一种长双歧杆菌微胶囊及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种长双歧杆菌微胶囊及其制备方法，其芯材为长双歧杆菌BBMN68，壁材包括变性蛋白与多糖，将芯材与灭菌后的壁材混合，采用锐孔-凝固浴与真空冷冻干燥的方法，制备得到冻干长双歧杆菌微胶囊，微胶囊的含菌量为108-1011CFU/g。该微胶囊在室温条件下贮藏6个月后，双歧杆菌数量仍在108CFU/g以上；冻干微胶囊颗粒通过胃环境可以较多的活菌数到达肠道，并在肠道中将双歧杆菌大部分释放出来。本发明的双歧杆菌微胶囊为冻干形式，为双歧杆菌BBMN68提供了低温、真空及干燥的环境，很好的解决了其不耐酸、不耐氧及不易存活等缺点，并具有较长的保质期，良好的贮存稳定性和肠溶性的优点。
【专利说明】 一种长双歧杆菌微胶囊及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微胶囊产品，具体涉及一种长双歧杆菌BBMN68微胶囊及其制备方法。
【背景技术】
[0002]双歧杆菌属于放线菌科双歧杆菌属，当前人源双歧杆菌应用于生产的菌种包括两歧双歧杆菌(B.bifidum)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、婴儿双歧杆菌(B.1nfantis)、长双歧杆菌(B.1ongum)和短双歧杆菌(B.breve)。双歧杆菌无芽胞,个体大小为0.5?1.3 μ mX 1.5?8 μ m，典型形态为末端分叉的杆状。其菌落颜色为奶油色至白色，形状凸圆，质地柔软有弹性，表面光滑，边缘完整。双歧杆菌专性厌氧，最适生长温度37?41°C，最低生长温度25?28°C，最高生长温度43?45°C，起始生长最适pH值6.5?7.0，pH值5.0以下或8.0以上不生长，酸性环境(pH <5.5)对菌体存活不利。
[0003]双歧杆菌作为一种典型的益生菌，研究已确认对人体有多项生理保健功能，如改善人体肠胃、营养作用、抗衰老、抗肿瘤作用及提高免疫力等。研究与实践表明，双歧杆菌是人和动物肠道中对机体有益的生理性细菌，其数量随年龄变化而呈动态变化趋势，并与人的健康长寿息息相关。由于环境污染、滥用抗生素、放化疗等原因，使人体肠道内双歧杆菌的数量下降，从而导致人体的健康状况下降。因此可以通过研究开发双歧杆菌制品，外源摄入双歧杆菌，来增加人体肠道中双歧杆菌的数量，从而提高人体的健康水平。
[0004]目前我国对双歧杆菌的研究还处于上升阶段，产品开发不多，目前主要是双歧杆菌酸奶。由于双歧杆菌对营养条件要求较高，对氧极为敏感，对低pH值的抵抗力差，活性保持较困难等特点使得双歧杆菌的实际应用受到一定的限制。尤其是长双歧杆菌BBMN68其耐酸、耐氧性极差，且要对人体产生有益作用，必须在通过胃环境后仍有大量的存活菌到达肠道并定植于肠粘膜上。但由于胃酸的杀菌作用，活菌数在此过程中会大幅度下降，瑞士和国际乳联标准化委员会规定产品中双歧杆菌的活菌数要大于106CFU/mL或g。因此必须对双歧杆菌进行进一步的保护，使其能够尽可能的存活到达肠道并发挥作用。
[0005]为此，本发明重点为提高双歧杆菌在生产应用及贮藏中的存活率。本发明采用微胶囊技术与冷冻干燥结合，制备了一种便于贮藏及应用的冻干肠溶性微胶囊。
[0006]微胶囊技术是利用天然或合成的高分子物质，将固体、液体、气体进行包埋的微型包装技术。即利用性能较稳定的天然或合成高分子物质作为壁材，将性能不稳定的芯材物质包埋、封存起来，保护芯材原有的性质，在一定条件下，壁材破裂或溶解，芯材即释放出来并发挥功能。本发明以蛋白质(乳清蛋白或明胶)及多糖(海藻酸钠、壳聚糖或阿拉伯胶)为微胶囊壁材对长双歧杆菌BBMN68进行包埋，并添加冷冻保护剂将菌体与外界不良环境隔开，并保证尽可能多的活菌到达肠道定植并发挥功效；通过冷冻干燥过程，微胶囊中水分快速蒸发掉使其保持较低的水分含量，便于储存及应用。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种冻干的长双歧杆菌微胶囊及其制备方法。
[0008]为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案:
[0009]一种长双歧杆菌微胶囊，该微胶囊的壁材包括变性蛋白与多糖，芯材为长双歧杆菌BBMN68 ;将芯材与灭菌后的壁材混合，采用锐孔-凝固浴与真空冷冻干燥的方法，得到长双歧杆菌微胶囊；其中，上述变性蛋白与多糖的质量比为1-5:1，微胶囊的含菌量为108-10nCFU/g。
[0010]长双歧杆菌BBMN68分离自巴马县长寿老人的粪便，保藏于中科院微生物所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC2265。
[0011]一种优选的长双歧杆菌微胶囊，其壁材还包括冻干保护剂，冻干保护剂、变性蛋白与多糖的质量比为12.5-25:1-5:1。冻干保护剂在冷冻干燥过程中可以有效的保护双歧杆菌的活性，以达到提高双歧杆菌活菌数量的效果。
[0012]上述变性蛋白为变性乳清蛋白或变性明胶，优选为变性的乳清蛋白；上述多糖为海藻酸钠、壳聚糖或阿拉伯胶，优选为海藻酸钠；上述冻干保护剂为甘油、海藻糖或脱脂奶粉，优选为甘油。
[0013]上述微胶囊为球形，其直径为0.5_5mm。
[0014]一种上述长双歧杆菌微胶囊的制备方法，包括如下步骤:
[0015](I)培养活化的长双歧杆菌，将发酵液离心，并用生理盐水洗涤菌体，得到长双歧杆菌湿菌体；
[0016](2)将蛋白溶液的pH调节至7.0-8.5，加热使其充分变性，然后将其与多糖溶液混合，灭菌，得到蛋白-多糖混合溶液；将氯化钙溶液的PH调节至6.0-8.5，灭菌；
[0017](3)在无菌条件下，将步骤(I)得到的湿菌体加入到步骤(2)得到的蛋白-多糖混合溶液中，混合均匀后将其滴加到氯化钙溶液中固化，无菌过滤、洗涤，得到湿润的微胶囊；
[0018](4)将步骤(3)得到的湿润的微胶囊冷冻干燥，得到长双歧杆菌微胶囊。
[0019]其中:
[0020]步骤(I)中的活化是指在36.5-37.5°C下，将冻存的长双歧杆菌在液体培养基中培养12h，并重复传代培养2-3次。其中，传代有两种接种方式:通过在平板上挑取形状良好的菌落或直接吸取长双歧杆菌的培养液至新的液体培养基。然后，在36.5-37.5°C温度下，将活化的长双歧杆菌在液体培养基中培养15h，通过离心收集菌体。
[0021 ] 上述液体培养基优选为MRS液体培养基。
[0022]步骤(2)中先将蛋白或多糖加入到去离子水中，搅拌均匀，为了确保完全溶解水合，通常选择在4°C静置过夜，使蛋白或多糖完全溶解，次日平衡至室温，得到蛋白或多糖溶液。其中，室温一般为15-30°C，优选为25°C ;在调节蛋白溶液的pH值时，优选使用lmol/L的 NaOH。
[0023]步骤⑵中蛋白溶液的浓度为2.0wt % -8.0wt % ;多糖溶液的浓度为
1.0wt% -10.0wt% ;氯化I丐溶液的浓度为 1.0wt% -5.0wt%。
[0024]一种优选的长双歧杆菌微胶囊的制备方法，步骤⑵中所述多糖溶液中还含有冻干保护剂，其中多糖与冻干保护剂的浓度分别为1.0wt % -10.0wt %和30.0wt % -50.0Wt%，该溶液通过将多糖溶解于冻干保护剂的水溶液中制备而得，如甘油溶液溶解多糖，得到最终同时含有甘油和多糖的溶液。
[0025]步骤(2)中所述加热的温度为60_90°C，时间为15_45min，通过热处理使蛋白完全变性。
[0026]在步骤(2)中，将变性后的蛋白溶液与多糖溶液混合，在100°C灭菌30min。
[0027]在步骤(2)中，优选使用lmol/L的HCl将氯化钙溶液的pH调节至7.0-8.5，然后在 121°C 灭菌 20min。
[0028]步骤(3)中固化的时间为15_60min。
[0029]步骤(3)中使用锐孔装置将菌体混悬液垂直滴加到氯化钙凝固浴中制成微液滴，固化后形成双歧杆菌微胶囊，该锐孔装置为滴管或注射器。
[0030]步骤(3)中的洗涤为使用生理盐水洗涤微胶囊。
[0031]上述生理盐水的浓度为0.9wt%。
[0032]步骤(4)中冷冻干燥的时间为24_48h。
[0033]本发明的有益效果如下:与常规技术相比，本发明中以变性蛋白与多糖作为壁材，通过热处理使蛋白变性，使其在保持原有的成膜性、乳化性和凝胶型的基础上，还具有以下特性:(1)变性后蛋白的肽链展开，水溶性增大；(2)常温下乳清蛋白或明胶的溶液黏度较低，而变形后蛋白的二级结构展开，分子内部的活性基团暴漏，黏度增大。(3)变性后的蛋白相互聚集但不形成凝胶，这些蛋白质聚集物可以作为冷凝胶三维网络结构的基本单位。
[0034]本发明微胶囊所包埋的长双歧杆菌BBMN68对于酸和氧气的耐受力特别低，更不易存活。本发明通过改善壁材的组成，在变性蛋白形成的结构中，加入复配多糖，可行成一个网络交联结构，而将活性菌种包埋于中，实现对活性物质的保护及缓释，同时采用真空冷冻干燥法，并加入冻干保护剂，提高双歧杆菌微胶囊真空冷冻干燥后细胞的存活率及贮存稳定性，使最终得到的冻干长双歧杆菌BBMN68微胶囊的保质期变长，常温保藏期可达50天以上，甚至可达6个月以上。本发明的长双歧杆菌微胶囊可直接食用亦可应用在其他食品中，经胃肠消化，微胶囊可在肠道将大部分菌体释放，达到补充益生菌的功效。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1为实施例1和2中长双歧杆菌微胶囊在酸奶中的活菌数变化曲线。
[0036]图2为实施例1和2中长双歧杆菌微胶囊在模拟胃液中的耐胃酸性检测曲线。
[0037]图3为实施例1和2中长双歧杆菌微胶囊在模拟肠液中的吸光度-时间曲线。
[0038]图4为实施例1和2中长双歧杆菌微胶囊在模拟肠液中的释放曲线。
[0039]图5为实施例1和2中长双歧杆菌微胶囊在室温条件下耐贮性测试曲线。
【具体实施方式】
[0040]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细的说明，但并不因此而限制本发明的保护范围。
[0041]下述实施例中使用的MRS液体培养基可以从商业途径购得。
[0042]下述实施例中的原料均为食品级，无毒副作用，食用具有安全性和营养价值。
[0043]实施例1以长双歧杆菌BBMN68为芯材，以海藻酸钠和乳清蛋白为壁材
[0044](I)菌株的制备:在超净工作台内，将0.1ml冻存的长双歧杆菌BBMN68的菌液接种到IOml MRS液体培养基中，使用厌氧管在恒温恒湿箱中于36.5-37.5°C温度下培养12h，重复传代2-3次，得到活化的长双歧杆菌。
[0045]将活化的长双歧杆菌按0.1 %的体积比接种到250ml MRS液体培养基中，置于恒温恒湿箱中，在36.5-37.5°C温度下培养15h，4500rpm离心15min收集菌体。然后用0.9%生理盐水洗涤菌体，在4500rpm下离心15min，重复洗涤2次后，得到泥状的长双歧杆菌湿菌体。
[0046](2)将乳清蛋白加入到去离子水中，使用磁力搅拌器，在室温(25°C左右)下搅拌2h，然后置于4°C环境中静置过夜，以确保乳清蛋白完全溶解水合，次日平衡至室温，用lmol/L NaOH调节其pH至8.0，得到8wt%的乳清蛋白溶液，80°C下水浴加热30min使其充分变性。
[0047]将海藻酸钠加入到去离子水中，室温下搅拌至均匀分散，于4°C环境中静置过夜，次日平衡至室温后，得到4wt%的海藻酸钠溶液。
[0048]将变性的乳清 蛋白溶液和多糖溶液混合，其中乳清蛋白与海藻酸钠的质量比为1:1，磁力搅拌使其混合均匀，在100°c沸水浴中灭菌30min，作为壁材待用。
[0049](3)配制3wt%的氯化钙溶液，用lmol/L HCl调节其pH值至6.0，121 °C灭菌20min，待用。
[0050](4)在超净工作台内，把离心得到的菌体加入到壁材中，小心搅拌使混合均匀，避免进入气泡。在磁力搅拌器的作用下，用2ml无菌注射器吸取上述混合液，垂直滴入氯化钙凝固浴中，即形成微胶囊颗粒。湿胶囊在氯化钙溶液中固化30min，用无菌筛过滤，用0.9%无菌生理盐水洗涤2-3次，得到湿润的微胶囊。
[0051](5)将湿润微胶囊在真空冷冻干燥机中冷冻干燥24_48h，得到冻干的长双歧杆菌微胶囊，其含菌量约为101(lCFU/g。
[0052]实施例2以长双歧杆菌BBMN68为芯材，以海藻酸钠、乳清蛋白和甘油为壁材
[0053]多糖溶液通过将多糖溶解在50wt%的甘油水溶液中制备而得，最终产品中甘油、海藻酸钠和乳清蛋白的质量比为12.5:1:1，其它具体制备方法同上述实施例1。
[0054]实施例3
[0055]具体制备方法同实施例2，但将海藻酸钠溶解于5(^丨％的甘油水溶液中，其中甘油与海藻酸钠的质量比为25:1，将其与8wt%的乳清蛋白混合，最终产品中甘油、乳清蛋白与壳聚糖的质量比为25:5:1。
[0056]实施例4
[0057]具体制备方法同实施例1，但将8?1:%乳清蛋白溶液的pH调节至7.0,并与3wt%的壳聚糖溶液混合得到蛋白-多糖混合溶液，其中乳清蛋白与壳聚糖的质量比为5:1，微胶囊的含菌量约为108cfu/g。
[0058]实施例5
[0059]具体制备方法同实施例1，但将4wt%的明胶溶液的pH调节至8.5,并与5?1:%的阿拉伯胶溶液混合得到蛋白-多糖混合溶液，其中明胶与阿拉伯胶的质量比为2:1，微胶囊的含菌量约为10ncfu/g。
[0060]此外，在其他【具体实施方式】中，壁材还可以是其他多糖(如壳聚糖、阿拉伯胶)、其他蛋白(如明胶)和其他冷冻干燥保护剂(如海藻糖、脱脂奶粉等)的复配，不局限于上述实施例中的列举。
[0061]实施例6长双歧杆菌微胶囊的性能评价
[0062]上述实施例制备得到的长双歧杆菌微胶囊按照以下方法进行评价:
[0063]1.长双歧杆菌微胶囊在酸奶中的应用
[0064]将上述实施例1、2得到的冻干双歧杆菌微胶囊加入酸奶中一定时间后，除去酸奶，并用0.9%生理盐水冲洗微胶囊，将微胶囊用解囊液解囊完全，稀释一定倍数，选择合适稀释度在MRS固体培养基中37°C培养48h，采用亨盖特计数法进行计数，再与加入酸奶中冻干微胶囊质量经过换算得到每克酸奶中双歧杆菌的数量，确定微胶囊在酸奶保质期中的贮存稳定性。其中，解囊液组成为0.lmol/L磷酸氢二钠，0.05mol/L柠檬酸，pH7.25。
[0065]经过测定，所述微胶囊在酸奶保质期内的活菌数变化曲线如图1所示。由图1可知，两种微胶囊在酸奶保质期(4°C，21天)中，活菌数均呈下降趋势，用含有甘油的壁材所制备的产品，在贮存21天后的活菌数比海藻酸钠-乳清蛋白壁材所制备的产品高了 0.8个数量级。而作为酸奶中具有营养价值的双歧杆菌活性添加成分，菌落数达到IO6每克或每毫升才能发挥其功效，即以海藻酸钠-乳清蛋白为壁材制备的双歧杆菌微胶囊在酸奶中的贮存天数为18天，而以海藻酸钠-乳清蛋白-甘油为壁材制备的双歧杆菌微胶囊在酸奶中的贮存天数为21天。
[0066]2.长双歧杆菌微胶囊的耐胃酸性检测
[0067]取实施例1、2中得到的冻干双歧杆菌微胶囊0.lg，加入5ml模拟胃液(pHl.2)中，置于37°C保温，在3h内每隔Ih取出，用灭菌生理盐水洗涤至中性，用解囊液溶解，测定双歧杆菌的活菌数，并与未包埋的冻干菌粉进行比较。
[0068]经过测定，所述微胶囊在模拟胃液中的存活情况如图2所示。由图2可知，随着处理时间的延长，菌体在模拟胃液中的存活数逐渐降低。经过模拟胃液处理3h后，未包埋菌体全部死亡，而两种冻干微胶囊活菌数量级分别为7.9和8.4，说明经过包埋的双歧杆菌微胶囊具有较好的耐胃酸能力，表明了对双歧杆菌进行微胶囊保护的必要性。
[0069]3.长双歧杆菌微胶囊的肠溶性检测
[0070]将实施例1、2中处理3h后的模拟胃液中滴加0.05mol/L的NaOH溶液调节pH为
7.4，加入5ml模拟肠液，于恒温振荡培养箱中在37°C的温度下，以150rpm的转速震荡溶解，在6h内每隔Ih取Iml肠液稀释计数并在600nm处测定肠液的吸光度。
[0071]经过测定，所述微胶囊在模拟肠液中的溶解情况如图3和图4所示。由图3可知，随着处理时间的延长，微胶囊在模拟肠液中处理I小时后，吸光值迅速上升，I?3小时略有上升，3小时后，吸光值基本稳定。从图4也可以看出，在模拟肠液中处理I小时后，肠液中双歧杆菌的数量迅速增长，已经达到IO6?107CFU/g，3小时后，肠液中的双歧杆菌数量趋于稳定，其结果与吸光值结果对应。说明该双歧杆菌微胶囊有着很好的肠溶性，能在肠道中快速崩解释放出双歧杆菌。
[0072]4.长双歧杆菌微胶囊的耐贮性测试
[0073]将实施例1、2中得到的冻干双歧杆菌微胶囊贮存在室温(25°C )条件下，定期取样，测定活菌数，并与未包埋的冻干菌粉进行比较。
[0074]经过测定，所述微胶囊在室温贮存条件下的情况如图5所示。由图5可知，将本发明提供的长双歧杆菌微胶囊在室温条件下贮藏，其中壁材中添加甘油制备的微胶囊贮存3个月后菌体存活数量级为8.8，仅下降了 1.6个数量级，可以满足实际应用中对双歧杆菌活菌数的要求；以海藻酸钠-乳清蛋白为壁材制备的微胶囊在贮存20天后活菌数量级下降到6以下；而未经包埋的双歧杆菌对照，存放5天后菌体活菌数量级已下降到6以下，I个月后，就检测不到活菌。由此可知，本发明的包埋方法有效地延长了本产品的货架期，尤其是在壁材中添加甘油之后，不仅使冻干后初始活菌含量增加，还增加了其贮存期。
[0075]以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行规定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
【权利要求】
1.一种长双歧杆菌微胶囊，其特征在于，该微胶囊的壁材包括变性蛋白与多糖，芯材为长双歧杆菌BBMN68 ;其中，所述变性蛋白与多糖的质量比为1-5:1，微胶囊的含菌量为108-10nCFU/g。
2.根据权利要求1所述的长双歧杆菌微胶囊，其特征在于，所述壁材还包括冻干保护齐U，冻干保护剂、变性蛋白与多糖的质量比为12.5-25:1-5:1。
3.根据权利要求1或2所述的长双歧杆菌微胶囊，其特征在于，所述变性蛋白为变性乳清蛋白或变性明胶；所述多糖为海藻酸钠、壳聚糖或阿拉伯胶；所述冻干保护剂为甘油、海藻糖或脱脂奶粉。
4.根据权利要求1或2所述的长双歧杆菌微胶囊，其特征在于，所述微胶囊为球形，其直径为0.5_5mm。
5.权利要求1-4任一项所述长双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，具体方法包括如下步骤: (1)培养活化的长双歧杆菌，将发酵液离心，并用生理盐水洗涤菌体，得到长双歧杆菌湿菌体； (2)将蛋白溶液的pH调节至7.0-8.5，加热使其充分变性，然后将其与多糖溶液混合，灭菌，得到蛋白-多糖混合溶液；将氯化钙溶液的PH调节至6.0-8.5，灭菌； (3)在无菌条件下，将步骤(I)得到的湿菌体加入到步骤(2)得到的蛋白-多糖混合溶液中，混合均匀后将其滴加到氯化钙溶液中固化，无菌过滤、洗涤，得到湿润的微胶囊； (4)将步骤(3)得到的湿润的微胶囊冷冻干燥，得到长双歧杆菌微胶囊。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述蛋白溶液的浓度为2.0wt% _8.0wt%，多糖溶液的浓度为1.0wt% -10.0wt%，氯化钙溶液的浓度为1.0wt % -5.0wt % ο
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述多糖溶液中还含有冻干保护剂，其中冻干保护剂与多糖的浓度分别为1.0wt % -10.0wt %和30.0wt % -50.0wt %。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述加热的温度为60-90°C，时间为 15-45min。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，将变性后的蛋白溶液与多糖溶液混合后，在100°c灭菌30min。
10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述固化的时间为15_60mino
【文档编号】A23L1/29GK103932186SQ201410162678
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月22日 优先权日:2014年4月22日
【发明者】冷小京, 刘云, 翟晓娜, 杨丽芳, 杜秉健, 刘飞, 张春月, 唐晓双, 马静 申请人:中国农业大学