专利名称：一种用于热靶向化疗的复方热敏脂质体及制备方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及应用于热靶向化疗的热敏脂质体。
背景技术：
半个世纪以来，肿瘤学在世界范围和我国都有很大的发展，综合应用现有的可能 方法治疗肿瘤已经深入人心，并为肿瘤临床工作者所接受，综合治疗已成为肿瘤治疗的最 佳和最流行的模式。手术治疗、放疗、化疗、热疗及生物治疗之间共同配合，已在多种肿瘤的 治疗中取得了显著的疗效。热疗作为恶性肿瘤治疗的一种辅助方法，具有其他治疗方法所没有的特色费用 低廉、副作用少、能激发肿瘤免疫、疗效肯定。化疗也是对恶性肿瘤进行综合治疗的重要手 段之一，但是全身应用化疗药物常常有骨髓抑制、心脏损害等并发症，这些毒副作用严重限 制了疗效。如果降低药物浓度以减少这些副作用，就会同时降低对肿瘤的控制效果；反之 如增加剂量，在增加疗效的同时也会增加副作用。为此，人们正在不断尝试新的靶向给药途 径。其中，以热敏脂质体为载体，热疗协同靶向化疗受到重视。热靶向化疗用激光、射频、微 波或超声聚焦等方法在肿瘤局部加热，并引发热敏脂质体在局部释放化疗药物。热敏脂质 体具有温度相变特性和包封特性，能无选择的包封水溶性和脂溶性的药物，加热达到相变 温度后，其内容物释放。热靶向化疗发挥局部热疗和局部化疗的协同治疗作用，副作用较 少，具有广阔的应用前景。但是热靶向化疗中温度测量困难，很大程度上限制了它的推广应用。目前的测温 方法是有损伤的温度计或者通过体模估计体内可能的温度分布。温度计测温是有损伤的 点状测温，难以反映温度分布的全貌并且常常引起感染、出血等并发症；体模估计法则只能 是对温度分布的粗略估计，与事实温度有较大的误差。理想的温度测量方法应该是无损伤 性的、实时的和三维立体的，只有这样，才可能将肿瘤边缘的细胞加热致死，避免存在“冷区 (达不到热疗温度)”而导致术后复发；同时只有精确测控温度才能避免不破坏过多正常组 织，减少并发症的发生。所以，寻找理想测温方法成为目前亟待解决的重点和难点。随着卫生事业的发展，电子计算机断层扫描(CT)在逐渐普及应用。CT扫描能够 无损伤的、实时的和三维立体的显示肿瘤影像，与磁共振成像(MRI)相比较，具有成像速度 快，成本低的优势。CT扫描结合随温度变化而释放的造影剂，有希望成为一个理想的测温方 法。挪威学者Fossheim在MagnReson Imaging. 1999,17(1) :83_9 中报道了热敏顺磁 脂质体在MRI导向热疗中温度控制的可行性。国内研究者祝侠丽等人在《中国药学杂志》， 2005年，第40卷第12期中报道了碘海醇普通脂质体的研制，在《中国药学杂志》，2005年， 第42卷，第12期中报道了洛莫司汀热敏脂质体的制备及其体外抗肿瘤活性。国内研究者 张丙杰等人在《中华物理医学与康复杂志》，2007年29卷第5期中报道了热敏脂质体洛莫司 汀热靶向化疗的实验研究，探讨了洛莫司汀热敏脂质体热靶向化疗的合适化疗药物浓度， 旨在为热靶向化疗提供理论基础。
目前国内外没有利用CT测控温度下热靶向化疗治疗肿瘤的研究公开发表。本发明创造性研制出了一种含有CT造影剂和肿瘤化疗药物的复方热敏脂质体， 该脂质体可应用于热靶向化疗中，利用CT扫描机体组织中CT造影剂的浓度，有效的显示加 热范围，解决热疗测温的难题，同时进行热靶向化疗。
发明内容
本发明的一个目的提供一种新颖的含有CT造影剂和肿瘤化疗药物的复方热敏脂 质体，该脂质体可应用于热靶向化疗中，解决热疗测温的难题。本发明的另一目的是提供一种制备上述复方热敏脂质体的方法。本发明的再一目的是提出该复方热敏脂质体在肿瘤热靶向化疗中的应用，特别是 在肿瘤热靶向化疗中，利用该药物组合物，在CT的监控下，测量和监控热疗温度，解决肿瘤 热疗中测温控温的难题。本发明是利用热敏脂质体的温度相变特性和包封特性，设定其相变温度为热疗所 需的温度，将CT造影剂和化疗药物一起进行包封，制成同时包封两种药物的复合型热敏脂 质体；局部间质内热疗的同时，静脉注射该药物，当靶区达到热疗温度时，热敏脂质体发生 结构改变，在肿瘤局部将其内容物(CT造影剂和化疗药物)一起释放，CT可以检测到局部造 影剂浓度的变化，从而能够有效的显示加热的范围，避免热疗时靶向温度不均勻而导致热 疗失败的可能，并大大减少对正常组织的热损伤，消除传统测温方法带来的并发症。在利用 CT测量温度范围的同时热敏脂质体在肿瘤内释放化疗药物，发挥热疗和化疗的协同作用， 进一步增加疗效，避免了全身化疗的副作用。本发明的复方热敏脂质体至少包含一种CT显影剂和一种肿瘤化疗药，还至少含 有一种饱和的磷脂，脂质双分子层的相变温度在39°C与45°C之间。该复方热敏脂质体中磷脂的总浓度在20mg/ml至100mg/ml之间，优选30mg/ml到 80mg/ml。该复方热敏脂质体，可以含有一种饱和的磷脂，也可以是多种饱和的磷脂的混合 物，包括二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二硬质酰磷脂酰胆 碱(DSPC)、二桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，还可含有天然卵磷脂或 豆磷脂、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)磷脂酰肌醇(PI)，以及胆 固醇和维生素E (Ve)。饱和的磷脂优选二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二硬质酰磷脂酰胆碱 (DSPC)，最优选二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。复方热敏脂质体饱和磷脂的浓度占其磷脂总浓度的比例在100%至30%之间，优 选 100%到 80%。复方热敏脂质体的脂质双分子层的相转变温度范围优选在40°C与42°C之间。本发明的CT造影剂可以是离子型造影剂，包括泛影葡胺、泛影酸、碘克沙酸及这 些酸的盐，也可以是非离子型造影剂，包括碘帕醇、碘克沙醇、碘海醇、碘喷托、碘普罗安和 碘曲仑。本发明优选非离子型造影剂。本发明最优选碘海醇做CT造影剂。本发明的肿瘤化疗药物，包括常见水溶性和脂溶性的化疗药物，包括氮芥、环磷酰 胺、顺钼、卡钼、奥沙利泊、5-氟尿嘧啶、洛莫司汀、卡培他宾、雷替曲塞、阿糖胞苷、吉西他 宾、氨甲喋呤、培美曲塞、盐酸多柔比星、柔红霉素、表柔比星、羟基喜树碱、硫酸长春新碱、紫杉醇、依西美坦和依托泊苷。本发明优选盐酸多柔比星，洛莫司汀，5-氟尿嘧啶、硫酸长春 新碱，依托泊苷和紫杉醇，更优选洛莫司汀。本发明的复方热敏脂质体的粒径范围优选50纳米至600纳米之间。本发明的复方热敏脂质体的包封率范围优选20%到98%。本发明的复方热敏脂质体，除含有前述的组分外，还可以其他相容性药用辅料，例 如，缓冲盐和冻干支撑剂。本发明所述的复方热敏脂质体既可以制成脂质体混悬液，也可以 制成冻干品。本发明同时提供了一种上述复方热敏脂质体的制备方法。该方法采用逆向蒸发 法，包括以下步骤(1)乳化取脂溶化疗药物、饱和磷脂和维生素E置茄形瓶中，加有机溶剂溶解，另取CT造影 剂置烧杯中，加适量磷酸盐缓冲液溶解，将盛有两种药液容器，置水浴中，振摇至温度平衡， 超声，同时取CT溶液滴入有机溶剂溶液中，边滴加边振摇有机溶剂溶液，使乳化均勻。对于水溶性化疗药物，先将其与CT造影剂一起溶于水相中，再乳化。本发明中使用的有机溶剂优选氯仿，或氯仿与乙醚的混合物。有机相与水相的比 例控制在3 1至4 1之间。乳化温度优选40°C到45°C。(2)旋蒸将乳液旋转蒸发，水浴温度控制温度，同时控制压力，形成凝胶后，加少量适量磷 酸盐缓冲液分散凝胶，继续减压旋转蒸发，蒸除剩余的有机溶剂，最终形成均勻的混悬液。 旋转蒸发时，温度优选控制在40°C至45°C之间，压力优选控制在0. 02 0. 07Mpa。(3)冻干将脂质体混悬液加适量冻干支撑剂后，冻干，即得冻干品。冻干时，升华温度优选 控制在-15°C至-10°C之间。本发明提供的新型复方热敏脂质体，可应用于热靶向化疗，特别是应用于CT测控 温度下的热靶向化疗，能够使热疗的温度控制更加准确，大大减少热疗的副作用，减少对正 常组织的热损伤，提高热疗的效果，同时同步进行的热靶向化疗则显著加强热疗的效果，减 少全身性化疗的毒副作用，具有良好的社会效益。
图1实施例1中制备的复方热敏脂质体的DSC2实施例1中制备的复方热敏脂质体中碘海醇体外释放曲线图3实施例1中制备的复方热敏脂质体中洛莫司汀的体外释放曲线
具体实施例方式实施例1复方热敏脂质体冻干品的制备1处方洛莫司汀112. 5mgDPPC2250mgVe112. 5mg
碘海醇26. 4g氯仿225ml磷酸盐缓冲液至75ml取洛莫司汀、DPPC和Ve置茄形瓶中，加氯仿溶解，另取碘海醇置烧杯中，加适量 磷酸盐缓冲液溶解，加磷酸盐缓冲液至75ml，将盛有两种药液容器，置45°C水浴中，振摇 至温度平衡，超声，同时取碘海醇溶液滴入氯仿溶液中，边滴加边振摇氯仿溶液，使乳化均 勻，碘海醇加入后，再振摇超声2分钟。将乳液旋转蒸发，水浴温度为45°C，真空度控制在 0. 05Mpa，形成凝胶后，加少量磷酸盐缓冲液分散凝胶，继续减压旋转蒸发，蒸除剩余的氯 仿，最终形成均勻的混悬液。取上述脂质体混悬液2ml，置IOml棕色冻干瓶中，半加塞，置冻干机中，预冻，制 品温度降至-30°C以下，保持2小时，然后将隔板温度升至-20°C，升华3小时，渗气控制在 15Pa，再将隔板温度升至-15°C，升华10小时，再将隔板温度升至-10°C，保持8小时，最后 将隔板温度升至0 °C，干燥6小时，压胶塞，压铝盖，即得。采用鱼精蛋白法测定包封率，碘海醇的包封率为33%，洛莫司汀的包封率为 55%。激光散射法测定粒径，平均粒径为410nm。实施例2复方热敏脂质体冻干品的制备2处方5-氟尿嘧啶 12. 5gDPPC3. 6gPG0. 4gVe150mg碘帕醇50. 2g氯仿400ml磷酸盐缓冲液 至IOOml取DPPC、PG和Ve置茄形瓶中，加氯仿溶解，另取5_氟尿嘧啶、碘帕醇置烧杯中，加 适量磷酸盐缓冲液溶解，加磷酸盐缓冲液至100ml，将盛有两种药液容器，置40°C水浴中， 振摇至温度平衡，超声，同时取水相溶液滴入氯仿溶液中，边滴加边振摇氯仿溶液，使乳化 均勻，水相溶液加入后，再振摇超声2分钟。将乳液旋转蒸发，水浴温度为42°C，真空度控制 在0. 02Mpa,形成凝胶后，加少量磷酸盐缓冲液分散凝胶，继续减压旋转蒸发，蒸除剩余的氯 仿，最终形成均勻的混悬液。取上述脂质体混悬液2ml，置IOml棕色冻干瓶中，半加塞，置冻干机中，预冻，制 品温度降至-30°C以下，保持2小时，然后将隔板温度升至-20°C，升华3小时，渗气控制在 15Pa，再将隔板温度升至-12°C，升华20小时，最后将隔板温度升至25°C，干燥6小时，压胶 塞，压铝盖，即得。采用鱼精蛋白法测定包封率，碘帕醇的包封率为42%，5_氟尿嘧啶的包封率为 44%。激光散射法测定粒径，平均粒径为321nm。实施例3复方热敏脂质体冻干品的制备3处方盐酸多柔比星500mg
DPPC4. Og
PSI-Og
VE150mg
碘克沙醇40. Ig
氯仿_乙醚混合(5 1)300ml
磷酸盐缓冲液至 IOOml
取DPPC、PS和Ve置茄形瓶中，加氯仿--乙醚混合溶剂溶解，另取盐酸多柔比星、碘
克沙醇置烧杯中，加适量磷酸盐缓冲液溶解，加磷酸盐缓冲液至100ml，将盛有两种药液容 器，置42°C水浴中，振摇至温度平衡，超声，同时取水相溶液滴入氯仿_乙醚混合溶剂溶液 中，边滴加边振摇氯仿_乙醚混合溶剂溶液，使乳化均勻，水相溶液加入后，再振摇超声2分 钟。将乳液旋转蒸发，水浴温度为40°C，真空度控制在0. 07Mpa,形成凝胶后，加少量磷酸盐 缓冲液分散凝胶，继续减压旋转蒸发，蒸除剩余的有机溶剂，最终形成均勻的混悬液。取上述脂质体混悬液2ml，置IOml棕色冻干瓶中，半加塞，置冻干机中，预冻，制 品温度降至-30°C以下，保持2小时，然后将隔板温度升至-20°C，升华3小时，渗气控制在 15Pa，再将隔板温度升至-13°C，升华20小时，最后将隔板温度升至25°C，干燥6小时，压胶 塞，压铝盖，即得。采用鱼精蛋白法测定包封率，碘克沙醇的包封率为37%，盐酸多柔比星的包封率 为75%。激光散射法测定粒径，平均粒径为228nm。实施例L1复方热敏脂质体冻干品的制备4
处方
紫杉醇1.5g
DPPC6. Og
DSPCl.Og
VE150mg
碘海醇35. 6g
氯仿350ml
磷酸盐缓冲液至IOOml
取紫杉醇、DPPC、DSPC和Ve置茄形瓶中，加氯仿溶解，另取碘海醇置烧杯中，加适
量磷酸盐缓冲液溶解，加磷酸盐缓冲液至100ml，将盛有两种药液容器，置45°C水浴中，振 摇至温度平衡，超声，同时取水相溶液滴入氯仿溶液中，边滴加边振摇氯仿溶液，使乳化均 勻，水相溶液加入后，再振摇超声2分钟。将乳液旋转蒸发，水浴温度为45 °C，真空度控制在 0. 05Mpa,形成凝胶后，加少量磷酸盐缓冲液分散凝胶，继续减压旋转蒸发，蒸除剩余的有机 溶剂，最终形成均勻的混悬液。取上述脂质体混悬液2ml，置IOml棕色冻干瓶中，半加塞，置冻干机中，预冻，制 品温度降至-30°C以下，保持2小时，然后将隔板温度升至-20°C，升华3小时，渗气控制在 15Pa，再将隔板温度升至-10°C，升华20小时，最后将隔板温度升至25°C，干燥6小时，压胶 塞，压铝盖，即得。采用鱼精蛋白法测定包封率，碘海醇的包封率为42%，紫杉醇的包封率为85%。 激光散射法测定粒径，平均粒径为252nm。
实施例5脂质双分子层相转变温度实验采用差示扫描量热法(DSC)，测定实施例1中制备的复方热敏脂质体的相转变温 度，见图1。由融熔温度可知，吸热峰位于39 42°C，峰值在41°C，根据磷脂双分子层凝 胶_液晶转变时吸热量突然增加的原理，认为复方热敏脂质体的相变温度为41°C。实施例6药物释放实验(1)实施例1中制备的复方热敏脂质体中碘海醇的释放试验采用透析法测定。取水1000ml，置溶出杯中，加热到预定的温度，令取复方热敏脂 质体1只，加水2ml，分散均勻，精密量取1ml，置半透膜中，两端封口，置于上述IOOOml水 中，桨法，50转/分，搅拌，分别于0、10、20、30min及1、2、4、6小时取样，每次取样2ml，并及 时补充相同温度下的水2ml。温度分别为37°C和41°C。用HPLC法测定不同时间点释放液中药物的含量，同时取复方热敏脂质体适量，用 甲醇破乳，测定脂质体中的碘海醇作为总药量W，根据下式计算累积释放量和累积释放百分 率，结果见表1。=CilG累积释放百分率(％ ) = Qn/ffX 100%
/=0其中Qn为各时间点的累积释放量，Cn为各时间点的实测药物浓度，VO为溶出介 质的总体积，Vi为每次取样体积，Ci为i时刻各取样点的实测药物浓度，W为脂质体中的总药量。表1实施例1中制备的复方热敏脂质体中的碘海醇体外释放结果 以累积释放百分率对时间作图描述复方热敏脂质体中碘海醇的体外释放曲线，见 附图2。由曲线可以看出，碘海醇在41°C的释放速度明显高于37°C，碘海醇的总释放量， 41 °C时也优于37°C。(2)实施例1中制备的复方热敏脂质体中碘海醇的释放试验采用透析法测定。取水100ml，置小溶出杯中，加热到预定的温度，令取复方热敏脂 质体1只，加水2ml，分散均勻，精密量取Iml，置半透膜中，两端封口，置于上述IOOml水中， 桨法，50转/分，搅拌，分别于0、10、20、30min及1、2、4小时取样，每次取样2ml，并及时补 充相同温度下的水2ml。温度分别为37°C和41°C。用HPLC法测定不同时间点释放液中洛莫司汀的含量，同时取复方热敏脂质体适 量，用甲醇破乳，测定脂质体中的洛莫司汀作为总药量W。根据下式计算累积释放量和累积 释放百分率，结果见表2。
n~\
累积释放百分率(％ ) = Qn/wx 100%
其中Qn为各时间点的累积释放量，Cn为各时间点的实测药物浓度，VO为溶出介 质的总体积，Vi为每次取样体积，Ci为i时刻各取样点的实测药物浓度，W为脂质体中的总药量。表2实施例1中制备的复方热敏脂质体中的洛莫司汀的体外释放结果 以累积释放百分率对时间作图描述复方热敏脂质体中洛莫司汀的体外释放曲线， 见附图3。由曲线可以看出，洛莫司汀在41°C时的释放速率明显高于37°C时的释放速率。实施例7复方热敏脂质体体内代谢实验采用实施例1中制备的复方热敏脂质体进行体内代谢实验。方法加热组和不加热组采用C6脑胶质瘤模型大鼠，在瘤体局部加热至41°C和正 常体温下i. v.复方热敏脂质体冻干粉针，剂量相当于洛莫司汀9. 8mg/kg，碘海醇3720mg/ kg;正常大鼠组i. v.含洛莫司汀、碘海醇标准品的溶液。给药后分别采血，以HPLC法测定 洛莫司汀、碘海醇的血药浓度，并采用3p87药动学程序计算药代动力学参数。结果洛莫司汀加热组、不加热组和标准品组的tl/2分别为0. 26,0. 18和0. 30h, AUC分别为2. 58、1. 49和0. 96 (mg/ml) *h ；碘海醇加热组、不加热组和标准品组的tl/2分别 为 2. 38,0. 37 和 0. 41h, AUC 分别为 35. 45、11. 09,8. 50 (mg/ml) *h。结论复方热敏脂质体包封含洛莫司汀、碘海醇的冻干粉针剂，加热组比不加热组 的t1/2明显延长，AUC明显增大；加热组、不加热组比标准品组的AUC明显增大，说明在相同 剂量下与i. v.标准品相比，复方热敏脂质体包封含洛莫司汀、碘海醇的冻干粉针剂能够明 显延长洛莫司汀、碘海醇在血液循环中的时间，增加洛莫司汀、碘海醇的生物利用度；C6脑 胶质瘤模型大鼠瘤体局部加热后更有利于复方热敏脂质体包封含洛莫司汀、碘海醇的注射 剂的体内吸收，比不加热的效果更佳。
权利要求
一种复方热敏脂质体，其特征在于该脂质体中至少包被一种CT造影剂和一种肿瘤化疗药物，所述的脂质体的脂质双分子层的相变温度在39℃与45℃之间，所述的脂质体至少含有一种饱和的磷脂。
2.权利要求1所述的复方热敏脂质体，其脂质的总浓度是20mg/ml到100mg/ml。
3.权利要求2所述的复方热敏脂质体，其脂质的总浓度是30mg/ml到gOmg/ml。
4.权利要求1、2或3所述的复方热敏脂质体，其饱和磷脂浓度占脂质总浓度的比例在 100%至30%之间。
5.权利要求4所述的复方热敏脂质体，其饱和磷脂浓度占脂质总浓度的比例在100% 至80%之间。
6.权利要求1、2、3、4或5所述的复方热敏脂质体，其饱和磷脂是二棕榈酰磷脂酰胆碱 或是二硬脂酰磷脂酰胆碱。
7.权利要求6所述的复方热敏脂质体，其饱和磷脂是二棕榈酰磷脂酰胆碱。
8.权利要求1所述的复方热敏脂质体，其脂质双分子层的相转变温度在40°C与42°C之间。
9.权利要求1所述的复方热敏脂质体，其CT造影剂是非离子造影剂。
10.权利要求9所述的复方热敏脂质体，其CT造影剂是碘海醇。
11.权利要求1所述的复方热敏脂质体，其肿瘤化疗药物是盐酸多柔比星，洛莫司汀， 5-氟尿嘧啶、硫酸长春新碱，依托泊苷和紫杉醇。
12.权利要求11所述的复方热敏脂质体，其肿瘤化疗药物是洛莫司汀。
13.权利要求1所述的复方热敏脂质体，其脂质体的平均粒径在50纳米至600纳米之间。
14.权利要求1所述的复方热敏脂质体，其包封率是20%到98%。
15.权利要求1所述的复方热敏脂质体，其中脂质体是悬浮在水性介质中，或是制备成 冻干品。
16.一种制备权利要求1所述的复方热敏脂质体的方法，该方法是采用逆向蒸发法制 备脂质体，采用冷冻干燥法制备脂质体的冻干品，其特征在于(1)乳化时，有机溶剂为氯仿，或是氯仿与乙醚的混合物，有机相与水相的比例在3 1 至4 1之间。乳化温度控制在40°C至45°C之间。(2)旋转蒸发时，温度控制在40°C至45°C之间，压力控制在0.02 0. 07Mpa。(3)冻干升华温度控制在_15°C至-10°C之间。
17.权利要求1所述的复方热敏脂质体在制备热靶向化疗药品中的应用。
18.权利要求17所述的复方热敏脂质体在制备CT测控温度下的热靶向化疗药品中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种含有CT造影剂和肿瘤化疗药物的复方热敏脂质体，以及制备该复方热敏脂质体的方法。本发明提供的新型复方热敏脂质体，可应用于热靶向化疗，特别是应用于CT测控温度下的热靶向化疗，能够使热疗的温度控制更加准确，大大减少热疗的副作用，减少对正常组织的热损伤，提高热疗的效果，同时同步进行的热靶向化疗则显著加强热疗的效果，减少全身性化疗的毒副作用，具有良好的社会效益。
文档编号A61K47/16GK101889980SQ20091006897
公开日2010年11月24日 申请日期2009年5月22日 优先权日2009年5月22日
发明者张丙杰, 李牧, 杨志强, 王杏林, 高晶 申请人:天津市第一中心医院;天津药物研究院