一种具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌及筛选方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物技术领域，尤其是一种具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌及用途。
【背景技术】
[0002]双歧杆菌作为重要的肠道益生菌，其在抑制肠道有害菌的生长繁殖、抵抗病原茵的感染方面发挥着重要作用，双歧杆菌能够产生醋酸、丙酸、丁酸和乳酸等有机酸刺激肠道蠕动，促进排便，防止便秘。双歧杆菌还能够刺激人体免疫系统，从而提高抗病能力、延缓衰老等。然而，双歧杆菌如果能够发挥上述作用，必须能够在人体内长期存在，即定殖。研究发现，部分双歧杆菌具有肠道定殖的能力。比如，S.Fujiwara等发现具有链霉素和利福平抗性的长双歧杆菌SBT2929能够在人体内长期定殖并且影响肠道微生物的组成和代谢；Nathan P.McNulty 等发现，Bifidobacterium animal is subsp.1actis 能够在摄入高糖騰食的无菌鼠体内定殖28天以上。
[0003]检测双歧杆菌能否在肠道内定殖的方法主要有三种:一是利用双歧杆菌的选择培养基将粪便梯度稀释后平板涂布进行菌落计数；二是利用API 50CHL的试剂盒结合末端转录PCR进行粪便中双歧杆菌的鉴定；三是利用DGGE (变性梯度凝胶电泳)的方法，提取粪便的宏基因组然后扩增菌的16S V3区，与目标双歧杆菌进行条带比对确定双歧杆菌能否在肠道内定殖。平板计数的方法，存在比较明显的缺陷:由于部分双歧杆菌存在比较苛刻的生存条件，所以不能够在培养基上进行培养，因此即使是能够在肠道内定殖的双歧杆菌用此方法鉴定也可能出现假阴性的结果；并且，选择培养基不能够将不同种的双歧杆菌很好地区分开来。试剂盒的方法较为新颖，弥补了选择培养基存在的不足，可以较好地进行双歧杆菌定殖能力的考量。同时，PCR-DGGE的方法由于技术相对比较成熟，且操作简便，能够很好地区分不同种的双歧杆菌，且从条带的亮度上可以大致地看出双歧杆菌在肠道内的定殖能力强弱。
[0004]人体肠道中双歧杆菌的数量随年龄的增长比例在减少，肠道微生物种类和比例的失衡会带来许多的健康问题，诸如便秘、腹泻、免疫力低下等，因此需要采取措施使肠道中的双歧杆菌增殖。使肠道中双歧杆菌增加的办法有两种:一是口服含双歧杆菌的饮品或生物制剂；二是补充双歧因子(如低聚糖等)促进人体固有双歧杆菌的繁殖。鉴于WHO对低聚糖，如低聚木糖、低聚果糖等的推荐摄入量，实验表明其对双歧杆菌的增殖存在一定的局限性且效果不太明显，因此补充双歧因子的方法作用不大。口服含双歧杆菌的饮品或者生物制剂，只要双歧杆菌能够克服肠道的不利环境，就能在肠道内直接地发挥作用。所以，筛选出能够在肠道内定殖的双歧杆菌并且做成相关产品，具有巨大的应用及商业价值。
[0005]通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种具有耐酸、耐胆盐特性，细胞实验表明其能很好地粘附结肠癌细胞HT-29，动物实验表明其能在小鼠体内定殖10天甚至更长的一段时间，其在肠道定殖能力方面的优良特性，具有巨大的应用及商业价值的具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌及用途，该长双歧杆菌能够应用于生产双歧杆菌菌粉、酸奶和双歧杆菌益生菌巧克力中。
[0007]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
[0008]—种具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌，名称为CCFM 729，分类名称为Bifidobacterium longum，保藏编号为:CGMCC N0.10932，保藏日期:2015 年 05 月 28 日，保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0009]而且，所述长双歧杆菌具有如下性质:
[0010]⑴具有耐酸性，在ρΗ3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH 2.5环境下存活良好；
[0011]⑵能够耐胆盐，在0.3%胆盐存在的条件下存活良好；
[0012]⑶具有粘附性，能够较好地粘附在结肠癌细胞HT-29上；
[0013]⑷能够在小鼠体内定殖10天以上的时间。
[0014]—种如上所述的具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌的筛选方法，步骤如下:
[0015]⑴收集若干份出生一周龄的婴儿粪便，将粪便样品在含有低聚果糖的MRS+0.5% -1% (质量百分数)半胱氨酸培养基中富集12h ;
[0016]⑵梯度稀释涂布于添加0.02% (质量百分数)溴甲酚紫的MRS+0.5%。_1%。(质量百分数)半胱氨酸的固体平板上，培养24-48h;
[0017]⑶挑取变色圈明显的单菌落，反复划线得到纯化的单菌落；
[0018]⑷将纯化的单菌落液体培养24h后，进行果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的测定，快速鉴定其是否为双歧杆菌；
[0019](5)选取F6PPK阳性的菌，提取其16S rDNA进行测序；
[0020](6)选取测序结果鉴定为双歧杆菌的乳酸菌进行耐酸、耐胆盐以及粘附试验；
[0021](7)选取耐酸、耐胆盐以及粘附性能好的双歧杆菌进行肠道定殖能力试验，其中，耐酸:pH = 2?9，耐胆盐:胆盐0.3%、质量分数，粘附试验:对结肠癌细胞HT-29具有粘附能力；
[0022]⑶扩增出小鼠粪便菌群的16S V3区，变性梯度凝胶电泳检测小鼠粪便中的目标菌，筛选出肠道定殖能力优良的双歧杆菌，即得具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌。
[0023]而且，具体步骤如下:
[0024](一)乳酸菌的分离筛选
[0025]⑴收集若干份出生一周龄的婴儿粪便，将粪便样品在含有低聚果糖的MRS+0.5% -1% (质量百分数)半胱氨酸培养基中富集12h ;
[0026]⑵将粪便样品进行梯度稀释后涂布于添加了质量百分数为0.02%溴甲酚紫的MRS+0.5% _1%。半胱氨酸的固体平板上，培养24-48h ；
[0027]⑶选取变色圈明显，并且符合乳酸菌基本形态的单菌落进行平板划线纯化，筛选分离出乳酸菌；
[0028]⑷将上述单菌落于液体MRS+0.5%0 ~1%0 (质量百分数)半胱氨酸中培养24h后进行革兰氏染色，选取革兰氏阳性菌进行后续试验；
[0029]( 二 )双歧杆菌的初步鉴定:果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶测定法
[0030]⑴将步骤(一)所筛选得到的乳酸菌在液体MRS+0.5% -1% (质量百分数)半胱氨酸中培养24h，然后取ImL培养物8000rpm离心2min ；
[0031]⑵用含0.05% (质量百分数)半胱氨酸的pH = 6.5的0.05M KH2PO4溶液洗涤两次；
[0032]⑶重悬于200uL添加了 0.25% (质量百分数)Triton X-100的上述磷酸盐缓冲液；
[0033]⑷添加50uL浓度为6mg/mL氟化钠和10mg/mL碘乙酸钠的混合液以及50uL浓度为80mg/mL的果糖-6-磷酸，37°C孵育Ih ;
[0034](5)添加300uL浓度为0.139g/mL、pH为6.5的盐酸羟胺，并于室温放置1min ；
[0035](6)分别添加200uL 15% (质量百分数)的三氯乙酸和4M HCl ；
[0036](7)添加200uL含有5% (质量百分数)三氯化铁的0.1M HCl，若体系迅速变为红色，即为F6PPK阳性，可初步断定其为双歧杆菌；
[0037](三)双歧杆菌的分子生物学鉴定
[0038]⑴单菌的基因组抽提
[0039]A.将步骤(二)所筛选得到的乳酸菌培养过夜，取培养过夜的菌悬液ImL于1.5mL离心管，1000rpm离心2min，弃上清得菌体；
[0040]B.用ImL无菌水吹打洗菌体后，1000rpm离心2min，弃上清得菌体；
[0041]C.加入 200uL SDS 裂解液，80°C水浴 30min ；
[0042]D.加入酚-氯仿溶液200uL于菌体裂解液中，其中酚-氯仿溶液的组成成分及体积比为:Tris饱和酸:氯仿:异戊醇=25:24:1，颠倒混勾后，12000rpm离心5-lOmin，取上清 200uL ；
[0043]E.加入400uL冰乙醇或冰异丙醇于200uL上清中，_20°C静置lh，12000rpm离心5-10min,弃上清；
[0044]F.加入500uL 70% (体积百分数)冰乙醇重悬沉淀，12000rpm离心l_3min，弃上清;
[0045]G.60°C烘箱烘干，或者自然晾干；
[0046]H.50uL ddH20 重溶沉淀以备 PCR ；
[0047](2) 16S rDNA PCR
[0048]A.细菌 16S rDNA 50uL PCR 反应体系:
[0049]10 X Taq buffer, 5uL ;dNTP，5uL ;27F，0.5uL ;1492R，0.5uL ；Taq 酶，0.5uL ；
[0050]模板，0.f5uL ;ddH20，38uL。
[0051]B.PCR 条件:
[0052]95°C 5min ；95°C 1s ；55°C 30s ；72°C 30s ；step 2-430X ；72°C 5min ；12°C 2min ；
[0053](3)制备I %琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000 X loading buffer混合，上样量5uL，120V跑30min，然后进行凝胶成像；
[0054]⑷将16S rDNA的PCR产物进行测序分析，将得到的序列结果使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，选取测序结果鉴定为双歧杆菌的乳酸菌，-80°C保藏备用；
[0055](四)双歧杆菌的耐酸、耐胆盐检测
[0056]⑴取步骤(三)中-80°C保藏的双歧杆菌，在MRS+0.5% _1%。(质量百分数)半胱氨酸的固体平板划线一次，在厌氧工作站培养24-48h之后转接到MRS+0.5%。_1%。(质量百分数)半胱氨酸的液体试管当中，传代两次；
[0057]⑵以4%的接种量分别接种到pH = 7.0±0.2的MRS+0.5% _1%。(质量百分数)半胱氨酸的液体试管，其为空白对照组；pH = 2、pH = 2.5、pH = 3、pH = 4、pH = 5、pH =6、pH = 8、pH = 9的MRS+0.5% _1%。(质量百分数)半胱氨酸的液体试管，该几组为耐酸实验组；MRS+0.5%。_1%。(质量百分数)半胱氨酸+0.1%、0.2%、0.3%、0.4%牛胆盐的液体试管中，该几组为耐胆盐实验组；
[0058]⑶将接种于上述液体试管当中的菌悬液振荡混匀后，迅速将其以200uL/孔的量转移到96孔板上，每组做三个平行，每隔两个小时用酶标仪测定其OD6。。的值；
[0059]⑷在每一个时间点，将实验组数据与对照组数据进行比较，数据相差越小说明其耐受性能越好，比较菌的耐受性强弱；
[0060](5)因人体肠道内环境中胃酸的pH在2.5左右，分泌的胆盐含量为0.