专利名称：靶向人vegfr-1的基因工程化淋巴细胞及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及抗VEGFR-I的嵌合型抗原受体和能表达该抗原受体的淋巴细胞。
背景技术：
在细胞免疫过程中，T淋巴细胞扮演着主要的角色。T细胞所介导的细胞免疫主要是通过T细胞受体(T cell receptor, TCR)特异识别细胞表面由主要组织相容性复合物 (MHC)所展示的抗原肽，进而激活T细胞胞内信号，对该靶细胞进行特异杀伤。这对及时清除体内病变的细胞以及预防肿瘤的发生起着至关重要的作用。肿瘤能够通过多种途径逃避免疫系统的监视而产生免疫逃逸，使得肿瘤细胞能够在体内生存从而发生肿瘤。但是，在肿瘤病人体内，仍然有少部分免疫细胞能够识别并杀伤肿瘤。该类免疫细胞能够浸润到肿瘤组织中发挥杀伤功能，因此，通常称这类免疫细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)。TIL能够表达特异识别肿瘤抗原的TCR，进而可以靶向肿瘤细胞，发挥杀伤活性。目前，国内外已经利用TIL进行临床肿瘤治疗并取得了一定的成效。然而，由于自身的特点，TIL的临床应用有一定的局限性。首先，TIL的分离有一定的难度，并非所有分离得到的TIL都具有肿瘤杀伤活性。其次，分离所得的TIL数量有限，必须经过体外扩增，达到治疗所需的数目后才能够应用于临床。然而， 经过长期的体外扩增，TIL的肿瘤杀伤活性显著下降。这可能跟由于多次的扩增而导致的T 细胞受体(T cell receptor, TCR)的改变以及表面共刺激因子的缺乏有关。另外，TIL所介导的肿瘤杀伤是依赖于主要组织相容性复合物(MHC)的，而肿瘤细胞免疫逃逸的一个重要机制就是MHC的下调。这又使得TIL的临床应用增加了一定的难度^因此，理想的TIL 是易于获得，同时能够在经过体外扩增后还具有较强的、特异的肿瘤杀伤活性的淋巴细胞。随着生物基因工程技术的成熟，利用基因工程手段获得类似TIL的淋巴细胞已经成为可能。目前，国外很多科学小组通过不同的基因转染手段，将表达类似TCR的目的基因导入淋巴细胞从而获得了能够识别肿瘤特异抗原的淋巴细胞。该类TCR结构为 scFv-Fc-Tm-SD。其中，scFv为识别肿瘤抗原的单联抗体；Fe为免疫球蛋白的Fe段,可以介导二聚化及scFv的空间延伸；Tm为跨膜结构域，辅助该表达产物的膜定位；SD为胞内信号结构区，介导淋巴细胞的活化。这样的类TCR结构也被称为嵌合型抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)。目前，该类基因工程化的CAR T细胞(CAR-Tc)在国外已经用于临床治疗黑色素瘤2’3、淋巴瘤4’5，并取得了疗效。与TIL相比，CAR-Tc有比较明显的优势。首先，CAR对肿瘤抗原的识别是非MHC依赖型的。在CAR结构中，scFv来源于能够识别肿瘤抗原的抗体。与TCR识别抗原肽-MHC 复合物不同，CAR对肿瘤细胞抗原的识别只依赖于其对抗原的亲和力，与是否该抗原肽被 MHC展示无关。这不仅克服了肿瘤细胞通过下调自身MHC而产生的免疫逃逸，而且扩大了 CAR-Tc的应用范围。其次，CAR-Tc是利用基因工程手段得到的，省去了分离TIL过程中比较繁琐的步骤。另外，CAR-Tc所靶向的抗原有很多的选择，可以针对目前研究比较成熟的抗原进行主动设计，无须被动进行TIL分选。与正常细胞一样，肿瘤细胞的生长需要必须的营养物质。这些营养物质在肿瘤生成过程中通过肿瘤新生血管提供。近年来，通过抑制肿瘤新生血管抑制肿瘤生长的疗法在临床前研究及临床应用中均取得了较好的疗效。在这些疗法中，阻断血管内皮细胞中的血管内皮生长因子(VEGF)与其受体(VEGFR)的结合是有效抑制新生血管的方法之一。与 VEGFR竞争性结合VEGF的avastin已经应用于临床。另外，利用药物靶向高表达VEGFR的血管内皮细胞而达到抑制新生血管的报道也越来越多6。因此，VEGFR作为一个介导抑制新生血管作用的靶点而备受关注。值得注意的是，除参与肿瘤血管生成的血管内皮细胞之外， 一些肿瘤细胞也高表达VEGFR6’7，这就使得作用于VEGFR表达阳性的肿瘤的药物具有了双重作用，包括作用于肿瘤新生血管以及肿瘤细胞本身。同时，这也是的VEGFR做为一个明星靶点而备受肿瘤药物研发人员青睐，针对其开发的药物也越来越多。本领域也需要开发新的有效抗肿瘤药物。
发明内容
本发明要解决的技术方案为抗肿瘤技术领域提供新的有效选择。本发明解决技术问题所提供的技术方案为提供了一种单链抗体ScFv，该单链抗体能够识别VEGFR-1，是通过串联针对VEGFR-I的抗体轻链、重链可变区而得。进一步的，上述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。本发明也提供了编码上述单链抗体的基因。进一步的，该单链抗体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。本发明还提供了一种嵌合型抗原受体，该嵌合型抗原受体是通过氮端到碳端顺次拼接hIL-2信号肽、本发明提供的抗VEGFR-I的单链抗体ScFv_V、IgGl-Fc, CD4跨膜区 CD4-TM和CD3 ζ链CD3-Z，所得到的嵌合型抗原受体的结构为(ScFv-V) - (IgGl-Fc) - (CD4-TM)-(CD3-Z)。进一步的，上述嵌合型抗原受体的其氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。本发明同时也提供了编码上述的嵌合型抗原受体的基因。进一步，编码上述的嵌合型抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。本发明也还提供了一种表达载体。该表达载体含有并能表达上述嵌合型抗原受体的编码基因。进一步的，所述的表达载体优选为质粒载体。所述的质粒载体优选为 pmaxCloning 载体。本发明同时也提供了含有上述表达载体的宿主细胞。进一步的，所述宿主细胞为淋巴细胞。本发明的上述宿主细胞有制备抗肿瘤药物的用途。优选的，其对VEGFR-I高表达的肿瘤有更好的效果。如肺腺癌，乳腺癌等VEGFR-I高表达的肿瘤。本发明同时也提供了上述的宿主细胞的方法。该方法为将上述的能表达本发明嵌合型抗原受体的表达载体转染进淋巴细胞，从而获得能表达本发明嵌合型抗原受体的基因工程化的淋巴细胞。得到的工程化淋巴细胞具有靶向杀伤肿瘤细胞的功能。其中，优选的质粒转染方式为电转染。本发明还提供了抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物是由上述的宿主细胞作为主要活性成分制备而成的。本发明的有益效果为，本发明创造性地新设计得到了一种嵌合型抗原受体，该嵌合型抗原受体能抗VEGFR-I。为了使嵌合型抗原受体更好地发挥作用，本发明还使用了特别优选的抗VEGFR-I单链抗体。将本发明抗VEGFR-I的嵌合型抗原受体的编码基因转入质粒载体中，转染到淋巴细胞中，将非特异性的淋巴细胞定向改造为能够识别人VEGFR-I从而介导对表达VEGFR-I的细胞进行靶向杀伤的特异性淋巴细胞。得到的淋巴细胞能分泌表达本发明嵌合型抗原受体并固定在自身的细胞膜表面，识别肿瘤细胞表面的VEGFR-I受体， 介导并启动淋巴细胞的杀伤肿瘤细胞的活性。经体外和体内试验证明,本发明基因工程化淋巴细胞在体外实验和体内实验中均发现具有显著的抑制肿瘤生成、生长和转移的活性。 能够作为抗肿瘤药物使用，具有好的应用前景，为本领域提供了一种新的有效选择。
图1，CAR基因转染后的表达检测。一抗为兔抗人⑶3链，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。图2，CAR转染后的淋巴细胞肿瘤杀伤活性检测。GFP组为转染pmaxGFP质粒的淋巴细胞组，CAR组为转染pmaxCAR质粒淋巴细胞组。图中着色较亮且较小小的为淋巴细胞核，较大而暗的为肿瘤细胞核。图3，转染pmaxCAR质粒的淋巴细胞对A549皮下成瘤性的影响。纵坐标为未成瘤个体所占的百分比，横坐标为接种后的时间(天)。No Tc、GFP、CAR分别代表未输注淋巴细胞组、转染pmaxGFP质粒的淋巴细胞组、转染pmaxCAR质粒的淋巴细胞组(各组小鼠数量分别为10只)ο图4，转染pmaxCAR质粒的淋巴细胞对肺癌转移的影响。纵坐标为肺癌细胞肺转移结节数。No Tc、GFP、CAR分别代表未输注淋巴细胞组、转染pmaxGFP质粒的淋巴细胞组、转染pmaxCAR质粒的淋巴细胞组(各组小鼠数量分别10只)。
具体实施例方式本发明提供了一种嵌合型抗原受体(CAR)重组基因及其合成方法，该嵌合型抗原受体针对VEGFR-I。具体为通过顺次拼接hIL-2信号肽、抗VEGFR-I单链抗体(ScFv-V)、 IgGl-Fc (免疫球蛋白GlFc段)、CD4(白细胞抗原分化群分子4)的跨膜区(CD4-TM)和 ⑶3(白细胞抗原分化群分子3)的ζ链(⑶3-z)，最后得到完整的抗VEGFR-I的CAR基因 (ScFv-V) - (IgGl-Fc) - (CD4-TM) - (CD3-Z)，氨基酸序列见 SEQ ID No. 4。本发明提供的CAR的拼接元件和拼接是经过多次摸索得到的。在上述的结构下， 各个片段能发挥的功能如下hIL-2信号肽可以将CAR分泌到胞外；CD4-TM可以将本发明 CAR锚钉在细胞膜上；ScFv-V专司结合目的抗原的靶向作用；IgGl-Fc使ScFv-V具有合适的空间展示度；CD3-z为胞内信号激活序列，在ScFv结合抗原后CD3-Z激活信号，启动淋巴细胞的杀伤活性。其中，为了更好的达到目的，本发明还通过核糖体展示技术获得了一种新的优选的能够识别VEGFR-I的单链抗体(ScFv)。该单链抗体是通过串联针对VEGFR-I (血管内皮生长因子受体I)的抗体轻链、重链可变区而得。其编码核苷酸序列如下所示(SEQ ID No. 2)，其中的小写字母部分为优选得到的连接肽(linker)的编码序列，连接肽的氨基酸序列为 (G4S)3。CAGATCCAGTTGCTGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACA GCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGG AAGGATCGATCCTCCGAATGATAATACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACAT CCTCCAATACAGCCTACATGCAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCCCTCCCACCG TTCTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCTCAGTCTCCGCAggtggcggtggctcgggcggtggtgggtc gggtggcggcggatctGACATTGTGATGACACAGTCTCCAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCG TCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCA CTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCAC TCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTTTCCTTACACGT TCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA。然后，本发明可将全长CAR的编码基因插入目的表达载体。表达载体首选质粒载体。而经多次试验，首选的质粒载体为pmaxCloning(Lonza)载体,pmaxCloning(Lonza)载体的核昔酸序列如SEQ ID No. 5所不。最终，犾得了插入CAR基因并能表达的重组质粒,命名为 pmaxCAR。本发明还提供了具有靶向血管内皮细胞生长因子受体I能力的基因工程化淋巴细胞。利用能表达本发明质粒载体pmax-CAR质粒，转染人T淋巴细胞，从而获得表达CAR的基因工程化的淋巴细胞。其中，首选定质粒转染方式为电转染。优选使用以CD3抗体IL-2 刺激后，CD3阳性的T淋巴细胞。该工程化得到的淋巴细胞具有靶向杀伤具VEGFR-I的癌细胞的功能。在体外实验和体内实验均具有抑制肿瘤生成、生长和转移的生物学活性。使用的淋巴细胞为普通淋巴细胞，转染前使用CD3抗体和IL-2进行刺激活化。实施例I靶向hVEGFR-Ι的ScFv的得到核糖体展示获得hVEGFR-Ι的ScFvI)真核表达hVEGFR-Ι胞外段，免疫BALB/c小鼠三次。2)取免疫后小鼠的脾细胞，裂解细胞，提取mRNA-核糖体复合物。3)将提取到的mRNA-核糖体复合物孵育固相化的hVEGFR-Ι胞外段，洗去不结合的复合物。4)以洗脱缓冲液将mRNA从抗原-核糖体-mRNA复合物中洗脱。5)利用RT-PCR方法，分别以抗体序列的轻链引物及重链引物，获得具有高亲和力抗体序列的轻链及重链可变区。6)以(G4S) 31inker连接重链及轻链，获得识别hVEGFR-Ι的ScFv。2，ScFv亲和力筛选I)以I中的方法获得的轻链及重链可变区为非单一克隆，将可变区序列插入至目的载体序列后，转化DH5a感受态细胞，得到一系列的克隆。2)经质粒提取及测序后得到轻链及重链可变区的一系列序列，将可变区以优选的 linker (G4S) 3连接后，得到多个ScFv。3)原核表达各ScFv，用96孔板包被hVEGFR-1，以ELISA方法筛选高亲和力的 ScFv0
经过多次展示和筛选，获得了一高亲和力的ScFv，其氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示，可由SEQ ID No. I所示的编码核苷酸序列表达得到。实施例2靶向VEGFR-I的CAR全长基因获得及重组质粒载体的构建实验路线1，合成引物，利用重叠PCR方法得到ScFV-V-IgGl-Fc、CD4-TM-CD3_z融合片段。其中，信号肽序列包含在上游引物中。2，以重叠PCR的方法获得全长的CAR基因。实验具体方案如下a)利用引物FU Rl扩增ScFv_V，利用F2、R2扩增IgGl-Fc，最后以此两次PCR产物为模板，FU R2为引物扩增获得目的片段ScFv-V-IgGl-Fc。同样，先以引物F3、R3扩增 CD4-TM，F4、R4 扩增 CD3-Z，然后以 F3、R4 扩增获得 CD4-TM-CD3-Z。其中，CD4-TM，CD3-Z 均通过RT-PCR从人外周血单核细胞中扩增获得。b)以 ScFv-V-IgGl-Fc 和 CD4-TM-CD3-Z 为模板，FI、R4 为引物，PCR 获得全长 CAR
的编码基因。获得CAR编码基因所用的各条引物的核苷酸序列如下所示Fl(SEQ ID No.6)5' -ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAAcTCGGCCCAGATCCAGTTGCTGCAGTCTGGGGCA~3/ 。其中下划线部分为hIL-2信号肽。Rl (SEQ ID No. 7)5' -GCTGGGCAAGGTGGGCACTCCACTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCC-3'。F2 (SEQ ID No. 8)5' -AGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAGTGGAGTGCCCACCTTGCCCAGC-3/ 。R2(SEQ ID No.9)5' -ACGCCCCCCAGCACAATCAGGGCCATTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCT-3'。F3 (SEQ ID No. 10)5' -AAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAATGGCCCTGATTGTGCTGGGGGGCGTCGC-3'。R3(SEQ ID No. 11)5' -TCTGGCCCTGCTGGTACGCGGGGGCGTCTGCGCTCCTGCTGAACTTC-3'。F4(SEQ ID No. 12)5' -TGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGA-3,。R4(SEQ ID No. 13)5' -CCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA-3/ 。3，构建pmax-CAR质粒载体。以EcoRl和BamHl为酶切位点，连接目的基因及pmaxCloning载体(其核苷酸序列见SEQ ID No. 5)，获得pmax-CAR质粒载体。实施例3淋巴细胞的转染、表达检测以及体外活性检测I，淋巴细胞的电转染及目的基因的表达检测。利用密度梯度离心法，从人体外周血经分离得到淋巴细胞后，以CD3抗体(鼠抗人CD3单克隆抗体，购自于武汉生物制品研究所)(lug/ml)和IL-2(300IU/ml)刺激淋巴细胞，得到CD3 (白细胞抗原分化群分子3)阳性超过95 %的T淋巴细胞，此为广泛应用的淋巴细胞扩增的经典方案。两天后收集T淋巴细胞进行转染pmax-CAR质粒。利用电转染仪为 Nucleofector (Lonza,瑞典，龙沙公司)或Multiporator (eppendorf,德国艾本德公司)转染淋巴细胞后，培养淋巴细胞16小时，收集转染的淋巴细胞，提取细胞总蛋白进行免疫印迹实验(western blotting)。结果显示转染后的淋巴细胞中有较高的CAR表达(图I)。2，转染后淋巴细胞的肿瘤杀伤活性检测。收集培养的肿瘤细胞(肺癌细胞A549)，3000个/孔铺板，收集电转染CAR基因和绿色荧光蛋白(GFP)(阴性对照)的淋巴细胞。计数后，加入40倍肿瘤细胞数目的淋巴细胞与肿瘤细胞共孵育，48小时后，除去细胞培养上清，加入Propidium Iodide进行染色，观察细胞杀伤情况。结果显示，与阴性对照组(GFP)相比，CAR基因转染组肿瘤细胞明显减少 (图 2)。实施例4转染CAR基因的淋巴细胞在体内抑制肿瘤生成及转移的活性检测I，实验方法。a)研究转染CAR基因的淋巴细胞对肺癌细胞A549在重度联合免疫缺陷型(Severe combined immune deficiency, Sc id)小鼠(小鼠品种为Scid的BALB/c小鼠,购自北京市华阜康生物科技股份有限公司)体内成瘤的影响。由于A549为人源肿瘤细胞，要使A549 细胞能够在小鼠体内成瘤，被接种的小鼠需为免疫缺陷型。将转染CAR基因的淋巴细胞与A549肿瘤细胞(I X IO5)混合(比例淋巴细胞 肿瘤细胞=10 I)，皮下接种于Scid鼠，观测其成瘤性。b)考察转染CAR基因的淋巴细胞对肺癌细胞A549在Scid鼠体内肺转移的抑制作用。具体实验过程为收集A549细胞，稀释至107/ml，尾静脉输入肿瘤细胞悬液 lOOul，即IO6肿瘤细胞。两天后分别尾静脉输入转染CAR、GFP基因的淋巴细胞(每组小鼠数量η = 10)。输入淋巴细胞后，腹腔输入rhIL-2，剂量为5万IU/次，每天两次，连续给药 3天。输入淋巴细胞后7天、14天再次重复输入等剂量的淋巴细胞，同时每次输入淋巴细胞后，输入与第一次等剂量、等次数的rhIL-2。直至输入肿瘤细胞45天后，处死老鼠，取肺检测肺转移情况，计数转移结节。2，实验结果。实验结果发现，转染CAR基因的淋巴细胞相对于GFP组或者没有输入淋巴细胞组， 其肿瘤的成瘤性显著降低(见图3)。CAR基因转染组的肿瘤形成率始终为50%，即使是在接种80天以后，也能保持这一水平。而其转移结节数也大为降低(见图4)，这表明转染CAR 基因的淋巴细胞显著影响A549肺癌细胞的成瘤性。本发明经多方案比较，如采用利用质粒的转染系统，可以获得较其他方案更高的的转染效率。并且在多次的实验过程中，均未发现导入的基因嵌入到基因组中的现象。说明本发明的这一方案不会改变使用的淋巴细胞的遗传特性，同时也具有较高的安全性。在实验过程中，还利用本发明的方法处理了来源于不同个体的淋巴细胞，最终获得的基因工程化淋巴细胞对肿瘤细胞均有较高的杀伤活性，可见该杀伤活性是依赖于VEGFR-I抗原的， 因此本发明技术方案具有较广的适应性，尤其VEGFR-I高表达的肿瘤有更好的效果，如肺腺癌，乳腺癌等。
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权利要求
1.单链抗体ScFv，该单链抗体能够识别VEGFR-I，是通过串联针对VEGFR-I的抗体轻链、重链可变区而得。
2.根据权利要求I所述的单链抗体，其特征在于其氨基酸序列如SEQID No. 2所示。
3.编码权利要求2所述的嵌合型抗原受体的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No. I 所示。
4.一种嵌合型抗原受体，其特征在于该嵌合型抗原受体CAR是通过氮端到碳端顺次拼接hIL-2信号肽、权利要求I或2所述的抗VEGFR-I的单链抗体ScFv_V、IgGI-Fc、CD4跨膜区CD4-TM和CD3 (链CD3_z，所得到的抗原受体CAR的结构为(ScFv-V) - (IgGl-Fc) - (CD4-TM)-(CD3-Z)。
5.根据权利要求4所述的嵌合型抗原受体，其特征在于其氨基酸序列如SEQID No. 4 所示。
6.编码权利要求5所述的嵌合型抗原受体的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No. 3 所示。
7.表达载体，含有并能表达氨基酸序列为SEQID No. 3所示的嵌合型抗原受体的编码基因。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体为质粒载体。
9.根据权利要求8所述的表达载体,其特征在于所述的质粒载体为pmaxCloning载体。
10.含有权利要求7 9任一项所述的表达载体的宿主细胞。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为淋巴细胞。
12.权利要求10或11所述的宿主细胞在制备抗肿瘤药物中的用途。
13.制备权利要求10或11所述的宿主细胞的方法，其特征在于将权利要求5 8任一项所述的表达载体转染进淋巴细胞，从而获得能表达嵌合型抗原受体的基因工程化的淋巴细胞。
14.抗肿瘤药物，是由9或10所述的宿主细胞作为主要活性成分制备而成的。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体涉及抗VEGFR-1的嵌合型抗原受体和能表达该抗原受体的淋巴细胞。本发明要解决的技术方案为抗肿瘤技术领域提供新的有效选择。本发明解决技术问题所提供的技术方案为提供了一种单链抗体ScFv，该单链抗体能够识别VEGFR-1，将该单链抗体制成嵌合型抗原受体，结构为(ScFv-V)-(IgG1-Fc)-(CD4-TM)-(CD3-z)，将其编码基因转入质粒载体为质粒载体。将上述的质粒载体转染入淋巴细胞，能具有抗肿瘤的作用，为本领域提供了一种新的有效选择。
文档编号A61K35/26GK102584999SQ201210011139
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月13日 优先权日2011年1月13日
发明者李炯, 王永生, 王玮, 魏于全 申请人:四川大学