一种婴儿双歧杆菌atcc 15697与芦荟共发酵饮料的制备方法
【专利摘要】一种婴儿双歧杆菌ATCC 15697与芦荟共发酵饮料的制备方法，其特征是利用库拉索芦荟原汁与婴儿双歧杆菌ATCC15697共发酵，通过设定不同的温度梯度和PH梯度，经活菌计数后，确定其最佳发酵条件。并通过对其抗氧化性指标的测定，如DPPH自由基清除能力的测定、铁离子螯合能力的测定和总还原力的测定等，初步确定了该芦荟益生菌发酵液的抗氧化能力，并进行评价，以实现芦荟洗液和芦荟饮品的研制。
【专利说明】—种婴儿双歧杆菌ATCC 15697与芦荟共发酵饮料的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明主要涉及婴儿双歧杆菌ATCC 15697与芦荟原汁共发酵条件的摸索，并对发酵液的抗氧化能力进行了测定和评价，主要用于今后相关芦荟洗液和芦荟饮品的研制，具体涉及一种婴儿双歧杆菌ATCC 15697与芦荟共发酵饮料的制备方法。
【背景技术】
[0002]芦荟属百合科草本植物，芦荟凝胶中含有丰富的多糖、蛋白质、氨基酸、维生素、活性酶及对人体十分有益的微量元素。它具有多重功效，美白、保湿、控油、除痘等作用。并且芦荟提取液常添加在食品、药品、牙膏及化妆品中，不仅具有抗细菌、防止皮肤干裂或油脂分泌多、对治疗雀斑、青春痘和防止脱发、去头屑、消炎、愈合伤口、免疫、抗肿瘤都有极好的疗效。
[0003]益生菌是指一类对人和动物有益的细菌，指投入后通过改善宿主肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，提高宿主健康水平和使宿主健康达到最佳状态的活菌制剂及其代谢产物，各种食品中更是添加多种益生菌，增强食品营养价值。
[0004]婴儿双歧杆菌是肠道内的一种益生菌，所有人体内都有，但随着年龄的增长会原来越少。但是其具有营养、免疫及抗感染的功能，并且还具有抗过敏、抗肿瘤、调整肠道功能及改善营养的作用等。在临床上，双歧杆菌具有调整肠道功能紊乱作用；可以预防腹泻，减少便秘，即双向调节。
[0005]本实验，采用婴儿双歧杆菌ATCC 15697与芦荟原汁进行共发酵，研究了发酵液的抗氧化能力，并进行了评价。
【发明内容】
[0006]本发明主要用于芦荟洗液和芦荟饮品的研制，对研制前期的芦荟发酵液最佳条件进行探索，并进行抗氧化性的测定，评价芦荟发酵液产品研制过程中具有的优势。
[0007]本发明所述制备方法包括下列步骤:
1、芦荟的选择和制备:采选新鲜、饱满、肉质肥厚的芦荟叶片，剔除带有病斑、软腐的叶片，叶片均重30(T400 g;叶片采用75%酒精进行表面消毒，去除芦荟叶表面皮层，采用榨汁机榨汁，分装后，6000 rpm/min离心10 min，再次分装，制成芦荟原汁，所述芦荟为库拉索芦荟；
2、采用巴氏消毒法将芦荟原汁灭菌，55°C处理30 min, 4 1:保存备用；
3、婴儿双歧杆菌ATCC15697的活化:
A从-80 1:冰箱取出婴儿双歧杆菌ATCC 15697，按培养基体积的5%接种于5 mL MRS培养基中，于37 温培养箱中培养过夜；
B取过夜培养的婴儿双歧杆菌ATCC 15697，按培养基体积的5%接种5 mL MRS培养基中，二次活化； 4、最佳发酵条件的确定
A、设定发酵温度梯度分别为25°C、30 °C、37 °C、42 °C，在上述不同的发酵温度条件下取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，婴儿双歧杆菌ATCC15697接种量为芦荟原汁体积的5%，发酵20 h，得到不同温度条件下的芦荟发酵液；
B、取芦荟发酵液，加生理盐水按11?16比例稀释，取50μ L涂板，过夜培养，进行活菌计数，确定最佳发酵温度；
C、在最佳发酵温度的条件下，设定芦荟原汁PH梯度为3、4、5、6、7、8、9，在上述不同的PH条件下取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，婴儿双歧杆菌ATCC 15697接种量为芦荟原汁体积的5%，发酵20 h，采用PH计调节PH ；
D、取上述各芦荟发酵液，加生理盐水按11?16比例稀释，取50μ L涂板，过夜培养，进行活菌计数，确定最佳发酵ΡΗ。
[0008]5、在最佳发酵温度和PH条件下发酵培养:在步骤4确定最佳PH和最佳温度后,取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，接种芦荟原汁5%的婴儿双歧杆菌ATCC 15697，发酵48 h，10000rpm/min离心10 min，重新分装，获得婴儿双歧杆菌ATCC15697芦荟发酵液，4 1:保存备用；
6、芦荟发酵液抗氧化性指标的测定和后期评价
A、DPPH自由基清除能力的测定
取2ml芦荟发酵液，加入2ml DPPH乙醇溶液，黑暗下室温反应30min，然后用等体积的三氯甲烷抽提，取上清517nm测0D，对照为去离子水加DPPH溶液；
B、羟基自由基清除能力的测定
取2 mmol/L的硫酸亚铁溶液I mL, 6 mmol/L过氧化氢I mL, 6 mmol/L水杨酸I mL,并加入芦荟发酵液I mL，静置30 min，以蒸馏水为参比，在510 nm处测定吸光度，计算羟自由基的清除率；
C、3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖
a标准曲线的制作:取8支15 mmX 180 mm试管,分别编号为O至7,向其中依次加入
0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.4、1.6、2.0 mL的I mg/mL的葡萄糖标准溶液,然后用蒸懼水定容到2 mL再依次加入1.5 mL水杨酸，水浴5 min，取出立即冷却到室温，加21.5 mL蒸馏水，摇匀，在540 nm处测定吸光度；
b样品中还原糖含量的测定:以标准曲线制作中O号为对照，先将样品稀释20倍，向15mmX 180 mm试管中加入I mL稀释后样品溶液，1 mL蒸懼水和1.5 mL水杨酸,水浴5 min,取出立即冷却到室温，加21.5 mL蒸馏水，摇匀，在540 nm处测定吸光度；
D、对Fe2+的螯合能力的测定
取0.5 mL芦荟发酵液中加入0.4%的FeS04溶液0.1 mL混合均匀后，再加入0.1 mL1%的抗坏血酸溶液和0.2 mol/L氢氧化钠溶液I mL，37°C下反应20 min，然后用10%的三氯乙酸去除蛋白6000 rpm, 10 min,4°C,取0.4 mL上清并加入4 mL 0.1%邻二氮菲，室温反应10 min，测定536 nm处吸光度。
[0009]E、总还原力的测定
取I mL的样品,加入I mL的磷酸缓冲液(P H=6.6和1%铁氰化钾溶液I mL,混勻，在50°C下保温20 min,加入10 %的三氯乙酸溶液I mL，振荡混匀后取I mL的混合液，加入4 mL去离子水和0.1 %的三氯化铁溶液0.4 mL，静置10 min，用去离子水为空白，在700 nm下进行比色，吸光度的值越大，说明还原力越强。
[0010]7、芦荟发酵液后期评价
针对步骤6中的抗氧化性指标测定结果，对该芦荟发酵液上清进行抗氧化能力的评价。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1不同温度活菌计数结果；
图2不同PH活菌计数结果；
图3抗氧化性指标测定结果；
图4还原糖测定标准曲线。
[0012]本发明的有益效果:本发明所制备的发酵饮料，安全无毒，将芦荟本身原有的保健功能和婴儿双歧杆菌ATCC 15697的益生效果完美结合在一起，具有美容、调节肠道菌群平衡、促进肠道蠕动等功效，有益于人体健康。
【具体实施方式】
[0013]实施例1:
一种婴儿双歧杆菌ATCC 15697与芦荟共发酵饮料的制备方法:
1、芦荟的选择和制备:采选新鲜、饱满、肉质肥厚的芦荟叶片，剔除带有病斑、软腐的叶片，叶片均重30(T400 g;叶片采用75%酒精进行表面消毒，去除芦荟叶表面皮层，采用榨汁机榨汁，分装后，6000 rpm/min离心10 min，再次分装，制成芦荟原汁，所述芦荟为库拉索芦荟；
2、采用巴氏消毒法将芦荟原汁灭菌，55°C处理30 min, 4 1:保存备用；
3、婴儿双歧杆菌ATCC15697的活化:
A从-80 1:冰箱取出婴儿双歧杆菌ATCC 15697，按培养基体积的5%接种于5 mL MRS培养基中，于37 温培养箱中培养过夜；
B取过夜培养的婴儿双歧杆菌ATCC 15697，按培养基体积的5%接种5 mL MRS培养基中，二次活化；
4、最佳发酵条件的确定
A、设定发酵温度梯度分别为25°C、30 °C、37 °C、42 °C，在上述不同的发酵温度条件下取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，婴儿双歧杆菌ATCC15697接种量为芦荟原汁体积的5%，发酵20 h，得到不同温度条件下的芦荟发酵液；
B、取芦荟发酵液，加生理盐水按11?16比例稀释，取50μ L涂板，过夜培养，进行活菌计数，确定最佳发酵温度；
C、在最佳发酵温度的条件下，设定芦荟原汁PH梯度为3、4、5、6、7、8、9，在上述不同的PH条件下取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，婴儿双歧杆菌ATCC 15697接种量为芦荟原汁体积的5%，发酵20 h，采用PH计调节PH ；
D、取上述各芦荟发酵液，加生理盐水按11?16比例稀释，取50μ L涂板，过夜培养，进行活菌计数，确定最佳发酵ΡΗ。
[0014]5、在最佳发酵温度和PH条件下发酵培养:在步骤4确定最佳PH和最佳温度后，取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，接种芦荟原汁5%的婴儿双歧杆菌ATCC 15697，发酵48 h，10000 rpm/min离心10 min，重新分装，获得婴儿双歧杆菌ATCC 15697芦荟发酵液，4 °C保存备用。
[0015]实施例2:抗氧化指标的测定及评价
1、相关试剂配制:0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液:0.007886 g DPPH溶于100 mL乙醇，避光配制，现配现用；150 mmol/L pH 8.0 Tris-Hcl:2.364 g Tris-HCl 溶于 100 mL 蒸懼水中；1.2 mmol/L邻苯三酚:0.01513 g邻苯三酚10 mM HCl，加蒸馏水定容至100 mL，避光保存；0.4% FeS04: FeS04*7H20:0.7315 g溶于100 mL蒸馏水中，避光保存；1%抗坏血酸:抗坏血酸I g溶解于100 mL蒸馏水中，避光保存；0.2 mol/L氢氧化钠:NaOH 0.8 g溶解于100 mL蒸馏水中；10%三氯乙酸:三氯乙酸10 g溶于100 mL蒸馏水中；0.1%邻二氮菲:邻二氮菲0.1 g溶解于100 mL蒸馏水中；磷酸缓冲液P H=6.6:1M磷酸盐缓冲液配制；
0.1%三氯化铁:FeC13 0.1g溶解于100 mL蒸馏水中。
[0016]2、确定最佳PH和温度后，发酵48 h, 10000 rpm/min离心10 min,重新分装,获的婴儿双歧杆菌ATCC 15697芦荟发酵液，4 °C保存备用。
[0017]3、抗氧化指标的测定 A、DPPH自由基清除能力的测定
取2ml芦荟发酵液，加入2ml DPPH乙醇溶液，黑暗下室温反应30min，然后用等体积的三氯甲烷抽提，取上清517nm测0D，对照为去离子水加DPPH溶液。
[0018]B、羟基自由基清除能力的测定
取2 mmol/L的硫酸亚铁溶液I mL, 6 mmol/L过氧化氢I mL, 6 mmol/L水杨酸I mL,并加入芦荟发酵液I mL，静置30 min，以蒸馏水为参比，在510 nm处测定吸光度，计算羟自由基的清除率。
[0019]C、3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖
a标准曲线的制作:取8支15 mmX 180 mm试管,分别编号为O至7,向其中依次加入
0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.4、1.6、2.0 mL的I mg/mL的葡萄糖标准溶液,然后用蒸懼水定容到2 mL再依次加入1.5 mL水杨酸，水浴5 min，取出立即冷却到室温，加21.5 mL蒸馏水，摇匀，在540 nm处测定吸光度。
[0020]b样品中还原糖含量的测定:以标准曲线制作中O号为对照，先将样品稀释20倍，向15 mmX 180 mm试管中加入I mL稀释后样品溶液，1 mL蒸懼水和1.5 mL水杨酸,水浴5 min，取出立即冷却到室温，加21.5 mL蒸馏水，摇匀，在540 nm处测定吸光度。
[0021]D、对Fe2+的螯合能力的测定
取0.5 mL芦荟发酵液中加入0.4%的FeS04溶液0.1 mL混合均匀后，再加入0.1 mL1%的抗坏血酸溶液和0.2 mol/L氢氧化钠溶液I mL，37°C下反应20 min，然后用10%的三氯乙酸去除蛋白6000 rpm, 10 min,4°C,取0.4 mL上清并加入4 mL 0.1%邻二氮菲，室温反应10 min，测定536 nm处吸光度。
[0022]E、总还原力的测定
取I mL的样品，加入I mL的磷酸缓冲液P H=6.6和1%铁氰化钾溶液I mL，混匀，在50°C下保温20 min,加入10 %的三氯乙酸溶液I mL，振荡混匀后取I mL的混合液，力口入4 mL去离子水和0.1 %的三氯化铁溶液0.4 mL，静置10 min，用去离子水为空白，在700 nm下进行比色，吸光度的值越大，说明还原力越强。
[0023]为评价婴儿双歧杆菌ATCC 15697能否在芦荟原汁中大量生长及评价其最适发酵温度和pH，我们对不同温度和pH芦荟原液中的嗜热链球菌ATCC 14485进行了计数，如图
1、2，结果表明，婴儿双歧杆菌ATCC 15697芦荟发酵液在发酵20 h后，当温度为37 °C，PH=7时，活菌计数结果细菌数量最多，基本达到18数量级。因此，我们将婴儿双歧杆菌ATCC15697芦荟发酵液发酵最佳条件设定为37 °C，PH=7。
[0024]为确保我们制备的芦荟发酵液具有良好的抗氧化性，我们对常见的几个抗氧化性指标进行了评价。如图3、4结果表明，在37 °C, PH=7的条件下发酵48 h, 10000 rpm/min10离心后，发酵液澄清透亮。DPPH自由基清除能力实验中，清除率达到32.26%，说明婴儿双歧杆菌ATCC 15697芦荟发酵液对自由基清除能力较弱；羟基自由基清除能力的测定实验，清除率为59.28%，说明婴儿双歧杆菌ATCC 15697芦荟发酵液针对羟基自由基清除能力较强J^Fe2+的螯合能力的测定中，螯合率为81.74%，说明婴儿双歧杆菌ATCC 15697芦荟发酵液对铁离子的螯合能力较强；总还原力的测定实验，数值为0.255，说明婴儿双歧杆菌ATCC 15697芦荟发酵液具有较强还原力；在还原糖测定实验中，根据标准曲线计算得出还原糖含量为32.38 mg/mL。
【权利要求】
1.一种婴儿双歧杆菌ATCC 15697与芦荟共发酵饮料的制备方法，其特征是: (1)芦荟的选择和制备:采选新鲜、饱满、肉质肥厚的芦荟叶片，剔除带有病斑、软腐的叶片，叶片均重30(T400 g;叶片采用75%酒精进行表面消毒，去除芦荟叶表面皮层，采用榨汁机榨汁，分装后，6000 rpm/min离心10 min,再次分装,制成芦荟原汁,所述芦荟为库拉索芦荟； (2)采用巴氏消毒法将芦荟原汁灭菌，55°C处理30 min, 4 1:保存备用； (3)婴儿双歧杆菌ATCC15697的活化: A从-80 1:冰箱取出婴儿双歧杆菌ATCC 15697，按培养基体积的5%接种于5 mL MRS培养基中，于37 温培养箱中培养过夜； B取过夜培养的婴儿双歧杆菌ATCC 15697，按培养基体积的5%接种5 mL MRS培养基中，二次活化； (4)最佳发酵条件的确定 A、设定发酵温度梯度分别为25°C、30 °C、37 °C、42 °C，在上述不同的发酵温度条件下取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，婴儿双歧杆菌ATCC15697接种量为芦荟原汁体积的5%，发酵20 h，得到不同温度条件下的芦荟发酵液； B、取芦荟发酵液，加生理盐水按11?16比例稀释，取50μ L涂板，过夜培养，进行活菌计数，确定最佳发酵温度； C、在最佳发酵温度的条件下，设定芦荟原汁PH梯度为3、4、5、6、7、8、9，在上述不同的PH条件下取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，婴儿双歧杆菌ATCC 15697接种量为芦荟原汁体积的5%，发酵20 h，采用PH计调节PH ； D、取上述各芦荟发酵液，加生理盐水按11?16比例稀释，取50μ L涂板，过夜培养，进行活菌计数，确定最佳发酵PH ； (5)在最佳发酵温度和PH条件下发酵培养:在步骤4确定最佳PH和最佳温度后，取5mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，接种芦荟原汁5%的婴儿双歧杆菌ATCC 15697，发酵48 h，10000rpm/min离心10 min，重新分装，获得婴儿双歧杆菌ATCC15697芦荟发酵液，4 °C保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种婴儿双歧杆菌ATCC15697与芦荟共发酵饮料的制备方法，其特征是:所述芦荟为库拉索芦荟。
【文档编号】A23L1/30GK104382162SQ201410607585
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】辛洪波, 王鑫, 陈廷涛 申请人:南昌大学