一种稻瘟病菌菌种的长期保存方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物学和植物保护学技术领域，具体涉及一种稻瘟病菌菌种的长期 保存方法。
【背景技术】
[0002] 由稻瘟病菌grisea Barr.引起的稻瘟病是水稻的主要病害之一， 每年由其造成的水稻损失可占水稻总产量的10%_30%，是阻碍水稻高产、稳产的关键因素之 一。而根据发病时期和稻瘟病菌侵染水稻的部位，可将水稻稻瘟病分为苗瘟、叶瘟、穗颈瘟 和谷粒瘟，其中以穗颈瘟对水稻产量和品质造成的影响最为严重。种植抗病品种是防治稻 瘟病最经济有效的措施，而抗病水稻品种单一大面积推广种植3-5年后容易丧失抗病性， 造成稻瘟病的爆发流行。一般认为抗病品种抗性的丧失主要原因是由于稻瘟病菌群体复 杂、易变异，其生理小种发生变化常导致新的生理小种的出现和积累。因此，鉴定和监测稻 瘟病菌群体生理小种组成类型和变化动态对抗病育种、主栽品种推广布局和抗病性变化都 有重要的意义，而稻瘟病菌保存是完成这一科研工作的基础。
[0003] 真菌菌种常用的保存方法有菌种定期移植培养保存法、矿物油保存法、冷冻干燥 保存法。其中，菌种定期移植保存法是将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌种长满 斜面后，棉塞部分用灭菌报纸包好，置于4°C冰箱中保存，其优点是操作简单，使用方便，能 避免螨类为害，并能随时检查保存菌种是否感染杂菌；但其缺点是菌种的生长和代谢并未 完全被抑制，菌种容易变异，且培养基成分会逐渐被菌种消耗，每隔6-8个月需要移植转代 一次，同时存在需要较大的存储空间、玻璃器皿容易破裂等问题。矿物油保存法是在生长好 的菌种斜面上加一层灭菌的石蜡油，石蜡油的量超过菌种斜面顶部lcm，可以置于室温或冰 箱保存，其优点是不需要特殊设备，菌种存活期较长，菌种在矿物油下生长虽然没有停止， 但受到明显抑制，培养基不容易干燥，无需经常移植，不易受到螨类为害；其缺点是需要的 存储空间大，玻璃器皿容易破裂，同时由于菌丝体外有矿物油，菌种恢复时生长缓慢且外观 带有粘性，使恢复菌种较为繁琐，一般需要再移植1-2次才能得到良好的菌种。冷冻干燥保 存法是将菌种孢子悬浮在保护剂中，再把小量孢子悬浮液在无菌条件下分盛在灭菌的安瓿 中，然后接上干燥器和抽气系统，将安瓿放在干冰和乙酸乙酯的混合冷冻液中，抽气使悬浮 液完全干燥，安瓿封口后置于室温或冰箱中保存，其优点是保存时间长，菌种不易变异；其 缺点是该方法不适用于不产生孢子只有菌丝体类型的真菌保存，且需要专门设备，费用较 尚。
【发明内容】
[0004] 针对上述问题，本发明的目的是提供一种稻瘟病菌菌种的长期保存方法，其操作 简单，不需要专门的设备，且保存的稻瘟病菌菌种性状稳定、不易变异、不需定期移植，并能 节约存储空间，避免螨类为害和菌种污染，对提高菌种保存的效率和质量有显著效果。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种稻瘟病菌菌种的长期保存方法，是用稻杆作为稻瘟病菌的保存载体对稻瘟病菌进 行保存；其具体包括如下步骤： 步骤1 :将培养基倒入培养皿平板中，待培养基凝固后快速将剪切好的稻杆均匀放置 于培养基上； 所述培养基为可溶性淀粉培养基，其成分为：可溶性淀粉10. 〇g，酵母膏2. Og，CaCO3 3. 0g，琼脂粉 16. 0g，蒸馏水 1000. 0ml，ρΗ6· 5 ; 步骤2 :用接种针挑取一块待保存的稻瘟病菌菌块，将其置于培养基中心无稻杆处，使 其菌丝面向下； 步骤3 :将培养皿平板放置于恒温培养箱中，25°C恒温培养至菌种长满培养皿； 步骤4 :用镊子将稻杆夹出放置于纸袋中； 步骤5 :用透明胶带将纸袋封口； 步骤6 :在纸袋上标注菌种信息及保存日期； 步骤7 :将纸袋置于烘箱中，30°C恒温烘干48h ; 步骤8:将烘干后的纸袋装入收纳盒，用透明胶带封口，并标注菌种信息，再将收纳盒 置于-80°C至4°C保存。
[0006] 步骤1所用培养皿平板的直径为90mm ;所述剪切好的稻杆长20mm ; 步骤2所取稻瘟病菌菌块的直径为5mm ; 步骤4所用纸袋的规格为138mm X 67mm ; 步骤5纸袋封口所用透明胶带的宽为20mm ; 步骤8收纳盒封口所用透明胶带的宽为50mm。
[0007] 上述步骤中，步骤1、步骤2、步骤4和步骤5均须在无菌操作台上进行无菌操作， 且操作中所用培养基、培养皿、稻杆、接种针、镊子、纸袋均需预先在121°C条件下灭菌处理 25min〇
[0008] 本发明的显著优点在于： (1) 水稻是稻瘟病菌的天然寄主，本发明以稻杆为保存载体对稻瘟病菌进行保存，不仅 可为稻瘟病菌的生长提供最适宜的载体，且在操作过程中，稻杆会吸取培养基凝固后的冷 却水及培养基中少量营养物质，从而为稻瘟病菌提供生长必需的营养物质，又可避免营养 过于优裕引起的稻瘟病菌菌种退化，使保存的稻瘟病菌菌种生长良好，且性状稳定； (2) 本发明保存方法操作方便快速，且一个培养皿可以放置约30根稻杆，有利于实现 稻瘟病菌的快速、大批量保存； (3) 按本发明进行保存，可使菌种保存周期延长，且保存周期内不用定期移植，节省了 保存成本； (4) 该保存方法不仅节省了保存空间，还便于菌种查找，且避免了使用玻璃器皿易碎易 破的缺点，安全可靠； (5) 按本发明保存的菌种活化方便，即将透明胶带撕开，夹出稻杆放在培养基上就可以 进行活化培养，而将纸袋再次封口放入冰箱仍可继续保存，同时可将一个菌种再分装多个 纸袋，每次使用一个纸袋，可有效避免多次活化菌种造成的污染。
【附图说明】
[0009] 图1为本发明移入菌种待保存的培养示意图，其中，1-稻杆，2-培养基，3-稻瘟病 囷囷块。
【具体实施方式】
[0010] 为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合【具体实施方式】对本发明所述的 技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[0011] 操作中所用培养基、培养皿、稻杆、接种针、镊子、纸袋均预先在121°C条件下灭菌 处理25min ;且所述步骤中步骤1、步骤2、步骤4和步骤5均须在无菌操作台上进行无菌操 作。
[0012] 实施例1 一种稻瘟病菌菌种的长期保存方法，具体包括如下步骤： 步骤1 :在超净工作台上将灭菌的可溶性淀粉培养基倒入灭菌的直径为90mm的培养皿 平板中，待培养基凝固后快速将剪切好的、长为20mm的灭菌稻杆均匀放置于培养基上