别参见图4、6、8。本发明中采用相对肿瘤增殖率T/C(%)作为试验评价指标，用以评价药物的抗肿瘤活性，计算方法参见《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》。同时，还为各种荷瘤小鼠称重，以便确认B7. I-Fc对机体的不良反应，参见图3、5、7。
实验结果
(1)B7. I-FC对小鼠肿瘤宫颈癌U14肿瘤生长抑制作用
表1B7. I-Fc对U14肿瘤生长抑制作用
权利要求
1.共刺激因子B7.I及B7. I融合蛋白在制备治疗宫颈癌、肉瘤或黑色素瘤的药物中的用途。
2.根据权利要求I所述的用途，其特征在于所述的B7.I融合蛋白是B7. I-Fc0
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述B7.I-Fc由B7. I与IgG Fe连接而成。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述IgG为IgGl。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的用途，其特征在于所述的药物是治疗宫颈癌、肉瘤的药物。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述的药物是治疗宫颈癌的药物。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的用途，其特征在于所述的药物是以共刺激因子 B7. I或B7. I融合蛋白为有效成分，加上药学上常用的辅料制备而成的制剂。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于所述的B7.I融合蛋白是B7. I-Fc0
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述B7.I-Fc由B7. I与IgG Fe连接而成。
10.根据权利要求7-9任意一项所述的用途，其特征在于所述的制剂为注射剂。
全文摘要
本发明公开了B7.1及B7.1融合蛋白在制备治疗宫颈癌、肉瘤或黑色素瘤的药物中的用途。免疫共刺激因子融合蛋白B7.1-Fc，特别是B7.1/IgG1Fc，能够有效抑制宫颈癌或肉瘤的生长，特别是针对宫颈癌具有显著的治疗活性，其治疗作用与阳性药物相当，为临床用药提供了一种新的选择。
文档编号A61K39/395GK102526707SQ201210011148
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者彭红卫, 徐小萍, 曹路君, 杨伟, 罗天学, 赵斌, 陈春会, 陈知航, 雒蓬轶 申请人:天津博发生物技术有限公司, 成都博发生物技术有限公司, 西藏天行生物药业有限公司