专利名称：一种微杆菌以及采用该菌种转化生产手性药物中间体的方法
技术领域：
本发明涉及一种微杆菌及应用该菌种生产手性药物中间体(1尺，48)- 2-氮杂双环-[2.2.1]-庚垸-5-烯-3-酮的方法。
技术背景(1R,4S)- 2-氮杂双环-[2.2.1]-庚垸-5-烯-3-酮是一种十分有用的药物中间体，它有两种 异构体即(1R,4S)构型和(1S,4R)构型。阿巴卡韦及卡波韦等许多碳环嘌呤和嘧啶核苷酸类似 物具有抗HIV效果，(1R，4S)构型的化合物是合成以上药物的原料。筛选得到可以立体选 择性水解消旋2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮而得到其(111,48)构型化合物的产酶菌株， 在制药行业有实际应用价值，特别对抗艾滋病药物的合成具有重要意义。Steven等人1990年在《J.CHEM.SOC.CHEM.COMMUN. (16): 1120~1121. Chemoenzymic synthesis of (-)-carbovir utilizing a wholecell catalyzed resolution of 2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-ones》 一文中，利用两种不同的细菌ENZA-1 (i /2efl ococcz*y e，/ NCIB 40231)和ENZA-20 (尸"wtfomo"oy so/a朋cearam NCIB 40249)完整细胞生物转化水解(+/-) Y-内酰胺的研究，分别产生了两种构型的对映体。发明内容本发明需要解决的技术问题之一是公开一种能够转化生产(-)Y-内酰胺的细菌菌种， 即 一种微杆菌(M/cTo6acfcn'ww /^Aoa/Aowoxj^HW) (L29-9 )，保藏号为CGMCC No.2085 。本发明需要解决的技术问题之二是公开一种细菌的培养方法。本发明需要解决的技术问题之三是公开一种以细菌完整细胞转化生产(-)Y-内酰胺的方 法，使其高选择性水解(+)Y-内酰胺，对映体过量值达到99.5%以上，以获得高纯度的(-)Y-内酰胺。本发明用于转化生产(-)，内酰胺的微生物是一种微杆菌(i^'cra6ac^^w该菌种具有如下的性质1. 形态生理生化特征形态特征杆菌，菌落呈浅黄色，湿润，粘稠，圆形，边缘整齐，不透明。 生理生化特征革兰氏阳性细菌，产Y-内酰胺水解酶。2. 采用的培养基平板筛选培养基Na2HPO4'12H2O0.7%; KH2PO40.2%; MgS04'7H20 0.02%; CaCl2.2H20 0.001%; FeS04'7H20 0.0007%; ZnS04 0.000001%; NH4C10.2%; N-乙酰苯 丙氨酸0.3%;琼脂粉2% (均为质量/体积百分比)，溶于去离子水，以NaOH调pH值 为7.0， 105kPa灭菌30min。斜面保存培养基酵母粉0.5%;胰蛋白胨1%; NaCl 1%; N-乙酰苯丙氨酸0.3%;琼脂粉2% (均为质量/体积百分比)，溶于去离子水，以NaOH调pH值为7.0， 105kPa 灭菌30min。液体产酶培养基Na2HP04'12H20 0.7%; KH2PO40.2%; MgS04'7H20 0.02%; CaCl2'2H20 0.001%; FeS04.7H20 0.0008%; N-乙酰苯丙氨酸0,3%;碳源0.5%;氮源0.5% (均为质量/体积百分比)，溶于去离子水，以NaOH调pH值为7.0， 105kPa灭菌30min。 液体发酵培养基Na2HPO442H2O0.7%; KH2P04 0.2%;MgS04'7H20 0.02%; CaCl2'2H20 0.001%; FeS04'7H20 0.0008%; N-乙酰苯丙氨酸0.3%; 碳源0.5%;氮源0.5% (均为质量/体积百分比)，溶于去离子水，以碱性物质调pH值为 7.0， 105kPa灭菌30min。碳源葡萄糖、蔗糖、木糖、柠檬酸、淀粉或乳糖中的一种。 氮源牛肉膏、胰蛋白胨、酵母粉或玉米浆中的一种。 3.培养条件培养温度25 50°C，更适宜温度25 40°C。培养方式有氧条件下进行发酵培养。本发明的利用含，内酰胺水解酶的完整细胞转化(+/-) 内酰胺制备(-) 内酰胺的方法， 其步骤顺序如下(1)菌种筛选将采集的环境土样用无菌水梯度稀释后涂布于平板筛选培养基，3(TC有氧条件下培养4天，挑单菌落保存在斜面保存培养基上培养2天并保存于4'C冰箱。 将保存菌株无菌条件下用接种环接于液体发酵培养基中，3(TC条件下，摇床振荡培养48 小时，将培养的菌液8000转/分钟条件下离心5分钟，收集沉淀菌体，并用磷酸盐缓冲液 洗涤，得到湿菌体。将湿菌体与2^(+/-) 内酰胺溶液混合，湿菌体浓度为1%质量/体积百分比，在30。C， pH7.0条件下，200转/分钟振荡12小时；以10000转/分钟离心3分钟，得到的上清液用 手性HPLC检测，筛选得到(-)Y-内酰胺的产率达38%以上且ee值达77%以上的菌株进行保藏， 并命名为微杆菌(必'cro力acz^h"/z 力/o^oca2^o"o;r/(/朋s) (L29-9)，保藏号为CGMCC No. 2085 。保藏日期2007年6月28日，保藏单位为CGMCC。(2)斜面培养将筛选得到的微杆菌接种于斜面保存培养基上，25 40'C培养20 50小时；(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接于液体发酵培养基中，25 4(TC条件下，摇床振荡培养20 50小时，制得种子； (4)摇瓶培养以5%体积/体积百分比接种量，接种子于液体产酶培养基中，25 4(TC有氧条件下，摇床振荡培养20 50小时，制得发酵液；(5)收集菌体取步骤(4)的发酵液8000 10000转/分钟条件下离心3 5分钟， 收集沉淀菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤，得到湿菌体作为生物催化剂；(6) 生物转化实验将步骤(5)中的生物催化剂与0.5 5g/L(+Z-)y-内酰胺溶液混合； 湿菌体浓度为0.1 1%质量/体积百分比；在25 5(TC， pH6.0 8.0条件下，200 220转/ 分钟振荡1 12小时；(7) 分离样品以5000 10000转/分钟离心3 5分钟，分离步骤(6)中生物催化剂， 得到上清液即为样品；取步骤(7)中5uL样品进样，禾拥手性HPLC测定(+)Y-内酰胺及(-) 内酰胺的含 量，计算出ee值及(-)Y-内酰胺的产率。在上述方法中，手性HPLC采用CHIRALPAKAS-H250x4.6mm，流动相乙腈 异丙醇(80 : 20)。通过手性HPLC测定得到微杆菌转化消旋的Y-内酰胺得到(-)，内酰胺的 ee值最高达到99.8%，(-)，内酰胺的产率最高达到42.5%。
图1是外消旋？内酰胺的手性HPLC图谱。1号峰为溶剂乙酸乙酯，2号峰为(+) 内酰 胺，3号峰为(-)Y-内酰胺。图2是按照本发明实施例1的方法，转化后的？内酰胺的手性HPLC图谱。1号峰为溶 剂乙酸乙酯，2号峰为(+) 内酰胺，3号峰为(-)Y-内酰胺。图3是按照本发明实施例2的方法，转化后的Y-内酰胺的手性HPLC图谱。l号峰为溶 剂乙酸乙酯，2号峰为(+)，内酰胺，3号峰为(-) 内酰胺。图4是按照本发明实施例3的方法，转化后的？内酰胺的手性HPLC图谱。1号峰为溶 剂乙酸乙酯，2号峰为(+)Y-内酰胺，3号峰为(-)Y-内酰胺。图5是按照本发明实施例4的方法，转化后的Y-内酰胺的手性HPLC图谱。l号峰为溶 剂乙酸乙酯，2号峰为(+) 内酰胺，3号峰为(-)，内酰胺。图6是按照本发明实施例4的方法，转化后的Y-内酰胺的手性HPLC图谱。l号峰为溶 剂乙酸乙酯，2号峰为(+)Y-内酰胺，3号峰为(-)Y-内酰胺。图7是按照本发明实施例4的方法，转化后的？内酰胺的手性HPLC图谱。l号峰为溶 剂乙酸乙酯，2号峰为(+) 内酰胺，3号峰为(-)Y-内酰胺。
具体实施例方式
菌种筛选将从宁夏、西藏、北京若干地方采集的环境土样用无菌水梯度稀释后涂布于平板筛选培养基，3(TC有氧条件下培养4天，挑单菌落保存在斜面保存培养基上培养2并 保存于4'C冰箱。将保存菌株无菌条件下用接种环接于液体发酵培养基中，3(TC条件下，摇床振荡培 养40小时，将培养的菌液8000转/分钟条件下离心5分钟，收集沉淀菌体，并用磷酸盐 缓冲液洗涤，得到湿菌体。将湿菌体与2g/L (+/-)，内酰胺溶液混合，湿菌体浓度为0.5%质 量/体积百分比，在30'C， pH7.0条件下，200转/分钟振荡12小时；以10000转/分钟离 心3分钟，得到的上清液用手性HPLC检测，筛选得到产率及ee值高的菌株进行保藏， 并命名为微杆菌(必'cro&"e/7'鹏勿^racarZ)朋or"血/LS) (L29-9)，保藏号为CGMCC No. 2085 。以下实施例中所选菌种均为筛选得到的微杆菌。实施例1:利用微杆菌的完整细胞转化(+/-)，内酰胺制备(-)丫-内酰胺的方法(1) 菌禾中选择选用微杆菌(Mifcro6a"en'ww /^AocarZjowoxyc/am1) CGMCC No.2085;(2) 斜面培养将上述菌种接种于斜面保存培养基上，30'C培养48小时；(3) 种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接于5ml液体发酵 培养基中，3(TC条件下，摇床振荡培养24小时，制得种子；(4) 摇瓶培养以5%体积/体积百分比接种量，接种子于50ml液体发酵培养基中， 3(TC条件下，摇床振荡培养40小时，制得发酵液；(5) 收集菌体取步骤(4)的发酵液8000转/分钟条件下离心5分钟，收集沉淀 菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤，即制成生物催化剂；(6) 转化实验将步骤(5)中的生物催化剂与2g/L(+A)Y-内酰胺溶液混合，湿菌 体浓度0.5%质量/体积百分比，在30'C， pH7.0条件下，200转/分钟振荡2小时；(7) 分离样品以10000转/分钟离心3分钟，分离步骤(6)中生物催化剂，得到 上清液即为样品；取步骤(7)中5uL样品进样，利用手性HPLC测定(+)，内酰胺及(-)Y-内酰胺的含 量，得到ee值为99.80/0，产率42.5%。实施例2:利用微杆菌的完整细胞转化(+/->/-内酰胺制备(-;^-内酰胺的方法(1) 菌禾中选择选用微杆菌(Af/cro6""en'ww Z^<irocar6w7ax;>^a"50 CGMCC No.2085;(2) 斜面培养将上述菌种接种于斜面保存培养基上，25'C培养50小时；(3) 种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接于5ml液体发酵 培养基中，25'C条件下，摇床振荡培养20小时，制得种子；(4) 摇瓶培养以5%体积/体积百分比接种量，接种子于50ml液体发酵培养基中， 25'C条件下，摇床振荡培养50小时，制得发酵液；(5) 收集菌体取步骤(4)的发酵液10000转/分钟条件下离心3分钟，收集沉淀 菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤，即制成生物催化剂；(6) 转化实验将步骤(5)中的生物催化剂与0.5§化(+/-)7-内酰胺溶液混合，湿菌 体浓度0.1%质量/体积百分比，在25。C， pH8.0条件下，200转/分钟振荡12小时；(7) 分离样品以10000转/分钟离心3分钟，分离步骤(6)中生物催化剂，得到 上清液即为样品；取步骤(7)中5uL样品进样，利用手性HPLC测定(+) 内酰胺及(-)Y-内酰胺的含量， 得到ee值为97.2%,产率20.8%。实施例3:利用微杆菌的完整细胞转化(+/-) 内酰胺制备(-)1内酰胺的方法(1) 菌禾中选择选用微杆菌(M/cra6acten'MOT /z少drac6o"ox;^amO CGMCC No.2085;(2) 斜面培养将上述菌种接种于斜面保存培养基上，4(TC培养20小时；(3) 种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接于5ml液体发酵 培养基中，4(TC条件下，摇床振荡培养20小时，制得种子；(4) 摇瓶培养以5%体积/体积百分比接种量，接种子于50ml液体发酵培养基中， 4(TC条件下，摇床振荡培养20小时，制得发酵液；(5) 收集菌体取步骤(4)的发酵液I0000转/分钟条件下离心3分钟，收集沉淀 菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤，即制成生物催化剂；(6) 转化实验将步骤(5)中的生物催化剂与5^1^(+/-) 内酰胺溶液混合，湿菌 体浓度0.5%质量/体积百分比，在4(TC， pH6.0条件下，200转/分钟振荡1小时；(7) 分离样品以8000转/分钟离心5分钟，分离步骤(6)中生物催化剂，得到 上清液即为样品；取步骤(7)中5yL样品进样，禾U用手性HPLC测定(+)，内酰胺及(-)Y-内酰胺的含量， 得到ee值为90.3%,产率32.4%。实施例4:利用微杆菌的完整细胞转化(+/-)，内酰胺制备(-) 内酰胺的方法(1 )菌禾中选择选用微杆菌(M/croZ)acten'Mw /^Aocar6o"o;cj^aAW) CGMCC No.2085;(2) 斜面培养将上述菌种接种于斜面保存培养基上，30'C培养48小时；(3) 种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接于5ml液体发酵 培养基中，3(TC条件下，摇床振荡培养20小时，制得种子； (4) 摇瓶培养以5%体积/体积百分比接种量，接种子于50ml液体发酵培养基中， 30'C条件下，摇床振荡培养50小时，制得发酵液；(5) 收集菌体取步骤(4)的发酵液8000转/分钟条件下离心5分钟，收集沉淀菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤，即制成生物催化剂；(6) 转化实验将步骤(5)中的生物催化剂与281(+/-) 内酰胺溶液混合，湿菌 体浓度1%质量/体积百分比，在30。C， pH6.0条件下，200转/分钟振荡2小时；(7) 分离样品以10000转/分钟离心3分钟，分离步骤(6)中生物催化剂，得到 上清液即为样品；取步骤(7)中5UL样品进样，利用手性HPLC测定(+)，内酰 胺及(-)Y-内酰胺的含量，得到ee值为99.5。/。，产率40%。实施例5:利用微杆菌的完整细胞转化(+/->^-内酰胺制备(-)"内酰胺的方法(1) 菌禾中选择选用微杆菌(M/cTo6acto"/ww /^c/racar6o"o;c>^<my) CGMCC No.2085;(2) 斜面培养将上述菌种接种于斜面保存培养基上，35'C培养48小时；(3) 种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接于5ml液体发酵 培养基中，35'C条件下，摇床振荡培养20小时，制得种子；(4) 摇瓶培养以5%体积/体积百分比接种量，接种子于50ml液体发酵培养基中， 35'C条件下，摇床振荡培养48小时，制得发酵液；(5) 收集菌体取步骤(4)的发酵液8000转/分钟条件下离心5分钟，收集沉淀 菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤，即制成生物催化剂；(6) 转化实验将步骤(5)中的生物催化剂与化1(+/-) 内酰胺溶液混合，湿菌 体浓度0.5%质量/体积百分比，在35'C， pH6.0条件下，200转/分钟振荡IO小时；(7) 分离样品以10000转/分钟离心3分钟，分离步骤(6)中生物催化剂，得到 上清液即为样品；取步骤(7)中5uL样品进样，禾,手性HPLC测定(+)Y-内酰胺及(-)Y-内酰胺的含量， 得到ee值为97.43%，产率40.07%。实施例6:利用微杆菌的完整细胞转化(+/-)，内酰胺制备(-) 内酰胺的方法(1) 菌禾中选择选用微杆菌(M/cro6a"en'ww /y^raaw"6owcwQ^am) CGMCC No.2085;(2) 斜面培养将上述菌种接种于斜面保存培养基上，32"C培养48小时； (3) 种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接于5ml液体发酵 培养基中，32'C条件下，摇床振荡培养24小时，制得种子；(4) 摇瓶培养以5%体积/体积百分比接种量，接种子于50ml液体发酵培养基中, 32。C条件下，摇床振荡培养40小时，制得发酵液；(5) 收集菌体取步骤(4)的发酵液8000转/分钟条件下离心5分钟，收集沉淀 菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤，即制成生物催化剂；(6) 转化实验将步骤(5)中的生物催化剂与^化(+/-)丫-内酰胺溶液混合，湿菌体浓度0.1%质量/体积百分比，在32X:， pH8.0条件下，220转/分钟振荡12小时；(7) 分离样品以5000转/分钟离心5分钟，分离步骤(6)中生物催化剂，得到 上清液即为样品；取步骤(7)中5uL样品进样，利用手性HPLC测定(+)Y-内酰胺及(-) 内酰胺的含量， 得到ee值为96.16%,产率48.0%。以上实施例中所用液体发酵培养基中的碳源、氮源及碱性物质见下表:实施例^"""""^碳源氮源碱性物质实施例1木糖酵母粉NaOH实施例2葡萄糖胰蛋白胨NaOH实施例3蔗糖玉米浆KOH实施例4拧檬酸酵母粉NaOH实施例5乳糖酵母粉KOH实施例6淀粉牛肉膏氨水
权利要求
1.一种微杆菌Microbacterium hydrocarbonoxydans保藏号为CGMCCNo.2085。
2. —种根据权利要求1所述微杆菌的筛选，其特征在于，包括以下步骤将采集的环境土样用无菌水梯度稀释后涂布于平板筛选培养基，30'C有 氧条件下培养4天，挑单菌落保存在斜面保存培养基上培养2天并保存于4 'C冰箱；其中平板筛选培养基组成为Na2HPCV12H20 0.7%; KH2P04 0.2%; MgS04'7H20 0.02%; CaCl2.2H20 0.001%; FeS04-7H20 0.0007%; ZnS04 0.000001%; NH4C1 0.2%; N-乙酰苯丙氨酸0.3%;琼脂粉2%;以上含量均 为质量/体积百分比，溶于去离子水，用NaOH调pH值为7.0， 105kPa灭菌 30min;斜面保存培养基组成为酵母粉0.5%;胰蛋白胨1%; NaCl 1%; N-乙 酰苯丙氨酸0.3%;琼脂粉2%;以上含量均为质量/体积百分比，溶于去离子水，用NaOH调pH值为7.0， 105kPa灭菌30min;将保存菌株无菌条件下用接种环接于液体产酶培养基中，3(TC条件下， 摇床振荡培养48小时，将培养的菌液8000转/分钟条件下离心5分钟，收集 沉淀菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤，得到湿菌体；其中液体产酶培养基组成 为Na2HP04'12H20 0.7%; KH2P04 0.2%; MgS04-7H20 0.02%; CaCl2-2H20 0.001%; FeS04.7H20 0.0008%; N-乙酰苯丙氨酸0.3%;葡萄糖0.5%;酵母 粉0.5%;以上均为质量/体积百分比，溶于去离子水，用NaOH调pH值为 7.0， 105kPa灭菌30min;将湿菌体与2g/L (+A)Y-内酰胺溶液混合，湿菌体浓度为1%质量/体积百 分比，在30。C， pH7.0条件下，200转/分钟振荡12小时;以10000转/分钟 离心3分钟，得到的上清液用手性HPLC检测，筛选得到(-)Y-内酰胺的产率达 38°/0以上且ee值达77%以上的菌株进行保藏，并命名为微杆菌必'crMa"en'咖 力/c/racan^77a^c/朋5i29-9，保藏号为CGMCC No. 2085 。
3. —种以微杆菌为菌种生产(-)Y-内酰胺的方法，其特征包括(1) 菌禾中选择选用微禾干菌M/cra^c/en'wm/zj^/racarZ)o"oxj^ms保 藏号为CGMCCNo.2085; (2) 斜面培养将上述菌种接种于斜面保存培养基上，25 5(TC培 养20 50小时；(3) 种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接于液体发酵培养基中，25 4(TC条件下，摇床振荡培养25 50小时，制得种子。 其中液体发酵培养基组成为Na2HP(V12H20 0.7%; KH2P04 0.2%; MgS04.7H20 0.02%; CaCl2'2H20 0.001%; FeS04.7H20 0.0008%; N-乙酰苯丙氨酸0.3%;碳源0.5%;氮源0.5%;以上均为质量/体积百分比，溶于去离子水，以碱性物质调pH值为7.0， 105kPa灭菌30min。(4) 摇瓶培养以5%体积/体积百分比接种量，接种子于液体发酵培 养基中，25 5(TC有氧条件下，摇床振荡培养20 50小时，制得发酵液；(5) 收集菌体取步骤(4)的发酵液8000 10000转/分钟条件下离 心3 5分钟，收集沉淀菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤，得到湿菌体作为生物 催化剂；(6) 生物转化实验将步骤(5)中的生物催化剂湿菌体与0.5 5g/L (+/-)y-内酰胺溶液混合；湿菌体浓度为0.1 1%质量/体积百分比；在25 50°C， pH6.0 8.0条件下，200 220转/分钟振荡1 12小时；(7) 分离样品以5000 10000转/分钟离心3 5分钟，分离步骤(6) 中生物催化剂，得到上清液即为样品。
4.根据权利要求2或者3所述的方法，其特征在于磷酸盐缓冲液为 0.05MNa2HPO4: 0.05MNaH2P04体积比为7: 3。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于培养及转化温度为25 40°C。
6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的碱性物质包括 NaOH、 KOH、氨水中的一种。
7. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的碳源包括葡萄糖、蔗糖、木糖、柠檬酸、淀粉或乳糖中的一种。
8. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的氮源包括牛肉膏、 胰蛋白胨、酵母粉或玉米浆中的一种。
全文摘要
本发明公开了一种氧化烃微杆菌(Microbacterium hydrocarbonoxydans)(L29-9)，保藏号为CGMCC No.2085及应用该菌种转化生产手性药物中间体(1R，4S)-2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮(以下简称(-)γ-内酰胺)的方法，包括如下步骤(1)菌种的筛选；(2)将菌种接入含有N-乙酰苯丙氨基酸或碳源的培养基中，同时添加必要的氮源及营养物质，以碱性物质调节发酵液pH值，使其生产一种内酰胺酶，通过生物转化消旋2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5烯-3-酮得到(1R，4S)-2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮及(1S，4R)-2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮。
文档编号C12P13/00GK101113423SQ20071011806
公开日2008年1月30日 申请日期2007年6月28日 优先权日2007年6月28日
发明者亮 冯, 张广据, 王建军, 赵一飞, 郑国钧, 郭晓燕 申请人:北京化工大学;山东黄河龙集团有限公司;中国科学院微生物研究所