专利名称：一种酶水解大豆异黄酮的方法
技术领域：
本发明涉及一种酶水解大豆异黄酮的方法。
背景技术：
酶的固定化是将生物催化剂酶固定到一定的载体上。随着生物技术的发展，酶作为催化剂有专一性好，催化效率高，且反应条件温和等优点，在工业应用上也在越来越多的替代传统意义上的催化剂。但是酶作为催化剂工业上应用的主要缺点就是价格比较昂贵，且不能重复利用。1916年Nelson和Griffin首次将蔗糖酶吸附到活性碳和矾土上，首次实现酶的固定化(R.F.Taylor，Protein immobilization，Marcel Dekker，IncNew York，1991，v)。从那时开始酶的固定化技术就得到了很快的发展，到目前为止已经有很成熟的固定化方法吸附、共价交联、包埋等，同时还得出固定化酶在一定程度上还能提高酶的稳定性。在上个世纪70年代酶的固定化已经开始在应用于工业化(R.F.Taylor，Protein immobilization，MarcelDekker，IncNew York，1991，v)。
大豆异黄酮是大豆中一种具有生理活性的物质，其主要功能有两方面，植物雌激素功能和抗氧化功能(Song T T，Gendirch S，Murphy P A.Estrogenic activityof glycitein，a soy isoflavone，J.Agric.Food Chem.，1999，471607-1610；Michael Naim，Benjamin Gesterner，Shmuel Zilkah.Soy isoflavones，characterization，determination，and antifungal activity，J.Agric.FoodChem.，1974，22(5)806-810)。主要表现为(1)具有人体雌激素的功能作用，从而有效地防治女性更年期综合症。(2)防治癌症。能特异性地抑制蛋白酪氨酸激酶(TPK)的活性，提高人体解毒酶的活性，有效地防治乳腺癌、子宫癌、肠癌、白血病、前列腺癌等。(3)可双向调节人体内雌激素水平，具有美容保健的作用。(4)防治骨质疏松症。可以抑制骨骼再吸收，是防治骨骼疏松的优良药物。(5)具有显著的抗血清脂蛋白脂质过氧化作用，效果甚至优于维生素E。预防和辅助治疗体内脂质过氧化引起的疾病，如高血脂、动脉粥状硬化、冠心病等。(6)因其具有较强的抗氧化作用，抑制或清除体内活性自由基，能延缓机体的衰老。
大豆异黄酮中，有效成分主要有糖苷和苷元两类。糖苷主要包括大豆苷(Daidzin)(结构式如式I)和染料木苷(Genistin)(结构式如式II)，它的水解产物分别是大豆苷元(Daidzein)(结构式如式III)和染料木素(Genistein)(结构式如式IV)，也就是游离的苷元。直接从大豆中提取得到的天然大豆异黄酮主要成分是糖苷，苷元只占很小的一部分，但是主要起生理活性的是苷元(MizukiOnozawa，Kazunori Fukuda，Mikinobu Ohtani.Effects of Soybean Isoflavoneson Cell Growth and Apoptosis of the Human Prostatic Cancer Cell Line LNCaP，Jpn.J.Clin.Oncol.，1998，28360-363)，所以对水解大豆异黄酮的研究就成为一个热点。目前水解大豆异黄酮主要有酸法水解、碱法水解、和酶催化水解。由于酸法和碱法水解得到产物的稳定性得到了质疑(张晨，杨晓泉，孔慧清.不同加工条件下大豆异黄酮组分稳定性的研究现状.大豆科学，2006，25(1)73-76)，且由于体系中大量的酸碱，不容易实现工业化。酶法水解大豆异黄酮具有条件温和等酶催化反应的优点，但是存在酶不能回收利用，成本代价高，且后期产品分离困难等问题。
发明内容本发明的目的是提供一种酶水解大豆异黄酮的方法。
本发明所提供的酶水解大豆异黄酮的方法，是用固定化大豆异黄酮糖苷水解酶在由有机溶剂和缓冲液组成的双相体系中将糖苷型大豆异黄酮水解获得苷元型的大豆异黄酮；所述有机溶剂对所述大豆异黄酮的苷元的溶解度大于水。
所述有机溶剂可为醇类、酯类或酮类有机溶剂，优选为酯类，尤其优选为乙酸乙酯；所述缓冲液可为磷酸盐缓冲液、Tirs-盐酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。
所述大豆异黄酮糖苷水解酶具体可为β-葡萄糖苷酶；所述缓冲液具体可为柠檬酸盐缓冲液。
所述缓冲液的pH值可为3-9，优选为3-7，尤其优选为5-6.5。
所述柠檬酸盐缓冲液为由柠檬酸与柠檬酸三钠配成的溶液；所述柠檬酸与柠檬酸三钠的溶液的摩尔浓度可为0.05-2M，优选为0.1-0.5M，尤其优选为0.1M。
所述双相体系中有机溶剂体积含量优选为10％-80％，尤其优选为40％-60％。
所述水解反应的反应温度可为10-90℃，优选为30℃-60℃，尤其优选为40-45℃。
所述方法中，所述固定化β-葡萄糖苷酶和大豆异黄酮的配比可为每克大豆异黄酮1U-1000U固定化β-葡萄糖苷酶，优选为每克大豆异黄酮10-50U固定化β-葡萄糖苷酶。
所述方法中，反应结束后，可将有机相和水相分离，除去所述有机溶剂，得到大豆异黄酮水解产物。
为了解决现有的酶法水解大豆异黄酮中存在的成本代价高且后期分离困难的问题，本发明采用固定化酶水解大豆异黄酮和双相体系水解大豆异黄酮。固定化酶中，水解大豆异黄酮的酶选用β-葡萄糖苷酶；而载体选用来源丰富且生物相容性很好的壳聚糖；将其做成小球，然后将β-葡萄糖苷酶用常规方法共价交联固定到小球上。固定化酶可以重复利用，且从产物中很容易分离。大豆异黄酮容易溶于酯类，醇类，酮类有机溶剂，难溶于水，以及石油醚，正己烷等非极性溶剂中；而酶在有机溶剂中容易失活，其水解需要合适的缓冲溶液。因此双相体系可以实现酶的高效利用和产物的分析。本双相反应体系机理如图1所示，反应中，随着水相溶液中底物(大豆苷和染料木苷)的消耗，沉淀中的底物进入水相溶液补充，对于乙酸乙酯而言，大豆异黄酮中的糖苷在水中的溶解度高于乙酸乙酯，所以大部分固相的底物直接进入水中补充。在双相体系中水解后生成的产物苷元(大豆苷元和染料木素)被不断的萃取到有机相中(大豆苷元和染料木素在水相中溶解度很小)，又因为糖苷在有机相中溶解度很小，所以反应后产物苷元全部富集在有机相中，而几乎不含糖苷。反应结束取出有机相，蒸发出有机溶剂即可得到所要的苷元。
本发明同时也给出分别在单相(缓冲液)和双相体系中，用固定化和游离的β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮的实验结果。发现双相体系中固定化酶水解大豆异黄酮比在单相中速率快，收率高，且得到的产品没有异味；游离酶在双相中很容易失活，水解大豆异黄酮不彻底。
本发明的酶水解大豆异黄酮的方法，不仅实现了酶有效的水解大豆异黄酮，且该方法得到的产品没有异味，无需纯化，设备工艺简单，具有很好的工业放大前景。
图1为本发明的双相体系固定化酶水解大豆异黄酮原理2为大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素标准品的HPLC图谱图3为滴漏装置示意4为不同pH值下游离和固定化β-葡萄糖苷酶的相对活性图5为40℃固定化和游离的β-葡萄糖苷酶的稳定性图6为50℃固定化和游离的β-葡萄糖苷酶的稳定性图7为60℃固定化和游离的β-葡萄糖苷酶的稳定性图8为固定化β-葡萄糖苷酶连续水解16次pNPG的相对酶活图9为单相体系中固定化酶的水解实验结果图10为双相体系中固定化酶的水解实验结果图11为简易的水解异黄酮反应器示意图具体实施方式
本发明的酶水解大豆异黄酮的方法，包括以下步骤(1)将酶按常规方法固定于载体上，这里的酶可以是各种大豆异黄酮糖苷水解酶，优选为β-葡萄糖苷酶，载体亦可以是多种常规的载体，优选为壳聚糖。
(2)在双相体系中利用固定化酶，进行糖苷型大豆异黄酮的水解。这里的双相体系是由一种有机溶剂和一种缓冲液组成，其中有机相可以为对苷元型溶解好的酯类，醇类，酮类有机溶剂，如正己醇，乙酸乙酯，乙酸甲酯等，这里优选为乙酸乙酯。水相可以为多种常用的酶的适宜的缓冲液，如磷酸缓冲液，Tirs盐酸缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液等，这里优选为柠檬酸盐缓冲液。进一步的，所选柠檬酸盐缓冲液具体可为柠檬酸与柠檬酸三钠的溶液，其pH可为3.0-9.0，优选为pH＝5.0，摩尔浓度为0.1M。
(3)第二步中所述双相体系中组分可任意配比，优选为1∶1。
(4)所述方法中，所述固定化β-葡萄糖苷酶和大豆异黄酮的配比可为每克大豆异黄酮1U-1000U酶，优选为每克大豆异黄酮10U。
(5)本方法所述水解反应的反应温度可为10-90℃，优选为40℃。
(6)所述方法中，反应结束后，将有机相和水相分解，除去有机相中的有机溶剂，如优选的乙酸乙酯，即可得到苷元型的大豆异黄酮水解产物。
下面结合实施例具体阐明本发明的酶水解大豆异黄酮的方法。
下述实施例中所用的材料壳聚糖购自济南海得贝海洋生物工程有限公司，脱乙酰度90.2％。
β-葡萄糖苷酶购自Fluka，货号49290。
β-葡萄糖苷酶底物pNPG(p-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，BBI分装)。
大豆苷中国药品生物制品检定所，111738-200501。
染料木苷中国药品生物制品检定所，111709-200501。
大豆苷元中国药品生物制品检定所，1502-200101。
染料木素中国药品生物制品检定所，111704-200501。
大豆异黄酮购自浙江欣欣生化科技有限公司，为常规30％含量产品。其组分含量是用HPLC(日本岛津)测定，流动相为含有体积百分含量为0.5％的乙酸的甲醇溶液和纯水，甲醇溶液和纯水的体积比为37∶63，流速为1ml.min-1，柱温40℃。色谱柱为Dikma公司的Diamonsil的C18反相柱，型号是5U，250×4.6mm。用标准品在此条件下做HPLC如图2。并在此条件下用外标法做标准曲线，得线形回归方程大豆苷Y＝21872.46+3.552E7*X，R＝0.99992，X0002-0.064/mg.ml-1，Y为峰面积。
染料木苷Y＝18902.34+4.9223E7*X，R＝0.99978，X0.002-0.048/mg.ml-1，Y为峰面积。
大豆苷元Y＝-28376.86+6.4507E7*X，R＝0.99903，X0.002-0.048/mg.ml-1，Y为峰面积。
染料木素Y＝33896.50+6.7382E7*X，R＝0.99975，X0.002-0.08/mg.ml-1，Y为峰面积。
本专利中的HPLC条件均同上，数据计算均按此方程。
该大豆异黄酮组分的质量百分含量大豆苷(Daidzin)10.6％，染料木苷(Genistin)17.9％，大豆苷元(Daidzein)1.7％，染料木素(Genistein)1.5％。如无特别说明下面提到水解前的大豆异黄酮均为此规格。
以下各实例中固定化酶或者游离酶水解大豆异黄酮得到苷元的收率，定义如下
实施例1、固定化β-葡萄糖苷酶的制备一、固定化β-葡萄糖苷酶的制备按照文献中描述的方法制备直径约2.5mm且非常均匀的壳聚糖小球(彭志英，岳振峰，张学兵.微球形固定化α-葡萄糖苷酶的制备.华南理工大学学报(自然科学版)，2001，29(6)56-59和Nitin W.Fadnavis，Gurrala Sheelu，BezavadaMani Kumar.Gelatin Blends with AlginateGels for Lipase Immobilizationand Purification，Biotechnol.Prog.2003，19557-564)。具体方法如下用体积百分含量为1％的乙酸配成25g/100ml的壳聚糖溶液，静止30分钟，用吸头配合小漏斗做成如图3所示的滴漏装置，吸头是吉尔森1ml和200μl吸头，漏斗为10ml小漏斗。
距离吸头20cm的正下方是由体积比为3∶2的2M NaOH和甲醛配成的凝结液，将壳聚糖溶液滴入正在搅拌的凝结液即得壳聚糖小球。
将制得的壳聚糖小球用清水冲洗3-5次，在pH＝6.5的0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，在室温下按照每克壳聚糖10Uβ-葡萄糖苷酶的配比加入壳聚糖小球和β-葡萄糖苷酶进行物理吸附10h，然后加入体积百分含量为0.4％的戊二醛交联20分钟，得到固定化的β-葡萄糖苷酶。
二、固定化β-葡萄糖苷酶的特性1、固定化β-葡萄糖苷酶酶活性与pH的关系将得到的固定化酶和游离酶，分别在40℃，不同pH值的0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中水解10mM的pNPG，水解7分钟，然后测定样品中水解产物(对-硝基苯酚)的浓度，得到在不同pH酶的相对活性。这里的相对活性指的是将测定的某个pH下最高活性定义为1，其他pH下的相对活性为其活性与最高活性的比值。又因为样品吸光度的变化的斜率跟酶的活性成正比，推导过程如下A＝KCLA为吸光度，C溶液摩尔溶度，L光程，K为仪器参数，为定值。
因为dA/dt＝K(dC/dt)L即Slope＝K[(dm/V)/dt](V/S)所以dm/dt＝slope.S/K这里m是产物的质量，S是酶标板的孔面积(定值)。
所以在取样相同的情况下测定吸光度的变化的斜率即可算出各个活性之间的关系。
结果如图4所示，表明在此条件下，固定化酶的最适反应pH是5。
2、固定化β-葡萄糖苷酶酶活性与温度的关系分别在40℃，50℃，60℃的水浴锅中放置一些等量的游离的和固定化的β-葡萄糖苷酶，酶所处的微环境是pH＝5的0.1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。每隔两个小时取出等量的酶，在pH＝5的0.1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，40℃的条件下，水解10mM的pNPG，水解7分钟，然后测定样品中水解产物(对-硝基苯酚)的浓度。得到8个小时内各个温度下的热稳定性。结果如图5-7所示，表明固定化酶在低于40℃时比较稳定，50℃加热8h后酶活降低了25.2％，60℃加热8h后酶活降低了83.8％。
3、固定化β-葡萄糖苷酶酶的重复使用性能在40℃，pH＝5的0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中连续水解10mM的pNPG，每次水解进行7分钟，然后测定样品中水解产物的浓度，得到固定化的相对酶活。以第一次测定的酶活为1，以后测定酶活与第一次测定的酶活的比值作为相对活性。从反应液中取出固定化的酶，用缓冲液洗三遍，重复上述测酶活，然后再取出，再洗，重复这个过程。得到固定化酶在经过16次使用的活性变化。固定化β-葡萄糖苷酶活性几乎没有损失(如图8)。
实施例2、固定化酶双水相水解大豆异黄酮在5ml 0.1M pH＝5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和5ml乙酸乙酯中加入14.8mg的30％规格的大豆异黄酮和1.48U固定化β-葡萄糖苷酶。反应均在40℃的恒温摇床中进行，反应三个小时，按上述HPLC方法测定大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量。
结果表明固定化酶水解最后得到的大豆苷元的量0.97mg、反应初始时大豆苷元的量0.25mg、大豆苷完全水解应得的大豆苷元的量0.96mg；最后得到的染料木素的量1.50mg、反应初始时染料木素的量0.22mg、染料木苷完全水解应得的染料木素的量1.64mg。经计算，固定化β-葡萄糖苷酶在此双相体系中水解大豆异黄酮，大豆苷元的收率为75.4％，染料木素的收率为77.9％。
实施例3、固定化β-葡萄糖苷酶在单相体系和双相体系中的应用对比实验设两个处理，其中一个处理为单相体系，在10ml 0.1M，pH＝5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中加入14.8mg的30％规格的大豆异黄酮和1.48U固定化β-葡萄糖苷酶；另一个处理为双相体系，在5ml 0.1M pH＝5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和5ml乙酸乙酯中加入14.8mg的30％规格的大豆异黄酮和1.48U固定化β-葡萄糖苷酶。反应均在40℃的恒温摇床中进行，每小时取样，按上述HPLC方法测定大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量，反应三个小时。结果如图9和图10所示，单相体系中不仅得不到产物，而且水解速率也略低于在双相体系中的速率。
实施例4、固定化酶双相体系中水解大豆异黄酮在1ml 0.1M pH＝5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和9ml乙酸乙酯中加入14.8mg的30％规格的大豆异黄酮和1.48U固定化β-葡萄糖苷酶。反应均在40℃的恒温摇床中进行，反应三个小时，按上述HPLC方法测定大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量。
结果表明固定化酶水解最后得到的大豆苷元的量0.96mg、反应初始时大豆苷元的量0.25mg、大豆苷完全水解应得的大豆苷元的量0.96mg；最后得到的染料木素的量1.20mg、反应初始时染料木素的量0.22mg、染料木苷完全水解应得的染料木素的量1.64mg。经计算，固定化β-葡萄糖苷酶在此双相体系中水解大豆异黄酮，大豆苷元的收率为73.9％，染料木素的收率为59.8％。
实施例5、固定化和游离的β-葡萄糖苷酶的在双相体系中的应用对比用100ml的烧瓶，恒温搅拌器，磁子构建一个简易的间歇全混釜反应器(图11)。实验设两个处理，其中一个处理为游离β-葡萄糖苷酶双相体系，在15ml 0.1MpH＝5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和15ml乙酸乙酯中加入500mg的30％规格的大豆异黄酮和5U游离的β-葡萄糖苷酶；另一个处理为固定化β-葡萄糖苷酶双相体系，在15ml 0.1M pH＝5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和15ml乙酸乙酯中加入500mg的30％规格的大豆异黄酮和5U固定化β-葡萄糖苷酶。在40℃，磁子在800rpm/min的条件下分别反应20小时。反应结束后，取样按上述HPLC方法测定大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量。
结果表明固定化酶水解最后得到的大豆苷元的量30.9mg、反应初始时大豆苷元的量8.5mg、大豆苷完全水解应得的大豆苷元的量32.3mg；最后得到的染料木素的量52.3mg、反应初始时染料木素的量7.5mg、染料木苷完全水解应得的染料木素的量55.5mg；经计算，固定化β-葡萄糖苷酶在此双相体系中水解大豆异黄酮，大豆苷元的收率为69.2％，染料木素的收率为80.8％。游离酶水解最后得到的大豆苷元的量26.8mg，染料木素的量为25.4mg；经计算，游离酶水解大豆异黄酮，其大豆苷元的收率为56.7％，染料木素为32.3％，而且随着反应时间延长，其收率并没有进一步提高，说明在此体系中游离β-葡萄糖苷酶在水解过程容易失活。
权利要求
1.一种酶水解大豆异黄酮的方法，是用固定化大豆异黄酮糖苷水解酶在由有机溶剂和缓冲液组成的双相体系中将糖苷型大豆异黄酮水解获得苷元型的大豆异黄酮；所述有机溶剂对所述大豆异黄酮苷元的溶解度大于水。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述有机溶剂为醇类、酯类或酮类有机溶剂，优选为酯类，尤其优选为乙酸乙酯；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tirs-盐酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述大豆异黄酮糖苷水解酶为β-葡萄糖苷酶；所述缓冲液为柠檬酸盐缓冲液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述缓冲液的pH值为3-9，优选为3-7，尤其优选为5-6.5。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述柠檬酸盐缓冲液为由柠檬酸与柠檬酸三钠配成的溶液；所述柠檬酸与柠檬酸三钠的溶液的摩尔浓度为0.05-2M，优选为0.1-0.5M，尤其优选为0.1M。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述双相体系中所述有机溶剂体积含量为10％-80％，优选为40％-60％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述水解反应的反应温度为10-90℃，优选为30℃-60℃，尤其优选为40-45℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中，所述固定化β-葡萄糖苷酶和大豆异黄酮的配比为每克大豆异黄酮1U-1000U固定化β-葡萄糖苷酶，优选为每克大豆异黄酮10-50U固定化β-葡萄糖苷酶。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中反应结束后，将有机相和水相分离，除去所述有机溶剂，得到大豆异黄酮水解产物。
全文摘要
本发明公开了一种双相体系生物法水解大豆异黄酮的方法。该方法是用固定化大豆异黄酮糖苷水解酶在由有机溶剂和缓冲液组成的双相体系中将糖苷型大豆异黄酮水解获得苷元型的大豆异黄酮；所述有机溶剂对所述大豆异黄酮苷元的溶解度大于水。本发明的双相体系水解大豆异黄酮的方法，不仅实现了大豆异黄酮的有效的水解，且该方法得到的产品没有异味，无需纯化，设备工艺简单。
文档编号C12P17/06GK101086002SQ20071011775
公开日2007年12月12日 申请日期2007年6月22日 优先权日2007年6月22日
发明者林章凛, 张涛, 黄哲 申请人:清华大学 被以下专利引用 (2),