专利名称：一种双歧啤酒的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物学、微生态学、分子生物学和生物工程发酵技术等，具体涉及一种功能性啤酒的制备。
背景技术：
传统的啤酒是一种以麦芽及酒花为原料用酿酒酵母发酵制成的含酒精、二氧化碳以及营养丰富的提神物饮料。数千年前就有啤酒，啤酒制造业几乎与葡萄酒制造业一样历史悠久。它长期以来就是一项重要的微生物工业，特别是近几十年来，在中国则是1978年以后，由于城市中数以万吨级以上的大啤酒厂的迅速产生，形成了大型的工业生产，不仅使农村中那些作坊式的小型酿造厂日益失去其重要地位，而且啤酒工业对酿造工艺的高要求也更为突出。世界上生产啤酒最多的国家是美国，但论历史悠久则要数欧洲，欧洲是近代啤酒的发源地，其中像德国、捷克斯洛伐克、丹麦、荷兰等都是很有名的生产国。
但纵观国内外目前市场上销售的均是传统的啤酒。随着社会的发展进步以及人民生活水平的不断提高，传统的啤酒已不能满足人民生活的需要，寻求高品味的更具有营养保健价值且能防病强身的生态啤酒将是时代发展的主旋律，而生态啤酒则具有上述潜在的生态效应，故它将是21世纪啤酒发展的必然趋势。
目前已有一些关于功能性啤酒的文献报导，如有功能性低聚糖啤酒或称双歧因子低聚糖啤酒的报道。由于低聚糖具有促进双歧杆菌增殖的功能，如低聚果糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、低聚乳糖、低聚半乳糖，摄入人体后，不被人体直接消化吸收，但能促进肠道有益菌群双歧杆菌的增殖，具有改善肠道菌群的保健作用，可以应用于防治糖尿病、肥胖及龋齿等疾病，还具有预防心脑血管疾病、抗衰老、提高机体免疫力等功效。但是，目前报道的双歧因子低聚糖啤酒，一般是在啤酒酿造的麦汁煮沸之后任意阶段添加功能性低聚糖(即双歧因子)，啤酒酵母不能分解利用功能性低聚糖，故而以原体的形式存留于酒液中，这些不被利用的小分子糖虽然能改善啤酒的口味，赋予啤酒一定的生理功能，但是其增加的生态功能是很有限的；同时人工制备的双歧因子价格昂贵，直接添加双歧因子，增加了啤酒的成本，并且缺乏双歧杆菌的菌体成分(如脂磷壁酸、膜磷壁酸等)和代谢产物，这些产物在人体内能发挥强大的生物学功能(如抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老、抗感染、抗电离辐射、降血脂、防治心血管疾病等)。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的上述不足，提供一种集营养保健与防病强身于一体的双歧啤酒，它利用厌氧的双歧杆菌(Bifidobacterium)和需氧的传统啤酒发酵菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)能相互利用而共生的原理作为双歧啤酒的发酵菌种；或利用双歧杆菌与酿酒酵母进行细胞融合，再筛选出具有两种菌的生物学功能的稳定菌株，作为本啤酒的发酵菌种；或利用现代分子生物学技术构建的双歧杆菌的其他基因工程菌作为该啤酒的发酵菌种，集双歧杆菌和酿酒酵母的生理功效于一身，增加啤酒的生理功效，节省制备成本。
本发明采用的技术方案如下一种双歧啤酒，它以麦芽、大米或玉米、啤酒花为原料，利用厌氧的双歧杆菌和需氧的传统啤酒发酵菌种酿酒酵母相互利用共生做为发酵菌种，采用以下方法发酵而制得1、用麦芽、大米或玉米、啤酒花为原料制备麦汁该过程是采用传统啤酒的麦汁制备过程。
2、发酵麦汁A、发酵菌种复苏将双歧杆菌接种于BL培养基，酿酒酵母接种于YPD培养基，分别复苏；B、接种发酵菌低温离心收集酿酒酵母，接种于麦汁中，菌量2.0×106/mL-2.0×1010/mL，在发酵罐中30℃培养10-30hr，待发酵罐内处于相对厌氧时，接种双歧杆菌，菌量为2.0×106/mL-2.0×1010/mL；(3)主发酵将上述接种了菌种的麦汁放置在8-12℃环境中，于麦汁相对厌氧的条件下，酿酒酵母和双歧杆菌进行厌氧发酵8-12天，糖被酵解，产生乙醇和二氧化碳等活性物质，并释放能量；(4)后发酵主发酵完毕后得到的发酵液为嫩啤酒，将嫩啤酒转移至无菌发酵罐，于2-10℃下放置25-35天，得到啤酒。
(5)除菌澄清将啤酒进行巴氏消毒灭菌和低温离心或过滤澄清，即得成品。
本发明也可采用双歧杆菌与酿酒酵母进行细胞融合得到的融合子作为发酵菌种，该菌种的获得方式是将双歧杆菌和酿酒酵母原生质体进行原生质体融合，采用10％乳糖中性红培养基筛选融合子，再生细胞壁后得到。
本发明还可采用把双歧杆菌DNA上的功能基因通过质粒载体转入酿酒酵母中构建基因工程菌，以得到双歧杆菌和酿酒酵母的基因工程菌作为发酵菌种。
本发明通过生物法来增加啤酒中的功能性低聚糖，即利用双歧杆菌与酿酒酵母共同发酵麦汁，在发酵过程中，双歧杆菌不仅合成分泌功能性低聚糖，还产生其他功能性因子，如乳酸、乙酸、多种维生素、微量元素和双歧杆菌的菌体成分(如脂磷壁酸、膜磷壁酸等等)。按照这种酿造工艺生产的功能性啤酒，集双歧杆菌和酿酒酵母的生理功效于一身，不仅赋予了啤酒本身特有的风味，还体现了双歧杆菌的强大生态效应；功能性低聚糖不需要人工制备，而是在双歧杆菌与酿酒酵母共生中产生，既酿制了质优的功能性啤酒，又节省了功能性低聚糖的人工制备。因此，双歧啤酒是一种物美价廉的功能性啤酒，它可打破传统啤酒的统治地位，使啤酒走向多元化的发展格局。人们饮用该生态啤酒后，可在人体内发挥双歧杆菌的强大生态效应，维持和调节肠道微生态平衡，增强机体免疫功能，抗肿瘤，抗衰老，抗感染，防治肝病以及降血脂等作用，促进人体健康，增强身体素质。
具体实施例方式
实施例11.1原料麦芽，市售大米或玉米，颗粒酒花。
1.2菌种1.2.1双歧杆菌(Bifidobacterium，86321)经数百代的耐氧驯化，对氧有一定的耐受性，但生物学特性保持不变，经冷冻真空干燥法保存菌种于4℃冰箱中，临用时取出复苏。
1.2.2酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，CICC1700)购自中国食品发酵工业研究所微生物菌种保藏中心。
工艺流程2.1粉碎原料2.1.1麦芽增湿粉碎 向麦芽喷淋60℃的水雾，使麦芽整粒水分增加1.5％，喷洒的水雾与麦芽充分混合，增湿时间2min。
2.1.2大米干粉碎 水分越低，粉碎越细，效果越好；大米粉不宜长时间存放，防止发热结块。
2.2制备麦汁2.2.1米粉糊化 于45℃下料，料液比为1∶5；70℃添加耐高温α-淀粉酶液，直至碘液反应完全；煮沸10min，上清液即为稀薄的大米醪液。
2.2.2麦粉糖化 于35℃下料，料液比为1∶4；50℃恒温60min，充分分解蛋白质；升温至65℃，以1∶2的比例添加冷却至65℃的大米醪液，恒温至碘液反应完全；80℃时终止。
2.2.3麦汁过滤 收集麦汁上清液和沉淀洗涤液，过滤两次。
2.2.4麦汁煮沸 酒花添加量为麦汁的0.2％，分4批添加，煮沸时添加10％，防止麦汁起沫，第二、三批于煮沸30min、60min时各添加20％，第四批于煮沸90min时添加50％，10min后终止煮沸，冷却，获得黄色、澄清的成熟麦汁。
2.3发酵麦汁2.3.1发酵菌种复苏双歧杆菌接种于BL培养基，厌氧，37℃，48hr；酿酒酵母接种于YPD培养基，需氧，30℃，48hr。
2.3.2接种发酵菌 低温离心(3000rpm，10min)收集酿酒酵母，接种于麦汁中，菌量2.0×107/mL为宜；30℃培养24hr，接种双歧杆菌，菌量为2.0×107/mL。
2.3.3主发酵放置在8-12℃环境中，于麦汁相对厌氧的条件下，酿酒酵母和双歧杆菌开始进行厌氧发酵8-12天，糖被酵解，产生乙醇和二氧化碳等活性物质，并释放能量。
2.3.4嫩啤酒检验麦汁经主发酵后的发酵液，叫嫩啤酒。主发酵完毕后，通过检验澄清情况、品尝、菌量计数，评定发酵过程。
2.3.5后发酵将嫩啤酒转移至无菌发酵罐，放置于4℃冰箱25-35天。
2.3.6除菌澄清将啤酒进行巴氏消毒灭菌和低温(4℃)离心(4000rpm，20min)或过滤。
2.4检测指标检测相对密度、实际浓度、酒精度、原麦汁浓度、发酵度、总酸度、泡沫性能、低聚还原糖、氨基酸、维生素和微量元素等多项重要啤酒性能指标。
表3-2-1麦汁的还原糖
α-氨基氮含量(mg/L)表3-2-2麦汁的还原糖
表3-6-1啤酒的一般指标
注“-”表示该几项只适用于啤酒指标，不适用于双歧发酵液。
表3-6-2啤酒的氨基酸
表3-6-4啤酒的维生素
表3-6-5啤酒的微量元素
表3-6-6啤酒的酸度和还原糖
通过以上检测指标可以看出双歧啤酒能够符合普通啤酒的所有指标要求，并在多个功能性因子「如钙、赖氨酸、乙酸、乳酸、还原糖(双歧因子前体)等」显著高于普通市售啤酒，而且具有双歧杆菌菌体成分(如脂磷壁酸、膜磷壁酸等)和代谢产物，这些产物在人体内能发挥强大的生物学功能(如抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老、抗感染、抗电离辐射、降血脂、防治心血管疾病等)。
实施例21.1原料麦芽，市售大米或玉米，颗粒酒花。
1.2菌种双歧杆菌与酿酒酵母进行细胞融合得到的融合子，再生细胞壁后作为发酵菌种，经冷冻真空干燥法保存菌种于4℃冰箱中，临用时取出复苏。
工艺流程2.1粉碎原料
2.1.1麦芽增湿粉碎 向麦芽喷淋60℃的水雾，使麦芽整粒水分增加1.5％，喷洒的水雾与麦芽充分混合，增湿时间2min。
2.1.2大米干粉碎 水分越低，粉碎越细，效果越好；大米粉不宜长时间存放，防止发热结块。
2.2制备麦汁2.2.1米粉糊化 于45℃下料，料液比为1∶5；70℃添加耐高温α-淀粉酶液，直至碘液反应完全；煮沸10min，上清液即为稀薄的大米醪液。
2.2.2麦粉糖化 于35℃下料，料液比为1∶4；50℃恒温60min，充分分解蛋白质；升温至65℃，以1∶2的比例添加冷却至65℃的大米醪液，恒温至碘液反应完全；80℃时终止。
2.2.3麦汁过滤 收集麦汁上清液和沉淀洗涤液，过滤两次。
2.2.4麦汁煮沸 酒花添加量为麦汁的0.2％，分4批添加，煮沸时添加10％，防止麦汁起沫，第二、三批于煮沸30min、60min时各添加20％，第四批于煮沸90min时添加50％，10min后终止煮沸，冷却，获得黄色、澄清的成熟麦汁。
2.3发酵麦汁2.3.1发酵菌种复苏把双歧杆菌与酿酒酵母进行细胞融合得到的融合子，作为发酵菌种，从4℃冰箱中取出接种于BL培养基，有氧，30-37℃，48hr，菌量2.0×108-12/mL为宜。
2.3.2接种发酵菌 低温离心(3000rpm，10min)收集上述融合子，接种于麦汁中，菌量2.0×107/mL为宜；2.3.3主发酵放置在8-12℃环境中，发酵8-12天，糖被酵解，产生乙醇和二氧化碳等活性物质，并释放能量。
2.3.4嫩啤酒检验麦汁经主发酵后的发酵液，叫嫩啤酒。主发酵完毕后，通过检验澄清情况、品尝、菌量计数，评定发酵过程。
2.3.5后发酵将嫩啤酒转移至无菌发酵罐，放置于4℃冰箱25-35天。
2.3.6除菌澄清将啤酒进行巴氏消毒灭菌和低温(4℃)离心(4000rpm，20min)或过滤。
2.4检测指标检测相对密度、实际浓度、酒精度、原麦汁浓度、发酵度、总酸度、泡沫性能、低聚还原糖、氨基酸、维生素和微量元素等多项重要啤酒性能指标。
实施例31.1原料麦芽，市售大米或玉米，颗粒酒花。
1.2菌种把双歧杆菌DNA上的功能基因通过质粒载体转化酿酒酵母构建基因工程菌，作为发酵菌种，经冷冻真空干燥法保存菌种于4℃冰箱中，临用时取出复苏。
工艺流程2.1粉碎原料2.1.1麦芽增湿粉碎 向麦芽喷淋60℃的水雾，使麦芽整粒水分增加1.5％，喷洒的水雾与麦芽充分混合，增湿时间2min。
2.1.2大米干粉碎 水分越低，粉碎越细，效果越好；大米粉不宜长时间存放，防止发热结块。
2.2制备麦汁2.2.1米粉糊化 于45℃下料，料液比为1∶5；70℃添加耐高温α-淀粉酶液，直至碘液反应完全；煮沸10min，上清液即为稀薄的大米醪液。
2.2.2麦粉糖化 于35℃下料，料液比为1∶4；50℃恒温60min，充分分解蛋白质；升温至65℃，以1∶2的比例添加冷却至65℃的大米醪液，恒温至碘液反应完全；80℃时终止。
2.2.3麦汁过滤 收集麦汁上清液和沉淀洗涤液，过滤两次。
2.2.4麦汁煮沸 酒花添加量为麦汁的0.2％，分4批添加，煮沸时添加10％，防止麦汁起沫，第二、三批于煮沸30min、60min时各添加20％，第四批于煮沸90min时添加50％，10min后终止煮沸，冷却，获得黄色、澄清的成熟麦汁。
2.3发酵麦汁2.3.1发酵菌种复苏把构建的上述基因工程酿酒酵母菌接种于YPD培养基，有氧，30℃，48hr，菌量2.0×108-12/mL为宜。
2.3.2接种发酵菌 低温离心(3000rpm，10min)收集上述基因工程酿酒酵母菌，接种于麦汁中，菌量2.0×107/mL为宜；30℃培养24hr。
2.3.3主发酵放置在8-12℃环境中发酵8-12天，糖被酵解，产生乙醇和二氧化碳等活性物质，并释放能量。
2.3.4嫩啤酒检验麦汁经主发酵后的发酵液，叫嫩啤酒。主发酵完毕后，通过检验澄清情况、品尝、菌量计数，评定发酵过程。
2.3.5后发酵将嫩啤酒转移至无菌发酵罐，放置于4℃冰箱25-35天。
2.3.6除菌澄清将啤酒进行巴氏消毒灭菌和低温(4℃)离心(4000rpm，20min)或过滤。
2.4检测指标检测相对密度、实际浓度、酒精度、原麦汁浓度、发酵度、总酸度、泡沫性能、低聚还原糖、氨基酸、维生素和微量元素等多项重要啤酒性能指标。
权利要求
1.一种双歧啤酒，其特征在于以麦芽、大米或玉米、啤酒花为原料，利用厌氧的双歧杆菌和需氧的传统啤酒发酵菌种酿酒酵母相互利用共生做为发酵菌种，采用以下方法发酵而制得(1)用麦芽、大米或玉米、啤酒花为原料制备麦汁；(2)发酵麦汁A、发酵菌种复苏将双歧杆菌接种于BL培养基，酿酒酵母接种于YPD培养基，分别复苏；B、接种发酵菌低温离心收集酿酒酵母，接种于麦汁中，菌量2.0×106/mL--2.0×1010/mL，在发酵罐中30℃培养10-30hr，待发酵罐内处于相对厌氧时，接种双歧杆菌，菌量为2.0×106/mL--2.0×1010/mL；(3)主发酵将上述接种了菌种的麦汁放置在8-12℃环境中，于麦汁相对厌氧的条件下，酿酒酵母和双歧杆菌进行发酵8-12天；(4)后发酵主发酵完毕后得到的发酵液为嫩啤酒，将嫩啤酒转移至无菌发酵罐，于2-10℃下放置25-35天，得到啤酒；(5)除菌澄清将啤酒进行巴氏消毒灭菌和低温离心或过滤澄清，即得成品。
2.一种双歧啤酒，其特征在于以麦芽、大米或玉米、啤酒花为原料，利用双歧杆菌与酿酒酵母进行细胞融合得到的融合子作为发酵菌种，采用以下方法发酵而制得(1)用麦芽、大米或玉米、啤酒花为原料制备麦汁；(2)发酵麦汁A、将双歧杆菌和酿酒酵母原生质体进行原生质体融合，筛选融合子，再生细胞壁后作为发酵菌种；B、发酵菌种复苏将上述融合子接种于BL或MRS或YPD培养基进行复苏增殖，使之达到108-1012/ml；C、接种发酵菌低温离心收集融合子，接种于麦汁中，菌量达到2.0×106/mL--2.0×1010/mL；(3)主发酵将上述接种了菌种的麦汁放置在8-12℃环境中，发酵8-12天；(4)后发酵主发酵完毕后得到的发酵液为嫩啤酒，将嫩啤酒转移至无菌发酵罐，于2-10℃下放置25-35天，得到啤酒；(5)除菌澄清将啤酒进行巴氏消毒灭菌和低温离心或过滤澄清，即得成品。
3.一种双歧啤酒，其特征在于以麦芽、大米或玉米、啤酒花为原料，利用双歧杆菌和酿酒酵母的基因工程菌作为发酵菌种，采用以下方法发酵而制得(1)麦芽、大米或玉米、啤酒花为原料制备麦汁；(2)发酵麦汁A、制备双歧杆菌和酿酒酵母的基因工程菌把双歧杆菌DNA上的功能基因通过质粒载体转入酿酒酵母中构建基因工程菌，作为发酵菌种；B、菌种复苏将上述基因工程菌接种于BL或MRS等培养基复苏增殖，使之达到108-1012/ml；C、接种发酵菌将双歧杆菌和酿酒酵母的基因工程菌接种于麦汁中，使菌种浓度达到2.0×106/mL--2.0×1010/mL；(3)主发酵将上述接种了菌种的麦汁放置在8-12℃环境中，进行发酵8-12天；(4)后发酵主发酵完毕后得到的发酵液为嫩啤酒，将嫩啤酒转移至无菌发酵罐，于2-10℃下放置25-35天，得到啤酒；(5)除菌澄清将啤酒进行巴氏消毒灭菌和低温离心或过滤澄清，即得成品。
全文摘要
本发明请求保护一种双歧啤酒，它以麦芽、大米或玉米、啤酒花为原料，利用厌氧的双歧杆菌和需氧的传统啤酒发酵菌种酿酒酵母能相互利用而共生的原理作为双歧啤酒的发酵菌种；或利用双歧杆菌与酿酒酵母进行细胞融合，再筛选出具有两种菌的生物学功能的稳定菌株，作为本啤酒的发酵菌种；或利用现代分子生物学技术构建的双歧杆菌的其他基因工程菌作为该啤酒的发酵菌种，集双歧杆菌和酿酒酵母的生理功效于一身，不仅赋予啤酒本身特有的风味，还能体现双歧杆菌的强大生态效应，可节省功能性低聚糖的制备成本。
文档编号C12C11/11GK1970716SQ20061009524
公开日2007年5月30日 申请日期2006年11月29日 优先权日2006年11月29日
发明者张德纯, 李代昆, 穆小萍, 邱建 申请人:重庆医科大学