专利名称：猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗及其制备方法，属于兽用疫苗领域。
背景技术：
猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCVl和PCV2。PCVl为非致病性的病毒，而PCV2为致病性的病毒,PCV2 除导致仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)外，还能导致母猪的繁殖障碍，给养猪业造成严重的经济损失。猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是引起猪繁殖障碍的主要病原之一。PPV感染主要引起胚胎和胎儿死亡、母猪流产、产死胎和木乃伊胎等，此外PPV还与猪非化脓性 心肌炎、皮炎、肠炎及病毒血症等有关。近年来研究发现，PPV和PCV2混合感染时具有协同作用，导致仔猪出现明显的PMWS，使病情加重，损失更为严重。PPV在世界各地广泛存在，给养猪业造成巨大的经济损失。对于PCV2和PPV引起病症的预防，主要依赖于疫苗免疫。目前，仅有PCV2和PPV的单价疫苗，需要单独分别注射，免疫工作量大，成本很高。此外，由于二种病毒引起的疾病常常同时发生，因此一直以来需要PCV2和PPV的二联疫苗，以同时预防和治疗PCV2和PPV引起的PMWS综合症。然而，目前仅有文献报道分二次使用注射仔猪，因此提示PCV2抗原与PPV抗原同时注射时可能会相互干扰。因此，PCV2和PPV的二联疫苗也一直没能研制成功。此外，国内养殖场中PPV也有一定程度的变异，变异的PPV与PCV2共同作用使得母猪繁殖障碍与仔猪的PWMS综合症更难以控制，因此，现实中还迫切需要一次注射可以同时预防和治疗母猪、特别是怀胎母猪的繁殖障碍及仔猪的PWMS综合症的猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联疫苗。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联疫苗，以实现同时预防和治疗母猪与仔猪由PCV2、PPV引起的繁殖障碍和PMWS综合症等疾病。技术方案一种治疗或预防PMWS综合症的PCV2、PPV的二联灭活疫苗，含有灭活的PCV2抗原、灭活的PPV抗原和疫苗佐剂。优选地，本发明所述PCV2为PCV2SH株，保藏号为CGMCC No. 23890。优选地，本发明所述PCV2含量至少为灭活前IO6 tlTCID5c/头份；更优选地，所述PCV2含量至少为灭活前106_5TCID5tl/头份。优选地，本发明所述PPV为猪细小病毒病毒(Porcine parvovirus)PPV HN-2011株，保藏号为CCTCC NO.V201118于2011年6月9日保藏在中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)。
优选地，本发明所述PPV含量至少为灭活前IO7 tlTCID5ci/头份。优选地，本发明所述疫苗佐剂为ISA206、氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel 01、蜂胶、ISA760VG的一种或几种组合物；更优选地，为ISA206。优选地，本发明二联灭活疫苗为含有灭活的PCV2 SH株，含量为灭活前IO6 tlTCID5ci/头份，灭活的PPV HN-2011株，含量为灭活前107_ tlTCID5tl/头份，以及50% V/V ISA206佐剂。更优选地，本发明二联灭活疫苗为含有灭活的PCV2SH株，含量为灭活前IO6-5TCID50/头份，灭活的PPV HN-2011株，含量为灭活前IO7.0TCID50/头份，以及50% V/VISA206 佐剂。本发明的另一目的在于提供上述二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤分别培养PCV2和PPV，获得PCV2的病毒液和PPV的病毒液，灭活上述二种病毒液获得的二种抗 原(灭活的病毒液)，辅以佐剂制备成二联灭活疫苗。优选地，本发明所述制备方法中，灭活方法为甲醛灭活法；更优地，本发明的甲醛溶液(以40%体积的含量计)，浓度为0. 1% 0. 3% (V/V)，灭活时间为24 48h。优选地，本发明的二联疫苗的制备方法，所述浓缩方法为超滤法，更优选地，为浓缩2倍。优选地，本发明所述制备方法中，两种抗原的混合比例为等量体积混合。即通过上述浓缩比例和混合比例，可以使制备的二联灭活疫苗中应至少含有灭活前的PCV2106_tlTCID5tl/头份和灭活前的PPV107_tlTCID5tl/头份。更优选地，每头份疫苗中应至少含有灭活前的PCV2106_5TCID5tl/头份和灭活前的PPV为107_tlTCID5tl/头份。技术效果本发明预防猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗，制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便快捷，与现有技术中的分次免疫，至少需要打2针才能防治以上二种疾病的疫苗及其免疫方法相比，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。其次，申请人通过二联疫苗与单价疫苗免疫仔猪的效力比较发现，两种抗原成分在同一针二联疫苗中不仅相互没有干扰，而且二联疫苗单次注射仔猪的免疫效果高于两种单苗先后注射的免疫效果。此外，本发明的二联疫苗安全性更佳，避免了多次接种免疫出现的不良反应。最后，申请人通过二联疫苗与单价疫苗免疫母猪的效果比较发现，本发明的二联疫苗对于治疗或预防母猪繁殖障碍效果更好，经济效益明显增加。即本发明的PCV2、PPV的二联灭活疫苗，具有以下有益效果1) 二联灭活疫苗免疫仔猪后，副反应降低，安全性更佳，避免了多次接种免疫出现的不良反应；2) 二联灭活疫苗免疫母猪后，明显的降低了母猪的繁殖障碍；3) 二联灭活疫苗免疫母猪后，通过母源抗体，仔猪获得被动免疫，明显降低了仔猪的死亡率，提高了存活率，增加了经济效益；4) 二联灭活疫苗免疫仔猪和母猪，与现有技术中的分次免疫，至少需要打2针才能防治以上二种疾病的疫苗及其免疫方法相比，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。
图I为PCV2、PPV的二联灭活疫苗制备工艺流程图。毒株来源
PPVHN-2011 株分类命名猪细小病毒病毒(Porcine parvovirus)保藏日期2011年6月9日，保藏地址中国武汉,武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏单位中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号CCTCCNO :V201118。
具体实施例方式本发明实施例中所用的PCV2病毒为PCV2SH株，公开于中国专利文献·CN101240264A，保藏号为 CGMCC No. 23890。本发明实施例中所用的PPV为PPVHN-2011株，保藏编号为CCTCC NO :V201118。PPV HN-2011株为采集母猪死胎的肝、肠系膜淋巴结、肾、脑等组织，为一种特异性强、免疫性好的病毒株，主要特征如下理化特性检测将病毒液经56°C 30min灭活，乙醚、盐酸、氢氧化钠以及常用消毒剂处理后，接种单层ST细胞，观察CPE。结果表明，病毒对热抵抗力强，对脂溶剂、酸、碱以及常用消毒剂不敏感。病毒的电镜观察病毒经ST细胞培养72h后，将病变细胞上清经蔗糖梯度超速离心(40，OOOrpm)，纯化病毒颗粒经2%磷钨酸负染后，进行电镜观察。结果显示，病毒外观呈六角形或圆形，无囊膜，直径约为20nm。间接免疫荧光法检测取分离的毒株接种ST细胞，在5% C02、37°C条件下培养48h，经丙酮固定后，进行间接免疫荧光检测。结果显示，病毒液感染的ST细胞出现了特异性荧光，阴性对照无特异性荧光出现。特异性血清中和试验将病毒液和PPV特异性血清(南京农业大学提供)中和后，接种ST细胞，在5% C02、37°C条件下培养72h，收获细胞培养液，经2次反复冻融，收集培养液。连续传代3次，观察CPE。结果显示，病毒液通过PPV特异性血清中和后，无细胞病变。病毒的PCR基因扩增和序列测定参考行业标准“PPV聚合酶链反应操作规程”(编号SN/T 1874-2007)进行基因序列分析，方法包括设计引物、PCR、电泳、连接、转化、单克隆鉴定、测序、序列比对。结果显示，PCR扩增出了特异性条带，大小为445bp，与预期一致；进一步的序列测定和分析证实，该毒株与目前我国PPV流行毒株的序列同源性在98%以上，为目前猪群流行PPV毒株。病毒血凝活性检测取96孔微量反应板(U型)，用pH 7. 2的PBS将病毒培养液做2倍连续稀释，加入反应板，并设PBS阴性对照和PPV抗原阳性对照，再加入0. 6%豚鼠红细胞悬液，置室温lh。结果显示，病毒培养液能凝集豚鼠红细胞，具有较高的血凝活性，而且随着传代培养次数的增加，病毒对细胞的适应性增强，病毒血凝价可达到21°以上。病毒的毒力鉴定将病毒稀释至106_°TCID5(l/ml，滴鼻接种怀孕45天左右的初产母猪5头，每头4ml，跟踪观察母猪的产仔情况。结果显示，病毒接种怀孕母猪，可发生繁殖障碍，出现死胎、产弱仔等情况。通过本发明实施例所证明，上述PCV2病毒株与PPV HN-2011株，可以相互配合，在灭活二联疫苗中并无相互干扰现象；此外，申请人还发现制备获得灭活二联疫苗可以有效预防或治疗母猪的繁殖障碍，扩展了二联疫苗的应用。下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发 明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1PCV2、PPV的二联灭活疫苗的制备和检验I. I生产用毒种的制备PCV2SH株的制备将毒种用病毒稀释液(无血清的MEM培养基)作适当稀释，按感染复数(M. 0. I.)为0. 01接种于PK-15细胞(CCTCC，编号GDC0060)培养，37°C吸附30min,加入含4% (v/v)犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，37°C培养4日，冻融2 3次，收获病毒，病毒效价彡106_5TCID5Q/ml。PPV HN-2011株的制备将毒种用病毒稀释液(无血清的a -MEM培养基)作适当稀释，按感染复数(M. 0. I.)为0. 01接种于ST细胞(CCTCC，编号⑶C0007)培养，37°C吸附30min，加入含1% (v/v)犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，37°C培养4日，冻融2 3次，收获病毒，病毒效价> 107 0TCID50/mloI. 2病毒液的培养制备PCV2SH株病毒液的制备用转瓶细胞培养法。将长满单层的PK-15细胞，倒去细胞培养液，将毒种液按M.O. I. = 0.01的接种量接种于PK-15细胞上，轻轻旋转细胞瓶2周，37°C吸附30min，加入细胞维持液，置37°C旋转(10 12转/小时)培养。每日观察I 2次，细胞生长良好，37°C培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20°C以下保存，应不超过2个月。PPV HN-2011株病毒液的制备用转瓶细胞培养法。将长满单层的ST细胞，倒去细胞培养液，将毒种液按M. 0. I. = 0. 01的接种量接种于ST细胞上，轻轻旋转细胞瓶2周，37°C吸附30min，加入细胞维持液，置37°C旋转(10 12转/小时)培养。每日观察I 2次，细胞生长良好，37°C培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20°C以下保存，应不超过2个月。I. 3病毒液的处理PCV2SH株病毒液的处理将病毒液用中空纤维滤柱(孔径10 ii m与0. 45 ii m)过滤，除去细胞碎片。PPV HN-2011株病毒液的处理将病毒液用中空纤维滤柱(孔径IOiim与0. 45 u m)过滤，除去细胞碎片。I. 4病毒液的灭活PCV2SH株病毒液的灭活将检验合格的步骤3处理的病毒液加入甲醛溶液灭活，使甲醛溶液的终浓度为0. 2% (V/V)，随即充分摇匀升温，当温度升至37°C时开始计时，保持18小时灭活完毕,置2 8°C保存,应不超过I个月。PPV HN-2011株病毒液的灭活将检验合格的步骤3处理的病毒液加入甲醛溶液灭活，使甲醛溶液的终浓度为0. 1% (V/V)，随即充分摇匀升温，当温度升至37°C时开始计时，保持24小时灭活完毕，置2 8°C保存，应不超过I个月。I. 5含量测定
I. 5. 1PCV2SH株病毒含量测定将病毒液用MEM维持液做10倍系列稀释，取10_5、10' 10^3个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板PK-15细胞单层4孔，每孔0. Iml,同时设正常细胞对照，在37°C、5%CO2的温箱中继续培养24小时，换含2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM维持液，继续培养24小时；用冷丙酮固定细胞，用间接免疫荧光试验(IFA)测定每个稀释度含有PCV2阳性细胞(呈绿色)的孔数，根据Karber氏法计算病毒TCID5(I。每ml病毒含量彡IO6-5TCID500I. 5. 2PPV HN-2011株病毒含量测定将收获的病毒液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10_95个稀释度，分别接种ST细胞单层的96孔细胞培养板上，每个稀释度做4孔，每孔100 yl。同时设正常细胞对照，置37°C、5% CO2培养箱中培养5日，观察细胞病变(CPE)，根据Karber氏法计算病毒TCID50。病毒含量彡 IO7.0TCID50/ml。I. 5. 3抗原含量测定结果 按上述的方法生产了 3批(批号为试ZOOl、试Z002、试Z003)PCV2SH株和PPV HN-2011株病毒抗原，抗原的含量见表1，PCV2SH病毒株灭活前的病毒液含量均在106-5TCID50/ml以上，PPV HN-2011株灭活前的病毒液含量均在107_°TCID5(l/ml以上。表I抗原含量测定(滴度)
各批次抗原含量测定(Iog10TCIDWml)
抗原---
__试 ZOOl__试 Z002__试 Z003
PCV2SH 株6.56.76.7
PPVHN-2011 株7.37.57.5I. 6灭活效果测定I. 6. 1PCV2SH株病毒液的灭活检验取少量灭活病毒液接种已长成单层的PK-15细胞，37°C吸附I小时后弃病毒液，力口入新的细胞维持液，37°C培养2日，应无CPE，连续盲传3次，长成细胞单层后换成细胞维持液，37°C培养2日，用IFA法检测，应无绿色PCV2阳性细胞产生。I. 6. 2PPV HN-2011株病毒液的灭活检验取少量灭活病毒液接种已长成单层的ST细胞，37°C吸附I小时后弃病毒液，加入新的细胞维持液，37°C培养2日，连续盲传3次，应无CPE。I. 6. 3灭活结果3批(批号为试Z001、试Z002、试Z003))PCV2SH株和PPVHN-2011株病毒抗原的灭活检验结果见表2，表明病毒完全灭活。表23批抗原的灭活检验效果
权利要求
1.一种治疗或预防PMWS综合症的猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗，其特征在于，含有灭活的PCV2抗原、灭活的PPV抗原和疫苗佐剂。
2.根据权利要求I所述的猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗，其特征在于，所述 PCV2 为 PCV2SH 株，保藏号为 CGMCC No. 23890。
3.根据权利要求I所述的猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗，其特征在于，所述PCV2含量至少为灭活前106_tlTCID5tl/头份。
4.根据权利要求I所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述PCV2含量至少为灭活前IO6-5TCID50/ 头份。
5.根据权利要求I所述的猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗，其特征在于，所述 PPV 为 PPV HN-2011 株，保藏号为 CCTCC No. V201118。
6.根据权利要求I所述的猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗，其特征在于，所述PPV含量至少为灭活前107_ tlTCID5tl/头份。
7.根据权利要求I所述的猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗佐剂为ISA206、氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel 01、蜂胶、ISA760VG的一种或几种组合物。
8.—种如权利要求I 7任意一项所述的猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤分别培养PCV2和PPV，获得PCV2的病毒液和PPV的病毒液，灭活、并浓缩上述二种病毒液，辅以佐剂制备成二联灭活疫苗。
9.根据权利要求8所述的猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，每头份疫苗中应至少含有灭活前的PCV2106_tlTCID5tl/头份和灭活前的PPVlO7-0TCID50/ 头份。
10.根据权利要求8所述的猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，每头份疫苗中应至少含有灭活前的PCV2106_5TCID5tl/头份和灭活前的PPVlO7-0TCID50/ 头份。
全文摘要
本发明涉及预防和治疗猪传染病的多价疫苗，特别涉及治疗和预防猪圆环病毒2型和猪细小病毒的组合疫苗及其制备方法。本发明选用猪圆环病毒2型和猪细小病毒，制备方法如下培养猪圆环病毒2型，并灭活、浓缩；培养猪细小病毒，并灭活、浓缩；将上述2种抗原成分按比例混合，辅以佐剂制备成疫苗。本发明制备获得的二联疫苗使用方便，更为安全，而且免疫效果优于单独两种单苗联用。
文档编号A61K39/12GK102961742SQ201210010809
公开日2013年3月13日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司