一种噬菌体的冻干保存方法
【专利摘要】本发明提供了一种噬菌体的冻干保存方法，将噬菌体液和噬菌体保存保护剂混合均匀，制备成噬菌体冻干粉，噬菌体冻干粉在无菌条件下密封于安瓿中保存。本发明所述的噬菌体的冻干保存方法，方法合理，应用方便，噬菌体可以在室温保存或者冷藏，对保存环境要求低，适应性好，并且可以长期保存。
【专利说明】
一种噬菌体的冻干保存方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术和微生物制品领域，具体地，涉及一种噬菌体的冻干保存方 法。
【背景技术】
[0002] 噬菌体是一类能感染细菌、放线菌、螺旋体等微生物的病毒的总称，对一些细菌具 有高度的专一性，当噬菌体侵染这些细菌时，可在细菌中繁殖并杀死细菌，而它对动植物没 有毒性。随着分子生物学技术的发展，噬菌体已经广泛用于疾病诊断、水处理等多个领域。 由于噬菌体可以将基因插入宿主DNA内的特性，使得它还成为了重要的分子和遗传学研究 工具。利用噬菌体，可以设计很多精巧的实验。
[0003] 然而在上述过程中，都需要对噬菌体进行保存，现有技术的保存方案中噬菌体的 保存效果差，噬菌体的保存时间短，存活率低，噬菌体容易被污染，并且必须在低温条件下 进行保存，严重制约了对噬菌体应用的发展。
【发明内容】
[0004] 发明目的：为了克服以上不足，本发明提供了一种噬菌体的冻干保存方法。
[0005] 技术方案:本发明提供了一种噬菌体的冻干保存方法，包括以下步骤：
[0006] 1)噬菌体溶液于2-7°C静置4-8h，出现絮状沉淀，经过8000-12000r/min离心20-40min；
[0007] 2)向上述沉淀中加入噬菌体缓冲液，将沉淀溶解，得噬菌体液；
[0008] 3)噬菌体液体积1-2.5倍的噬菌体保存保护剂混合均匀，所述噬菌体保存保护剂 所述氨基酸以重量组分计，包括以下组分:脱脂乳6-18份、硅藻土 0.3-0.8份、糖醇2-5份、 DEAE-葡聚糖0.8-1.5份、阿拉伯胶0.01-0.16份、牛血清白蛋白0.7-1.2份、麦芽糖糊精 0 · 05-0 · 3份、蜂蜜0 · 01-0 · 08份、棉子糖0 · 8-1 · 6份、磷酸铝0 · 03-0 · 06份、氯化钠0 · 01-0 · 04 份、硫酸镁〇. 3-0.7份、氯化钙0.6-1.2份、甘油1 -3份、阿拉西A 0.05-0.12份和水100份；
[0009] 4)预降温:将上述混合溶液冷冻降温至5°C，并保持30min;进一步以l°C/min的速 度降温到_5°C，并保持30min;再进一步以rC/min的速度降温到-30°C，并保持lh;
[0010] 一级干燥:将上述溶液于-30°C、80-150mT〇rr压强的真空条件下干燥12-18h;
[0011] 二级干燥：以0. rc/min的速度，加热上述溶液到25°C，再于上述真空条件下保持 4-8h后得噬菌体冻干粉；
[0012] 5)上述噬菌体冻干粉在无菌条件下密封于安瓿中保存。
[0013] 本发明所述的噬菌体的冻干保存方法，方法合理，应用方便，噬菌体原液中加入保 存保护剂，以冻干粉形式保存，由于冷冻干燥在低温下进行，因此噬菌体不会发生变性或失 去生物活力，物质中的一些挥发性成分损失很小，干燥在真空下进行，氧气极少，因此一些 易氧化的物质得到了保护，并且噬菌体能保持原来的性状，干燥后的冻干粉疏松多孔，呈海 绵状，加溶媒后噬菌体可以溶解迅速而完全，几乎立即恢复原来的性状。可以在室温保存或 者冷藏，对保存环境要求低，适应性好，可以长期保存。保存保护剂中脱脂乳、硅藻土、牛血 清白蛋白、麦芽糖糊精等形成整个保存保护剂的骨架，防止低分子物质的碳化和氧化，同时 保护活性物质不受温度影响，使保护剂形成多孔性、疏松的海绵状物且具有一定的含水量， 在冻存过程中保持原有的构架，从而增加溶解度。此外，多种糖类和盐使噬菌体保持存活状 态以及对水分起缓解作用，并且保持电解质浓度。噬菌体保存保护剂可以使噬菌体低温保 存下免受溶液损伤和冰晶损伤等物理因素的损伤，并且维持噬菌体极高的存活率和活性， 使噬菌体的活动处于半静止或静止状态。此外，保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作 用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，同时冷冻保护剂可以通过 在噬菌体内外维持一定的摩尔浓度，降低内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶 质的损伤。此外，保护剂还可以在室温条件下用于多种噬菌体的保存，适应性好。
[0014] 进一步的，上述的噬菌体的冻干保存方法，所述噬菌体保存保护剂以重量组分计， 还包括0.01-0.08份的防腐剂，所述防腐剂为尼泊金乙酯或苯甲酸钠或山梨酸钾。加入防腐 剂可以使整个新型噬菌体保存保护剂的使用时间更长，且可以有效防止污染，防腐剂的选 择多，适应性好。
[0015] 进一步的，上述的噬菌体的冻干保存方法，所述安瓿放入装有无水氯化钙或无水 甲醇或硅胶的密封容器中于室温或2-7°C保存。在干燥的条件下保存效果更佳，保存时间更 久。
[0016] 进一步的，上述的噬菌体的冻干保存方法，所述步骤在4-6%的湿度条件下完成。 4-6%的湿度条件下溶菌活性最佳，保存效果最好。
[0017] 进一步的，上述的噬菌体的冻干保存方法，所述噬菌体缓冲液以重量组分计，包括 以下组分:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐8-15份、氯化钠0.05-0.2份、氯化钾1-5份、硫酸镁5-20 份、磷酸氢二钾1-3份、磷酸二氢钠8-12份、明胶0.05-0.1份、水100份，并且调节pH到7-7.5。 噬菌体缓冲液组分合理，使用方便，可以用于噬菌体的溶解和重悬，并且不影响噬菌体的活 性。
[0018] 进一步的，上述的噬菌体的冻干保存方法，所述脱脂乳为5%蔗糖脱脂乳。作为一 种优选，选择5 %蔗糖脱脂乳，保存效果好。
[0019] 进一步的，上述的噬菌体的冻干保存方法，所述糖醇为木糖醇或山梨醇或麦芽糖 醇的一种。糖醇的原料来源广，适应性好。
[0020] 进一步的，上述的噬菌体的冻干保存方法，所述甘油为20 % -40 %的甘油。20 % -40 %的甘油流动性好，易于应用。
[0021] 进一步的，上述的噬菌体的冻干保存方法，所述的水为去离子水或纯化水。去离子 水或纯化水可以保证新型噬菌体保存保护剂质量稳定、可控。
[0022] 进一步的，上述的噬菌体的冻干保存方法的制备方法，使用稀盐酸和/或氢氧化钠 调节溶液pH。原料来源广，调节十分方便，并且应用成本低。
[0023] 有益效果:与现有技术相比，本发明具有以下优点:本发明所述的噬菌体的冻干保 存方法，方法合理，应用方便，噬菌体可以在室温保存或者冷藏，对保存环境要求低，适应性 好，并且可以长期保存。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明所述使用实施例1-4保存方法保存的噬菌体存活率图。
【具体实施方式】
[0025] 下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题， 并不是一种限制。
[0026] 实施例1
[0027] -种大肠杆菌噬菌体的冻干保存方法，在4%的湿度条件下完成，包括以下步骤：
[0028] 1)大肠杆菌噬菌体溶液于2°C静置4h，出现絮状沉淀，经过8000r/min离心40min;
[0029] 2)向上述沉淀中加入噬菌体缓冲液，将沉淀溶解，得噬菌体液;所述噬菌体缓冲液 以重量组分计，包括以下组分:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐8份、氯化钠0.05份、氯化钾1份、硫 酸镁5份、磷酸氢二钾1份、磷酸二氢钠8份、明胶0.05份和去离子水100份，并且使用稀盐酸 和/或氢氧化钠调节pH到7;
[0030] 3)噬菌体液等体积的噬菌体保存保护剂混合均匀，所述噬菌体保存保护剂所述氨 基酸以重量组分计，包括以下组分:5%蔗糖脱脂乳6份、硅藻土 0.3份、木糖醇2份、DEAE-葡 聚糖〇. 8份、阿拉伯胶0.01份、牛血清白蛋白0.7份、麦芽糖糊精0.05份、蜂蜜0.01份、棉子糖 〇. 8份、磷酸铝0.03份、氯化钠0.01份、硫酸镁0.3份、氯化钙0.6份、20 %甘油1份、阿拉西A 〇. 05份、防腐剂尼泊金乙酯0.01份和去离子水100份；
[0031] 4)预降温:将上述混合溶液冷冻降温至5°C，并保持30min;进一步以l°C/min的速 度降温到_5°C，并保持30min;再进一步以rC/min的速度降温到-30°C，并保持lh;
[0032] 一级干燥:将上述溶液于_30°C、80mT〇rr压强的真空条件下干燥12h;二级干燥：以 0. rC/min的速度，加热上述溶液到25°C，再于上述真空条件下保持4h后得噬菌体冻干粉；
[0033] 5)上述噬菌体冻干粉在无菌条件下密封于安瓿中保存，所述安瓿放入装有无水氯 化钙的密封容器中于2°C保存。
[0034] 实施例2
[0035] -种乳杆菌噬菌体的冻干保存方法，在6%的湿度条件下完成，包括以下步骤： [0036] 1)乳杆菌噬菌体溶液于7°C静置8h，出现絮状沉淀，经过12000r/min离心20min;
[0037] 2)向上述沉淀中加入噬菌体缓冲液，将沉淀溶解，得噬菌体液;所述噬菌体缓冲液 以重量组分计，包括以下组分:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐15份、氯化钠0.2份、氯化钾5份、硫 酸镁20份、磷酸氢二钾3份、磷酸二氢钠12份、明胶0.1份和纯化水100份，并且使用稀盐酸 和/或氢氧化钠调节pH到7.5;
[0038] 3)噬菌体液体积2.5倍的噬菌体保存保护剂混合均匀，所述噬菌体保存保护剂所 述氨基酸以重量组分计，包括以下组分：5%蔗糖脱脂乳18份、硅藻土0.8份、山梨醇5份、 DEAE-葡聚糖1.5份、阿拉伯胶0.16份、牛血清白蛋白1.2份、麦芽糖糊精0.3份、蜂蜜0.08份、 棉子糖1.6份、磷酸铝0.06份、氯化钠0.04份、硫酸镁0.7份、氯化钙1.2份、40%甘油3份、阿 拉西A 0.12份、防腐剂苯甲酸钠0.08份和纯化水100份；
[0039] 4)预降温:将上述混合溶液冷冻降温至5°C，并保持30min;进一步以l°C/min的速 度降温到_5°C，并保持30min;再进一步以rC/min的速度降温到-30°C，并保持lh;
[0040] -级干燥:将上述溶液于-30°C、150mT〇rr压强的真空条件下干燥18h;
[0041] 二级干燥：以0. l°C/min的速度，加热上述溶液到25°C，再于上述真空条件下保持 8h后得噬菌体冻干粉；
[0042] 5)上述噬菌体冻干粉在无菌条件下密封于安瓿中保存，所述安瓿放入装有无水甲 醇的密封容器中于7°C保存。
[0043] 实施例3
[0044] -种分歧杆菌噬菌体的冻干保存方法，在5%的湿度条件下完成，包括以下步骤：
[0045] 1)分歧杆菌噬菌体溶液于4°C静置6h，出现絮状沉淀，经过10000r/min离心30min;
[0046] 2)向上述沉淀中加入噬菌体缓冲液，将沉淀溶解，得噬菌体液;所述噬菌体缓冲液 以重量组分计，包括以下组分:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐12份、氯化钠0.1份、氯化钾3份、硫 酸镁15份、磷酸氢二钾2份、磷酸二氢钠10份、明胶0.08份和纯化水100份，并且使用稀盐酸 和/或氢氧化钠调节pH到7.2;
[0047] 3)噬菌体液体积2倍的噬菌体保存保护剂混合均匀，所述噬菌体保存保护剂所述 氨基酸以重量组分计，包括以下组分：5%蔗糖脱脂乳10份、硅藻土 0.6份、麦芽糖醇3份、 DEAE-葡聚糖1份、阿拉伯胶0. . 6份、牛血清白蛋白0.9份、麦芽糖糊精0.2份、蜂蜜0.05份、棉 子糖1.2份、磷酸铝0.4份、氯化钠0.02份、硫酸镁0.5份、氯化钙0.8份、30%甘油2份、阿拉西 A 0.08份、防腐剂山梨酸钾0.05份和纯化水100份；
[0048] 4)预降温:将上述混合溶液冷冻降温至5°C，并保持30min;进一步以l°C/min的速 度降温到_5°C，并保持30min;再进一步以rC/min的速度降温到-30°C，并保持lh;
[0049] -级干燥:将上述溶液于-30°C、120mT〇rr压强的真空条件下干燥14h;
[0050] 二级干燥：以0. TC/min的速度，加热上述溶液到25°C，再于上述真空条件下保持 6h后得噬菌体冻干粉；
[0051] 5)上述噬菌体冻干粉在无菌条件下密封于安瓿中保存，所述安瓿放入装有无水氯 化钙的密封容器中于4°C保存。
[0052] 实施例4
[0053] 一种副溶血弧菌噬菌体的冻干保存方法，在4%的湿度条件下完成，包括以下步 骤：
[0054] 1)副溶血弧菌噬菌体溶液于7°C静置4h，出现絮状沉淀，经过9000r/min离心 30min；
[0055] 2)向上述沉淀中加入噬菌体缓冲液，将沉淀溶解，得噬菌体液;所述噬菌体缓冲液 以重量组分计，包括以下组分:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐8份、氯化钠0.05份、氯化钾5份、硫 酸镁20份、磷酸氢二钾1份、磷酸二氢钠9份、明胶0.08份和去离子水100份，并且使用稀盐酸 和/或氢氧化钠调节pH到7;
[0056] 3)噬菌体液体积1.5倍的噬菌体保存保护剂混合均匀，所述噬菌体保存保护剂所 述氨基酸以重量组分计，包括以下组分：5%蔗糖脱脂乳6份、硅藻土 0.3份、木糖醇5份、 DEAE-葡聚糖1.5份、阿拉伯胶0.05份、牛血清白蛋白0.9份、麦芽糖糊精0.2份、蜂蜜0.05份、 棉子糖0.9份、磷酸铝0.03份、氯化钠0.01份、硫酸镁0.7份、氯化钙1.2份、25%甘油3份、阿 拉西A 0.08份、防腐剂山梨酸钾0.04份和去离子水100份；
[0057] 4)预降温:将上述混合溶液冷冻降温至5°C，并保持30min;进一步以l°C/min的速 度降温到_5°C，并保持30min;再进一步以rC/min的速度降温到-30°C，并保持lh;
[0058] 一级干燥:将上述溶液于_30°C、120mT〇rr压强的真空条件下干燥14h;
[0059] 二级干燥：以0.1°C/min的速度，加热上述溶液到25°C，再于上述真空条件下保持 6h后得噬菌体冻干粉；
[0060] 5)上述噬菌体冻干粉在无菌条件下密封于安瓿中保存，所述安瓿放入装有硅胶的 密封容器中于20 °C保存。
[0061] 对使用实施例1-4的噬菌体保护剂的保存1、3、6、9个月后的噬菌体污染情况以及 存活率分别进行考察，如表1所示，噬菌体均未污染，并且如图1所示，噬菌体在9个月内保持 60%以上的存活率。
[0062]表1噬菌体污染情况
[0063]
[0064] 以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 一种噬菌体的冻干保存方法，其特征在于:包括以下步骤： 1)噬菌体溶液于2-7°C静置4-8h，出现絮状沉淀，经过8000-12000r/min离心20-40min; 2 )向上述沉淀中加入噬菌体缓冲液，将沉淀溶解，得噬菌体液； 3) 噬菌体液体积1-2.5倍的噬菌体保存保护剂混合均匀，所述噬菌体保存保护剂所述 氨基酸以重量组分计，包括以下组分:脱脂乳6-18份、硅藻土 0.3-0.8份、糖醇2-5份、DEAE-葡聚糖0.8-1.5份、阿拉伯胶0.0卜0.16份、牛血清白蛋白0.7-1.2份、麦芽糖糊精0.Οδ?』 份、蜂蜜 0.01-0.08 份、棉子糖 0.8-1.6 份、磷酸铝 0.03-0.06 份、氯化钠 0.01-0.04 份、硫酸镁0.3-0.7份、氯化钙0.6-1.2份、甘油1-3份、阿拉西A 0.05-0.12份和水100 份； 4) 预降温:将上述混合溶液冷冻降温至5°C，并保持30min;进一步以TC/min的速度降 温到_5°C，并保持30min;再进一步以rC/min的速度降温到-30°C，并保持Ih; 一级干燥:将上述溶液于-30°(：、80-1501111'〇^压强的真空条件下干燥12-1811; 二级干燥：以0 . TC/min的速度，加热上述溶液到25°C，再于上述真空条件下保持4-8h 后得噬菌体冻干粉； 5) 上述噬菌体冻干粉在无菌条件下密封于安瓿中保存。2. 根据权利要求1所述的噬菌体的冻干保存方法，其特征在于:所述噬菌体保存保护剂 以重量组分计，还包括0.01-0.08份的防腐剂，所述防腐剂为尼泊金乙酯或苯甲酸钠或山梨 酸钾。3. 根据权利要求1所述的噬菌体的冻干保存方法，其特征在于:所述安瓿放入装有无水 氯化钙或无水甲醇或硅胶的密封容器中于室温或2-7°C保存。4. 根据权利要求1所述的噬菌体的冻干保存方法，其特征在于:所述步骤在4-6%的湿度 条件下完成。5. 根据权利要求1所述的噬菌体的冻干保存方法，其特征在于:所述噬菌体缓冲液以重 量组分计，包括以下组分:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐8-15份、氯化钠0.05-0.2份、氯化钾 1-5份、硫酸镁5-20份、磷酸氢二钾1-3份、磷酸二氢钠8-12份、明胶0.05-0.1份、水100 份，并且调节pH到7-7.5。6. 根据权利要求1所述的噬菌体的冻干保存方法，其特征在于:所述脱脂乳为5%蔗糖脱 脂乳。7. 根据权利要求1所述的噬菌体的冻干保存方法，其特征在于:所述糖醇为木糖醇或山 梨醇或麦芽糖醇的一种。8. 根据权利要求1所述的噬菌体的冻干保存方法，其特征在于:所述甘油为20%-40%的 甘油。9. 根据权利要求1或5所述的噬菌体的冻干保存方法，其特征在于:所述的水为去离子 水或纯化水。10. 根据权利要求5所述的噬菌体的冻干保存方法的制备方法，其特征在于:使用稀盐 酸和/或氢氧化钠调节溶液pH。
【文档编号】C12R1/92GK105950475SQ201610422048
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】许维素, 宋增福, 陈彪
【申请人】苏州埃瑞特生物技术有限公司