一种黑曲霉及其在低聚异麦芽糖生产中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于发酵工程技术领域，特别涉及一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉 (，以及将它用于转化淀粉糖化液或麦芽糖衆制备低聚异麦芽糖的方 法。
【背景技术】
[0002] 低聚异麦芽糖（Isomaltooligosaccharides, ΙΜ0)，是目前应用最广泛、需求量最 大的低聚糖类功能性甜味剂，具有低热量、抗龋齿、促进机体肠道双歧杆菌增殖等特殊生理 功能，现已广泛应用于食品、医药及保健品、饲料等行业。它是由一系列聚合度为2-10的葡 聚糖组成的混合物，它们的分子中均至少带有1个α-(1，6)糖苷键，其中含量较多的成分 为异麦芽糖（18011^11：086，16)、潘糖（？311086，？）和异麦芽三糖（1801]^11：〇1：1'；[086，16 3)，这 三种组分称之为有效三糖，其含量高低是评价低聚异麦芽糖产品质量的主要指标，也是影 响产品应用范畴和市场价格的关键因素。
[0003] α -葡萄糖苷酶（a-glucosidase，EC 3. 2. L 20)是一种广泛存在于动、植物及微 生物体内的外切型糖苷酶。它能识别并水解糖类、糖脂、糖肽等糖类衍生物或糖类类似物 的非还原性端的α-(1，4)糖苷键，释放出D-葡萄糖；除了水解活力外，某些α-葡萄糖苷 酶还在不同程度上具备催化转苷反应的能力，能将游离的葡萄糖残基转移到其它的糖类物 质、糖类衍生物或糖类类似物受体底物上，形成新的糖类、糖脂或糖肽等。由黑曲霉等丝状 真菌产生的α-葡萄糖苷酶能够通过其自身的转苷活力催化发酵性的糊精及低聚麦芽糖 转化成非发酵性的低聚异麦芽糖，是目前低聚异麦芽糖工业生产中的关键酶。
[0004] 目前，低聚异麦芽糖工业化生产采用的工艺是先将淀粉原料经液化、糖化制成麦 芽糖浆后，再用α-葡萄糖苷酶进行转化制取。在这个过程中，来源于微生物菌种的α-葡 萄糖苷酶，其酶活力和转化效率的高低是决定低聚异麦芽糖生产工艺复杂度和生产成本的 关键因素。自然界中已发现多种微生物产生的α-葡萄糖苷酶能够用于制备低聚异麦芽 糖。国内人许多学者在α-葡萄糖苷酶高产菌株选育方面做了大量工作。如华南理工大学 的毕金峰等人通过测定对于麦芽糖的水解酶活的方法并结合产物的纸层析分析，从自然界 中筛选α-葡萄糖苷酶高产菌株并进行了诱变育种。如中国科学院的陈必成等人通过采用 层析法对α-葡萄糖苷酶反应产物进行定性定量的手段对α-葡萄糖苷酶产生菌进行筛选 及诱变育种；江南大学的柯雪琴等人从霉菌中筛选出产α-葡萄糖苷酶活力较高的菌株并 进行了产酶条件优化。
[0005] 上述研宄人员选育获得的菌株所产生的α -葡萄糖苷酶多为胞外酶，生产低聚异 麦芽糖的转化率较低，反应时间较长，产物中低聚异麦芽糖含量较低，只有50%左右，其中 有效三糖含量也仅为35%左右，称为頂0-500型产品。为获得纯度更高的低聚异麦芽糖产 品，需要在此基础上采用色谱分离等方法进行二次分离，将葡萄糖和麦芽糖从頂0-500糖 浆中去除，形成頂0-900型产品，其总低聚异麦芽糖含量为90%左右，其中有效三糖含量仍 仅为45%左右，仍无法满足高端市场的需求，此外色谱分离操作也导致生产工艺复杂化，生 产成本大幅提升。
【发明内容】
[0006] 鉴于上述菌种和生产技术的不足，本发明提供一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉 并利用其制备低聚异麦芽糖的方法，使用该方法生产的低聚异麦芽 糖的有效三糖含量为35~70%，适用性广，生产工艺简单，生产成本低，具有极大的应用潜 力。
[0007] 为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的： 本发明的黑曲霉，分类命名为黑曲霉（Asper价7ΛΛ5 /?i供ir) Μ1，保藏编号CCTCC NO: M2014421，保藏日期为2014年9月23日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址： 湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。
[0008] 黑曲霉（Ml菌株具有下述特性： 1.菌落形态学特征： 在PDA培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，自然pH)平板 上32°C培养，菌落初为白色、黄色，继而变为黑褐色、黑色；培养至48h，菌落直径达2. 5~ 3. 0cm。光学显微镜观察，分生孢子梗顶端膨大成球形顶囊，顶囊表面长满一层或两层的初 生小梗和次生小梗，分生孢子为球形，呈黑、黑褐色，平滑或粗糙。
[0009] 2.生理与生化特性： 菌株Ml可在28~37°C下快速生长，最适培养温度为33°C ;可在pH4. 0~6. 0范围生 长，最适pH为4. 5 ;培养基中不需要添加生长因子；可广泛利用有机碳氮源和无机碳氮源生 长，营养要求简单。
[0010] 3. ITS序列分析： 利用通用扩增引物 ITSl (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG C-3'）和 ITS4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'）对菌株ITS序列进行扩增测序，测得序列长度598 bp。将所得序 列提交至GenBank数据库，获得序列编号GenBank ID: KF879927,与GenBank所提供的基因 序列进行Blast比对分析，结果表明菌株Ml与黑曲霉dpergiBiAs 同源性为99%。 结合菌落形态特征、生理生化特性和ITS序列分析，可以将菌株Ml分类鉴定为黑曲霉，具体 为黑曲霉（Ml 〇
[0011] 本发明另外还提供了利用上述黑曲霉制备低聚异麦芽糖 的方法，将菌株黑曲霉（Ml接种于包含碳源、氮源、无机盐和水的无菌 培养基中进行培养，经离心或膜分离技术收集含α-葡萄糖苷酶的细胞，进而采用游离的 或经过固定化的含α-葡萄糖苷酶的细胞转化淀粉糖化液或麦芽糖浆生产低聚异麦芽糖。
[0012] 所述的培养基中各组分用量为：碳源20~80g/L，氮源10~50g/L，无机盐0~ 5g/L，其余为水。
[0013] 所述的培养基中，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、薯类淀粉或谷类淀粉中 的任意一种或其组合；薯类淀粉或谷类淀粉可以是木薯淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉、玉米 淀粉、小麦淀粉和大米淀粉中的任意一种或其组合；所述氮源为淀粉、麸皮浸汁、麦芽汁、豆 柏粉、花生麸、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、NH 4Cl、（NH4) #04和NaNO 3中的任意一种或其组 合；所述无机盐为钠盐、钾盐、磷酸氢盐和磷酸二氢盐中任意一种或其组合。
[0014] 所述黑曲霉/?i沢r) Ml的培养条件为：初始pH值4· 0~6· 0，培养 基装液量10~60%，接种量5~20%，搅拌速度100~600 rpm，培养温度28~37°C，培养 时间12~48h。
[0015] 所述膜分离技术收集含α-葡萄糖苷酶的细胞，所述膜分离技术为真空抽滤、板 框过滤或超滤中的任意一种。
[0016] 所述的含α-葡萄糖苷酶的细胞，其α-葡萄糖苷酶为胞内酶。
[0017] 所述的含α -葡萄糖苷酶的细胞转化淀粉糖化液或麦芽糖浆高效生产低聚异麦 芽糖的方法为：将游离细胞或固定化细胞置于反应器中，加入固形物质量百分含量10~ 40%的淀粉糖化液或麦芽糖浆，反应温度45~65°C，反应时间3~24h后制得低聚异麦芽 糖。
[0018] 所述的淀粉糖化液是利用薯类淀粉或谷类淀粉经过α -淀粉酶或真菌淀粉酶液 化，然后用β -糖化酶或真菌淀粉酶糖化制取。
[0019] 所述的麦芽糖浆为市售麦芽糖浆。
[0020] 所述的固定化细胞是采用海藻酸钙、壳聚糖或卡拉胶的任意一种或其组合作为固 定化载体，以戊二醛作为交联剂制备。
[0021] 利用含α -葡萄糖苷酶的细胞转化淀粉糖化液或麦芽糖浆制得的低聚异麦芽糖， 有效三糖：异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖，即IG+P+IG 3，含量为35~70%。
[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： 1.当前研宄人员选育获得的α-葡萄糖苷酶产生菌所产α-葡萄糖苷酶主要为胞外 酶，在转化麦芽糖浆制备低聚异麦芽糖时，需要对酶液进行浓缩、分离、纯化后方可使用