专利名称：一种动物双歧杆菌及其应用方法
技术领域：
本发明涉及一种动物双歧杆菌及其应用方法。
背景技术：
双歧杆菌是人体肠道内典型的有益菌，是人类最早发现的生理性细菌，它的生长繁殖存在于人的生命之中，是一群能在健康人肠道内定植的益生菌。它的存在可降低人体内系统PH值，而使肠道菌群发生变化，抑制和杀灭病原菌，从而增强人体免疫抗病力，双歧杆菌在肠道内可合成多种维生素。润肠通便，降低胆固醇和甘油三脂，抑制癌细胞作用，抗衰老等作用。因此在科学上已确认人体内双歧杆菌数量和品质是人体健康的重要标准之
ο双歧杆菌的多种生理功能，可作为宿主氮的来源。双歧杆菌是一类专性厌氧菌，对氧的环境及营养要求高，用于制作发酵乳时产酸力低，凝乳间长，且属于异性发酵使产品风味欠佳。当菌体耐酸，耐胆盐能力不足时进不到肠道，就会失去它的作用。因此，要发挥这些益生作用，须首先能耐受人体胃肠的消化过程，能抵御胃液和胆汁对其杀灭的作用。Berrada等报导食物在胃中排空的时间是90min，胃内PH值为3. 0，最低可达1. 3，人体小肠胆汁液浓度在0. 03%-0. 3%之间。据目前相关报导，得到能够耐人体胆盐的双歧杆菌方法有三种一是从自然界(人体粪便)中筛选，二是从自然发酵食品中筛选，三是对现有菌种进行驯化。但现有双歧杆菌，由于菌株之间的差异较大，往往无法在具备耐酸、胆盐的功能下，能够长时间在室温下存活，同时还具备抑菌，能与乳酸菌复配等多种优点。
发明内容
本发明提供一种来源于发酵食品，对酸、胆盐、室温有较好的耐受性，对大肠菌群有较强的抑制效果，与其他类型的乳酸菌有较好的协同生长作用，并且同乳酸菌复配效果较好，产品具有较佳风味的动物双歧杆菌，以及这种动物双歧杆菌的应用方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
这种动物双歧杆菌，它是动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobactrium animalis)B174，保藏号CGCC NO. 4182，保藏日期2010年9月16日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 所述动物双歧杆菌乳亚种B174对人体胃酸和胆盐有耐受性。 所述动物双歧杆菌乳亚种B174对室温有耐受性。所述动物双歧杆菌乳亚种B174对大肠杆菌菌群有抑制作用。所述动物双歧杆菌乳亚种B174与下列乳酸菌之一或一种以上复配，有协同生长作用；
Bflif (Lactobaci 1 Ius acidophius)；
德氏乳杆菌保加利亚种(Lactobacillus delbrueckii)；zFM^Lff IifMft (LactobaciIlus casei subsp. Casei)； 嗜热链球菌(Streptococcus thermophius)； 乳酸链球菌(L. Iactis)； 乳酸链球菌亚种(L. Iactis subsp. Iactis )； 植物乳杆菌(L. plantarum)。所述动物双歧杆菌乳亚种B174与乳酸菌的最佳复配组合为动物双歧杆菌乳亚种B174+嗜热链球菌+嗜酸乳杆菌，或是动物双歧杆菌乳亚种B174+嗜热链球菌+保加利亚乳杆菌。这种动物双歧杆菌的应用方法，所述动物双歧杆菌乳亚种B174在制备发酵酸奶、 动物饲料添加剂以及抑菌液中的应用。
这种动物双歧杆菌发酵酸奶的制备方法，分别将乳酸菌与权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种B174接种到灭菌脱脂乳培养基中，37°C恒温培养，至凝乳出发酵，活化2 3 代，组配后接种至灭菌鲜奶中，42°C发酵，凝乳后至于冰箱内保存。这种动物双歧杆菌抑菌液的制备方法，将置于低温冰柜的动物双歧杆菌乳亚种 B174放到40 50°C水浴中解冻活化，在无菌条件下接种到MRS液体培养基中，37°C恒温培养12 14h，活化2 3代；将活化好的动物双歧杆菌乳亚种B174发酵液采用低温离心的方法，制备发酵上清液，得到动物双歧杆菌抑菌液。这种动物双歧杆菌饲料添加剂的制备方法，将动物双歧杆菌乳亚种B174和其他益生菌组配，各益生菌之间的比例为动物双歧杆菌乳亚种B174:嗜酸乳酸杆菌乳酸链球菌=(1 2): (2 3): (1 1.5)。本发明的有益效果如下
本发明针对人体肠胃的生理条件从自然发酵食品中选育一株可以耐受人体胃酸和胆盐浓度的动物双歧杆菌，经鉴定为双歧杆菌乳亚种。本发明的动物双歧杆菌可以在人体内定植，发挥益生作用。同时该菌株对大肠菌有较好的抑制作用，可起到调节肠道微生物菌群功能。另外，本发明的动物双歧杆菌乳亚种B174在室温下可存活30天，扩大了双歧杆菌的应用范围，延长了双歧杆菌产品的货架期，可降低生产成本。本发明的动物双歧杆菌乳亚种 B174与其他类型的乳酸菌有较好的协同生长作用，并且同乳酸菌复配效果较好，产品具有较佳风味。本发明的动物双歧杆菌乳亚种B174对人体肠胃环境有耐受性，在模拟胃液 PH=2. 0条件下存活2小时，活菌数从2. 52 X IO8 cfu/ml,下降到3. 06X 106/ml，不到两个数量级。且在PH=L 3条件下，2个小时后仍有活菌存在。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种B174对胆盐有耐受性。在模拟肠液胆盐浓度0. 2%的环境下存活24小时，活菌数呈增长趋势，从1. 5X107cfu/ml到9. 4X107cfu/mlo本发明的动物双歧杆菌乳亚种B174对室温有耐受性，在室温下存活30天，活菌数从4. 8X 109cfu/ml，仅下降到3X 108cfu/ml，仍有大量活菌存在。本发明的动物双歧杆菌乳亚种B174可应用于制备发酵酸奶、动物饲料添加剂以及抑菌液，也可广泛应用于其他食品及生物制品领域。
具体实施例方式
实施例，这种动物双歧杆菌，它是动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobactrium animal is)B174，保藏号CGCC NO. 4182，保藏日期2010年9月16日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。动物双歧杆菌乳亚种B174的分离及鉴定方法如下
1、分离方法
称取样品(自然发酵食品)5g至45ml无菌缓冲盐溶液中(加适量玻璃珠)作为母液， 震荡IOmin充分混勻，以无菌缓冲盐溶液做梯度稀释，选择三个合适的梯度，吸取0. Iml于 NPNL-BL培养基中进行滚管分离，每个稀释梯度做两个重复，厌氧管放入37°C培养箱中培养48 72小时，挑选光滑、凸园、边缘整齐、白色或乳白色菌落镜检。对疑似菌落按上述步骤在BL培养基中进行再此分离、纯化，直到菌落完全纯化。形态学鉴定革兰氏染色，细胞形态，有无芽孢
生理生化鉴定接触酶，氧化酶，果糖一6—磷酸盐磷酸铜酶，碳水化合物产酸分子生物学鉴定16SrDNA序列分析
2.实验结果
2. 1生理生化特性及形态特征表1 B174的生理生化特性
根据上述16SrDNA序列测定结果构建该菌株的系统发育树，鉴定结果B174为动物双歧杆菌乳亚种。3.鉴定结果
结合以上鉴定结果，本发明的动物双歧杆菌为动物双歧杆菌乳亚种。动物双歧杆菌乳亚种B174的耐酸、耐胆盐、耐温实验如下
1.实验方法
1.1胆盐耐受试验
动物双歧杆菌乳亚种B174用灭菌的改良MRS培养液37°C严格厌氧培养15h。将活化菌株培养液以10%接种量接入含不同胆盐浓度的无菌改良MRS液体培养基中(胆盐浓度为 0. 2%、0. 3%、0. 5%、1. 0%、1. 6%)，同时以不含胆盐的改良MRS培养液为对照。在37°C厌氧培养0、2、4、6、M小时后取样测定活菌数。2. 2酸耐受性试验
动物双歧杆菌B174用无菌改良MRS培养液37°C严格厌氧培养15h，将活化的培养液以 10%的接种量接入不同PH值的无菌改良MRS中(PH分别为1.3 ,2.0，3. 0)，同时以PH7. 0 的培养液为对照。37°C厌氧培养，分别于Omin 30min 60min 90min 120min.取样测定活菌。2. 3室温耐受性试验
动物双歧杆菌如亚种B174用无菌改良MRS培养液37°C培养15 h后转室温下放置，每隔两天测定一次培养液的活菌数，以0天的活菌数做对照。3.实验结果
3. 1耐胆盐实验结果
B174对不同胆盐浓度的耐受性见表2，胆盐浓度小于等于0. 3%时对其无抑制作用，6h 内活菌数不断增加，在0. 5%-1. 6%的胆盐浓度中生长具有一定的耐受性。表2 B174对胆盐的耐受性
权利要求
1.一种动物双歧杆菌，其特征在于它是动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobactrium amimalis Subsp Lactis)B174，保藏号CGCC NO. 4182，保藏日期2010 年 9 月 16 日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的动物双歧杆菌，其特征在于对人体胃酸和胆盐有耐受性。
3.根据权利要求1所述的动物双歧杆菌，其特征在于对室温有耐受性。
4.根据权利要求1所述的动物双歧杆菌，其特征在于对大肠杆菌菌群有抑制作用。
5.根据权利要求1所述的动物双歧杆菌，其特征在于与下列乳酸菌之一或一种以上复配，有协同生长作用；Bflif (Lactobaci 1 Ius acidophius)；德氏乳杆菌保加利亚种(Lactobacillus delbrueckii)； zFM^Lff liiMft (LactobaciIlus casei subsp. Casei)； 嗜热链球菌(Streptococcus thermophius)； 乳酸链球菌(L. lactis)； 乳酸链球菌亚种(L. lactis subsp. lactis )； 植物乳杆菌(L. plantarum)。
6.根据权利要求5所述的动物双歧杆菌，其特征在于所述动物双歧杆菌乳亚种B174 与乳酸菌的最佳复配组合为动物双歧杆菌乳亚种B174+嗜热链球菌+嗜酸乳杆菌，或是动物双歧杆菌乳亚种B174+嗜热链球菌+保加利亚乳杆菌。
7.—种如权利要求1 6所述任意一项的动物双歧杆菌的应用方法，其特征在于所述动物双歧杆菌乳亚种B174在制备发酵酸奶、动物饲料添加剂以及抑菌液中的应用。
8.一种动物双歧杆菌发酵酸奶的制备方法，其特征在于分别将乳酸菌与权利要求1 所述的动物双歧杆菌乳亚种B174接种到灭菌脱脂乳培养基中，37°C恒温培养，至凝乳出发酵，活化2 3代，组配后接种至灭菌鲜奶中，42°C发酵，凝乳后至于冰箱内保存。
9.一种动物双歧杆菌抑菌液的制备方法，其特征在于将置于低温冰柜的动物双歧杆菌乳亚种B174放到40 50°C水浴中解冻活化，在无菌条件下接种到MRS液体培养基中， 37°C恒温培养12 14h，活化2 3代；将活化好的动物双歧杆菌乳亚种B174发酵液采用低温离心的方法，制备发酵上清液，得到动物双歧杆菌抑菌液。
10.一种动物双歧杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于将动物双歧杆菌乳亚种 B174和其他益生菌组配，各益生菌之间的比例为动物双歧杆菌乳亚种B174:嗜酸乳酸杆菌乳酸链球菌=(1 2) (2 3) (1 1. 5)。所述动物双歧杆菌乳亚种B174 所述动物双歧杆菌乳亚种B174 所述动物双歧杆菌乳亚种B174 所述动物双歧杆菌乳亚种B17全文摘要
一种动物双歧杆菌及其应用方法，它是动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobactrium amimalis Subsp Lactis)B174，保藏号CGMCC NO.4182，保藏日期2010年9月16日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。动物双歧杆菌乳亚种B174可以在人体内定植，对人体胃酸和胆盐有耐受性。同时该菌株对大肠菌有较好的抑制作用，可在室温下可存活30天。该菌株与其他类型的乳酸菌有较好的协同生长作用，并且同乳酸菌复配效果较好，产品具有较佳风味，可应用于制备发酵酸奶、动物饲料添加剂以及抑菌液，也可广泛应用于其他食品及生物制品领域。
文档编号C12N1/20GK102191192SQ20101059868
公开日2011年9月21日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者刘英华, 姜波, 王玉文, 苏桂 申请人:北京博锦元生物科技有限公司