专利名称：一种柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因及其表达方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,E. tenella)蛋白磷酸酶基因及其表达方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术：
鸡球虫病是由顶复器门，艾美耳属细胞内原虫寄生感染的，在养禽业中最常见、最有害、最致命、经济损伤最严重的一种原 虫病。该病往往呈急性暴发，引起鸡下痢、便血、贫血，以致大批死亡；慢性病例则导致鸡群食欲减退、生长发育受阻、贫血、影响增重并降低饲料转化率。该病以3月龄以内的鸡最易感，雏鸡的发病率和死亡率均较高。病愈的雏鸡生长受阻，增重缓慢，常常容易引起大肠杆菌等条件性致病菌而发病，使鸡群出现产蛋能力降低、顽固性拉稀、免疫抑制，抗病力降低等症状。成年鸡多为带虫者，尽管没有明显症状，但对生长性能和产蛋能力都产生了很大影响，给养鸡业带来了巨大的经济损失。另外，球虫以其生命周期短，环境适应性强，传播能力大等特点，是目前危害养禽业的最顽固的病原体，防不胜防，给养禽业带来的巨大的经济损失。尤其是第二代裂殖生殖阶段，产生的大量的裂殖子重新入侵未感染的肠道上皮细胞，导致肠粘膜出现了扁平样结构，肠绒毛萎缩，大面积的坏死和糜烂塌陷，阻碍了营养物质的吸收，使感染鸡群排出血便，消化和吸收功能下降，饲料转化率降低，鸡增重下降，诱发其他病原感染而死亡，严重的影响了养鸡业的发展。药物防治仍然是目前防治球虫病的主要手段，而针对耐药性的产生，迫切需要抗球虫新药的研发，而新药的研发需要寻找重要的作用靶标，一般主要通过筛选来得到抑制齐U，或者通过设计抑制分子去探测靶蛋白的特性。然而药物靶位的筛选是一个漫长的过程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因。本发明的目的还在于提供一种柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因在制备抗鸡球虫病药物物的应用。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因，具有编码SEQ ID NO. I的氨基酸序列。所述的基因全长2562bp，含有完整的1647bp 0RF，编码549个氨基酸，理论分子量为60822. 4Da,分子式为C2705H4235N739O803S27,等电点为5. 89,带负电荷的氨基酸总数(Asp+Glu)为71个，带正电荷的氨基酸总数(Arg+Lys)为62个，总体偏酸性，抗原位点分析发现有19个抗原位点。本发明的技术方案还采用了一种柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因的表达方法，包括以下步骤以E. tenella为实验虫株,建立了药物抗球虫作用模型，以E. tenella第二代裂殖子为研究对象，构建了地克珠利作用E. tenella第二代裂殖子差异表达cDNA消减文库，借助cDNA微阵列技术筛选出一种地克珠利抗球虫作用的关键分子，经BlastP比对分析表明为E. tenella丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(EtPP)EST序列。
所述的表达方法具体包括以下步骤(一)E. tenella第二代裂殖子的制备(I)试验模型的建立优质黄羽蛋公雏购自洛阳市光华种鸡场，在河南科技大学试验动物房进行饲养，饲养环境保持清洁卫生，且无任何病原体污染。实验动物饲养至12日龄时，平均分为两组，实验14日龄，两种均接种球虫，分为感染对照组(接种球虫，Omg/kg地克珠利饲料)和药物处理组(接种球虫，lmg/kg地克珠利饲料,从实验96h到实验120h)。建立地克珠利抗球虫试验动物模型；
(2)E. tenella第二代裂殖子的制备在感染后120h扑杀试验鸡，剪开盲肠壁，去除盲肠内容物，用含双抗冰冷的PBS洗去盲肠上残余的内容物；将洗净的盲肠在培养皿中剪成约Icm3大小的碎块，转移至烧杯中，加入10倍体积的酶消化液，37°C水浴中消化45min，并不时的搅拌，使裂殖子充分游离出来；并经四层灭菌纱布过滤，除去大的组织块和杂质；滤液经3000r/min离心IOmin ;用PBS重悬沉淀，洗涤，3000r/min离心IOmin ;采用红细胞裂解液重悬沉淀，4°C裂解lOmin，并不时的搅动，然后2500r/min离心IOmin ;用PBS洗漆沉淀一次，3000r/min离心IOmin ；用PBS将沉淀稀释，加入Percoll分离液，配置成30% Percoll悬液；将含30%Percoll的裂殖子悬液缓慢加至50%的Percoll PBS溶液上面，注意不要破坏液面；3200r/min离心15min后，小心吸取50%的Percoll溶液层到另一干净的离心管中；用PBS清洗含裂殖子吸出液，3500r/min离心5min后，收集沉淀；PBS洗漆,3500r/min离心5min,沉淀即为获得的第二代裂殖子；(二)E. tenella第二代裂殖子EtPP基因的克隆(I)E. tenella第二代裂殖子总RNA的提取总RNA的提取按照Invitrogen公司的Trizol试剂提取操作说明进行。(2)E. tenella第二代裂殖子EtPP基因5’和3’的扩增以消减文库中筛选测序后的序列为EST，以按照clonetech公司SMARTer RACEcDNA Amplification Kit说明书进行基因3，和5’的扩增，5’ RACE 3’ primer :为 5’ -GACAGTTTGCGTGCGTCCGTTGAAG-3，，3’ RACE 5’ primer 为 5’ -CCGTCTGCTACCCCTGGCTITTGTG-3 ’，扩增产物进行 I %琼脂糖凝胶电泳分析；(3)E. tenella第二代裂殖子EtPP基因5’和3’ PCR扩增产物的回收及与测序米用QIAGEN公司的QIA quick Gel Extraction kit回收基因5’和3，的扩增产物，并与PMD19-T Vector连接，转化转化DH5 a感受态细胞，进行蓝白斑筛选，挑选白斑菌落过夜培养后，进行PCR鉴定；经鉴定分子量大小与预期一致的阳性菌落，送上海英俊生物技术有限公司进行测序；(4)E. tenella第二代裂殖子EtPP基因全长序列的拼接将测序获得的3’ RACE和5’ RACE PCR产物序列，利用DNAstar软件查找扩增产物的序列与原EST序列的重叠部分，将三段序列拼接为全长cDNA序列；(5)E. tenella第二代裂殖子EtPP基因的扩增与测序以拼接全长基因序列为基础，利用Primer 5. 0软件设计上下游引物，以cDNA为模板，全长扩增引物为Sense primer :5 ' -TGCATGCGACAGGATATTTG-3 '和 Antisenseprimer :5' -GCGAAGTTTTCAATGCCAAG-3'，进行 RT-PCR 扩增全长；反应结束后采用 QIAGEN公司的 QIA quick Gel Extraction kit 将 PCR 产物与 pMD 19-T Vector 连接，转化 DH5 a感受态细胞，进行蓝白斑筛选，挑选白斑菌落过夜培养后，进行PCR鉴定；经鉴定分子量大小与预期一致的阳性菌落，送上海英俊生物技术有限公司进行测序，序列与原序列相同；(S)E. tenella第二代裂殖子EtPP蛋白的表达(I)EtPP表达质粒的构建以cDNA为模板，根据测序获得序列(图3)及表达载体pET_28a多克隆位点，在目的序列ORF (图4)两端选择EcoR I和Not I酶切位点，
弓丨物序列为Senseprimer 5 ' -CTAGAATTCATGGCGGAAGGCAGCGAC-3 '和Antisense primer :5' -GCAGCGGCCGCTTAAATGAAGCTTAGC-3'，利用 PCR 扩增 EtPP 基因，对PCR回收产物和pET-28a质粒分别用EcoR I和Not I进行双酶切，纯化回收后，T4DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌DH5 a细胞，挑取单克隆，PCR及测序证明EtPP基因已正确插入HIS基因的下游，命名为pET-28a-EtPP ；(2) EtPP表达质粒在大肠杆菌中的表达将鉴定正确的重组表达质粒pET-28a_EtPP转入大肠杆菌BL21 (DE3)宿主细胞，37 °C过夜培养，挑取单菌落，接种于含Kan的LB液体培养基中扩大培养，当菌液在37 °C培养至0D260大约0. 4 0. 6时，加入IPTG至终浓度为0. 8mmol/L，37°C诱导表达，在不同的培养时间收集菌体，超声破碎后，进行SDS-PAGE电泳分析，表达产物主要以包涵体形式存在；(3) EtPP蛋白的纯化BL21(DE3)表达的EtPP蛋白主要以包涵体的形式存在。取上述菌体，12000r/min，4°C离心15min后取沉淀，PBS洗涤并重悬菌体，冰浴超声后，12000r/min，4°C离心后收集沉淀，即得纯净的包涵体。然后参照His Bind树脂纯化法纯化包涵体蛋白，SDS-PAGE技术检测分析。本发明采用目前新型、低毒、广谱、高效的抗球虫药地克珠利，以E. tenella为实验虫株，建立了药物抗球虫作用模型，以E. tenella第二代裂殖子为研究对象，构建了地克珠利作用E. tenella第二代裂殖子差异表达cDNA消减文库，借助cDNA微阵列技术筛选出一种地克珠利抗球虫作用的关键分子，经BlastP比对分析表明为E. tenella丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(EtPP)EST序列，并通过RACE技术扩增获得EtPP的全长序列，并进行了全长基因的表达和应用探讨。本发明利用RACE技术，首次扩增到E. tenella的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(EtPP)基因，该基因全长2562bp，含有完整的1647bp 0RF，编码549个氨基酸，理论分子量为60822. 4Da,分子式为C2705H4235N739O803S27,等电点为5. 89,带负电荷的氨基酸总数(Asp+Glu)为71个，带正电荷的氨基酸总数(Arg+Lys)为62个，总体偏酸性。抗原位点分析发现有19个可能的抗原位点。本发明将该基因连接到原核表达载体pET-28a中，构建了原核表达重组质粒pET-28a-EtPP，并实现了在大肠杆菌BL21(DE3)系统中的表达，表达的融合蛋白以包涵体形式存在，并采用His -Bind树脂纯化法获得重组融合蛋白EtPP，为后续开展新药靶位的筛选和确认奠定了理论基础，解决了球虫耐药性的客观难题，具有广阔的市场前景和经济效益。
图I为EtPP基因Y PCR扩增产物；其中，M，DNA分子量标准，I为Y PCR产物；图2为EtPP基因:V PCR扩增产物；其中，M，DNA分子量标准，I为Y PCR产物；图3为EtPP基因全长序列；图4为EtPP基因ORF PCR扩增产物；图5为SDS-PAGE检测重组质粒pET_28a_EtPP在E. coli BL21 (DE3)细胞中的表达；其中，M，低分子量蛋白分子量标准；NC，阴性对照(没有进行诱导表达)；(lh，2h，4h，6h,8h,9h),不同时间诱导的表达产物；Su,上清；Pe,沉淀；图6为SDS-PAGE检测EtPP融合蛋白纯化产物；M，低分子量蛋白分子量标准；1和2，蛋白纯化产物。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。本发明的柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因的表达方法如下一、E. tenella第二代裂殖子的制备(I)试验模型的建立优质黄羽蛋公雏购自洛阳市光华种鸡场，在河南科技大学试验动物房进行饲养，饲养环境保持清洁卫生，且无任何病原体污染。实验动物饲养至12日龄时，平均分为两组，实验14日龄，两种均接种球虫，分为感染对照组(接种球虫，Omg/kg地克珠利饲料)和药物处理组(接种球虫，lmg/kg地克珠利饲料,从实验96h到实验120h)。建立地克珠利抗球虫试验动物模型。(2)E. tenella第二代裂殖子的制备在感染后120h扑杀试验鸡，剪开盲肠壁，去除盲肠内容物，用含双抗冰冷的PBS洗去盲肠上残余的内容物；将洗净的盲肠在培养皿中剪成约Icm3大小的碎块，转移至烧杯中，加入10倍体积的酶消化液，37°C水浴中消化45min，并不时的搅拌，使裂殖子充分游离出来；并经四层灭菌纱布过滤，除去大的组织块和杂质；滤液经3000r/min离心IOmin ;用PBS重悬沉淀，洗涤，3000r/min离心IOmin ;采用红细胞裂解液重悬沉淀，4°C裂解lOmin，并不时的搅动，然后2500r/min离心IOmin ;用PBS洗漆沉淀一次，3000r/min离心IOmin ；用PBS将沉淀稀释，加入Percoll分离液，配置成30% Percoll悬液；将含30%Percoll的裂殖子悬液缓慢加至50%的Percoll PBS溶液上面，注意不要破坏液面；3200r/min离心15min后，小心吸取50%的Percoll溶液层到另一干净的离心管中；用PBS清洗含裂殖子吸出液，3500r/min离心5min后，收集沉淀；PBS洗漆,3500r/min离心5min,沉淀即为获得的第二代裂殖子。二、E. tenella第二代裂殖子EtPP基因的克隆(I)E. tenella第二代裂殖子总RNA的提取总RNA的提取按照Invitrogen公司的Trizol试剂提取操作说明进行。(2)E. tenella第二代裂殖子EtPP基因5’和3’的扩增
以消减文库中筛选测序后的序列为EST，以按照clonetech公司SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 说明书进行基因 3’ 和 5’ 的扩增，5，RACE 3，primer 为 5，-GACAGTTTGCGTGCGTCCGTTGAAG -3，，3，RACE 5，primer 为5’ -CCGTCTGCTACCCCTGGCTTTTGTG-3’，扩增进行I %琼脂糖凝胶电泳分析。(3)E. tenella第二代裂殖子EtPP基因5’和3’ PCR扩增产物的回收及与测序米用QIAGEN公司的 QIA quick Gel Extraction kit 回收基因 5’(图 I)和 3’(图2)的扩增产物，并与pMD19-T Vector连接，转化转化DH5 a感受态细胞，进行蓝白斑筛选，挑选白斑菌落过夜培养后，进行PCR鉴定。经鉴定分子量大小与预期一致的阳性菌落，送上海英俊生物技术有限公司进行测序。(4)E. tenella第二代裂殖子EtPP基因全长序列的拼接
将测序获得的3’ RACE和5’ RACE PCR产物序列，利用DNAstar软件查找扩增产物的序列与原EST序列的重叠部分，将三段序列拼接为全长cDNA序列(图3)。(5)E. tenella第二代裂殖子EtPP基因的扩增与测序以拼接全长基因序列为基础，利用Primer 5. 0软件设计上下游引物，以cDNA为模板，全长扩增引物为Sense primer :5 ' -TGCATGCGACAGGATATTTG-3 '和 Antisenseprimer :5' -GCGAAGTTTTCAATGCCAAG-3'，进行 RT-PCR 扩增全长。反应结束后采用 QIAGEN公司的 QIA quick Gel Extraction kit 将 PCR 产物与 pMD 19-T Vector 连接，转化 DH5 a感受态细胞，进行蓝白斑筛选，挑选白斑菌落过夜培养后，进行PCR鉴定。经鉴定分子量大小与预期一致的阳性菌落，送上海英俊生物技术有限公司进行测序，序列与原序列相同。三、E. tenella第二代裂殖子EtPP蛋白的表达(I)EtPP表达质粒的构建以cDNA为模板，根据测序获得序列(图3)及表达载体pET_28a多克隆位点，在目的序列ORF (图4)两端选择EcoR I和Not I酶切位点，引物序列为Sense primer 5/ -CTAGAATTCATGGCGGAAGGCAGCGAC-3'和Antisense primer :5' -GCAGCGGCCGCTTAAATGAAGCTTAGC-3/，利用PCR扩增EtPP基因，对PCR回收产物和pET-28a质粒分别用EcoR I和Not I进行双酶切，纯化回收后，T4DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌DH5 a细胞，挑取单克隆，PCR及测序证明EtPP基因已正确插入HIS基因的下游，命名为pET-28a-EtPP。(2) EtPP表达质粒在大肠杆菌中的表达将鉴定正确的重组表达质粒pET-28a_EtPP转入大肠杆菌BL21 (DE3)宿主细胞，37 °C过夜培养，挑取单菌落，接种于含Kan的LB液体培养基中扩大培养，当菌液在37 °C培养至0D260大约0. 4 0. 6时，加入IPTG至终浓度为0. 8mmol/L，37°C诱导表达，在不同的培养时间收集菌体，超声破碎后，进行SDS-PAGE电泳分析，表达产物主要以包涵体形式存在，如图5。(3) EtPP蛋白的纯化BL21(DE3)表达的EtPP蛋白主要以包涵体的形式存在。取上述菌体，12000r/min，4°C离心15min后取沉淀，PBS洗涤并重悬菌体，冰浴超声后，12000r/min，4°C离心后收集沉淀，即得纯净的包涵体。然后参照His Bind树脂纯化法纯化包涵体蛋白，SDS-PAGE检测分析如图6。本实施例的柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因的表达方法的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO. I 所示序列表SEQUENCE LISTING〈110〉河南科技大学〈120〉一种柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因及其表达方法和应用<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>558 〈213〉柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因〈400〉IMAEGSDSAAISCNSAESLKREEGQIIKDSAMAVDGGGSCAAKEAGNVVPCSEKDVS 57ASAAVLERAEALKNEGNVLFKQHQYAEAVAKYSAAIDLVDEAPVDPRETQLHVFLC I14NRAFAHLRMENFGSAIIDAERALKLNPKFSKGYYRRGTGYFCLGNLKAAQRDFERV I7ICQLRGGKDADAQSRLNECKKQLRAQAFAAAIRTKQTIPASKQVLAEGLEKLFPVPA 228DYAGPVYKKGKVDEEFLQALRTWLQNPENRLHPQYAYAMAVDFIEILEPLPSLVDL 285EIPADKEITICGDVHGQFYDLLNIFTINGMPSEENPYLFNGDIVDRGSFSVEVLLM 342MVACKLAYPNHMHITRGNHETSEMNAMYGFKGEMLNKYDERLYQIFSEAFRLLPLA 399FVVNKKAFVVHGGLSRQENVTLDEIRKIDRNREPGSDVLITDLLWSDPSPLPGLTP 456SKRGVACQFGPDITEKFLKTNNLSFVIRSHEMKEAGYEVEHGGKLITVFSAPNYCD 5I3EMGNKGAFIRLKGSEMVPKFHQFTAVPHPPGPAMQYANPMLSFI558
权利要求
1.一种柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因，其特征在于具有编码SEQ ID NO. I的氨基酸序列。
2.根据权利要求I所述的柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因，其特征在于所述的基因全长2562bp，含有完整的1647bp ORF,编码549个氨基酸，理论分子量为60822. 4Da，分子式为C27tl5H4235N739O8tl3S27，等电点为5. 89，带负电荷的氨基酸总数(Asp+Glu)为71个，带正电荷的氨基酸总数(Arg+Lys)为62个，总体偏酸性。抗原位点分析发现有19个可能的抗原位点。
3.一种柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因的表达方法，其特征在于包括以下步骤以E. tenella为实验虫株，建立了药物抗球虫作用模型，以E. tenella第二代裂殖子为研究对象，构建了地克珠利作用E. tenella第二代裂殖子差异表达cDNA消减文库，借助cDNA微阵列技术筛选出一种地克珠利抗球虫作用的关键分子，经BlastP比对分析表明为E. tenella丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(EtPP)EST序列。
4.根据权利要求I所述的柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因的表达方法，其特征在于所述的表达方法具体包括以下步骤 (一)E.tenella第二代裂殖子的制备 (1)试验模型的建立 优质黄羽蛋公雏，实验动物饲养至12日龄时，平均分为两组，实验14日龄，两种均接种球虫，分为感染对照组(接种球虫，Omg/kg地克珠利饲料)和药物处理组(接种球虫，Img/kg地克珠利饲料，从实验96h到实验120h)，建立地克珠利抗球虫试验动物模型； (2)E.tenella第二代裂殖子的制备 在感染后120h扑杀试验鸡，剪开盲肠壁，去除盲肠内容物，用含双抗冰冷的PBS洗去盲肠上残余的内容物；将洗净的盲肠在培养皿中剪成约Icm3大小的碎块，转移至烧杯中，加入10倍体积的酶消化液，37°C水浴中消化45min，并不时的搅拌，使裂殖子充分游离出来；并经四层灭菌纱布过滤,除去大的组织块和杂质；滤液经3000r/min离心IOmin ;用PBS重悬沉淀，洗涤，3000r/min离心IOmin ;采用红细胞裂解液重悬沉淀，4°C裂解lOmin，并不时的搅动，然后2500r/min离心IOmin ;用PBS洗漆沉淀一次，3000r/min离心IOmin ； 用PBS将沉淀稀释，加入Percoll分离液，配置成30 % Percoll悬液；将含30%Percoll的裂殖子悬液缓慢加至50%的Percoll PBS溶液上面，注意不要破坏液面；3200r/min离心15min后，小心吸取50%的Percoll溶液层到另一干净的离心管中；用PBS清洗含裂殖子吸出液，3500r/min离心5min后，收集沉淀；PBS洗漆,3500r/min离心5min,沉淀即为获得的第二代裂殖子； (二)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因的克隆 (1)E.tenella第二代裂殖子总RNA的提取 总RNA的提取按照Invitrogen公司的Trizol试剂提取操作说明进行； (2)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因5’和3，的扩增 以消减文库中筛选测序后的序列为EST，以按照clonetech公司SMARTer RACEcDNAAmplification Kit说明书进行基因3，和5’的扩增， · 1·5，RACE 3，primer :为 5，-GACAGTTTGCGTGCGTCCGTTGAAG-3，， ·3’ RACE 5’ primer 为 5’ -CCGTCTGCTACCCCTGGCTTTTGTG-3’，扩增产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳分析； (3)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因5’和3’ PCR扩增产物的回收及与测序 采用QIAGEN公司的QIA quick Gel Extraction kit回收基因5’和3’的扩增产物，并与PMD19-T Vector连接，转化转化DH5a感受态细胞，进行蓝白斑筛选，挑选白斑菌落过夜培养后，进行PCR鉴定； (4)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因全长序列的拼接 将测序获得的3’ RACE和5’ RACE PCR产物序列，利用DNAstar软件查找扩增产物的序列与原EST序列的重叠部分，将三段序列拼接为全长cDNA序列； (5)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因的扩增与测序 以拼接全长基因序列为基础，利用Primer 5. O软件设计上下游引物，以cDNA为模板，全长扩增引物为Sense primer :5' -TGCATGCGACAGGATATTTG-3'和 Antisense primer 5' -GCGAAGTTTTCAATGCCAAG-3'，进行RT-PCR扩增全长；反应结束后采用QIAGEN公司的QIA quick Gel Extraction kit 将 PCR 产物与 pMD19_T Vector 连接，转化 DH5 α 感受态细胞，进行蓝白斑筛选，挑选白斑菌落过夜培养后，进行PCR鉴定； (S)E. tenella第二代裂殖子EtPP蛋白的表达 (1)EtPP表达质粒的构建 以cDNA为模板，根据测序获得序列及表达载体pET-28a多克隆位点，在目的序列ORF两端选择EcoR I和Not I酶切位点， 引物序列为Sense primer :5 ' -CTAGAATTCATGGCGGAAGGCAGCGAC-3 '和 Antisenseprimer 5/ -GCAGCGGCCGCTTAAATGAAGCTTAGC-3'，利用 PCR 扩增 EtPP 基因，对 PCR 回收产物和pET-28a质粒分别用EcoR I和Not I进行双酶切，纯化回收后，T4DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌DH5a细胞，挑取单克隆，PCR及测序证明EtPP基因已正确插入HIS基因的下游，命名为pET-28a-EtPP ； (2)EtPP表达质粒在大肠杆菌中的表达 将鉴定正确的重组表达质粒pET-28a-EtPP转入大肠杆菌BL21 (DE3)宿主细胞，37°C过夜培养，挑取单菌落，接种于含Kan的LB液体培养基中扩大培养，当菌液在37°C培养至0D260大约O. 4 O. 6时，加入IPTG至终浓度为O. 8mmol/L，37°C诱导表达，在不同的培养时间收集菌体，超声破碎后，进行SDS-PAGE电泳分析，表达产物主要以包涵体形式存在； (3)EtPP蛋白的纯化 BL21(DE3)表达的EtPP蛋白主要以包涵体的形式存在。取上述菌体，12000r/min，4°C离心15min后取沉淀，PBS洗涤并重悬菌体，冰浴超声后，12000r/min，4°C离心后收集沉淀，即得纯净的包涵体；然后参照His · Bind树脂纯化法纯化包涵体蛋白，SDS-PAGE进行检测分析。
5.一种利用柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因制备抗鸡球虫病药物的应用。
全文摘要
本发明涉及一种柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因及其表达方法和应用。其中，柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因，具有编码SEQ ID NO.1的氨基酸序列。本发明利用RACE技术，首次扩增到E.tenella的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(EtPP)基因，该基因全长2562bp，含有完整的1647bp ORF，编码549个氨基酸，理论分子量为60822.4Da，分子式为C2705H4235N739O803S27，等电点为5.89，带负电荷的氨基酸总数(Asp+Glu)为71个，带正电荷的氨基酸总数(Arg+Lys)为62个，总体偏酸性。抗原位点分析发现有19个可能的抗原位点。本发明将该基因连接到原核表达载体pET-28a中，构建了原核表达重组质粒pET-28a-EtPP，并实现了在大肠杆菌BL21(DE3)系统中的表达，表达的融合蛋白以包涵体形式存在，并采用His·Bind树脂纯化法获得重组融合蛋白EtPP，为后续开展新药靶位的筛选和确认奠定了理论基础，解决了球虫耐药性的客观难题，具有广阔的市场前景和经济效益。
文档编号A61K48/00GK102676554SQ20121001085
公开日2012年9月19日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者刘梅, 周变华, 孔涛, 王国永, 王宏伟, 赵振升, 郝雪琴 申请人:河南科技大学