专利名称：：猪链球菌噬菌体穿孔素的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物材料
技术领域：
的制备方法，具体是一种能够裂解或增强裂解酶裂解猪链球菌的穿孔素(Holin)的制备方法。
背景技术：
：猪链球菌病是一种人兽共患传染病，能导致仔猪患脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎和人的脑膜炎。猪链球菌2型流行最广，对猪的致病力也最强，给养猪业造成巨大的经济损失，在公共卫生方面，对相关从业人员的生命安全构成严重威胁。对于猪链球菌病的治疗主要是抗生素治疗，然而，随着抗菌药物的广泛应用，耐药菌株的产生进一步加剧。穿孔素是由噬菌体基因组编码的一种疏水性的跨膜蛋白，在特定阶段插入胞质膜形成非特异性的孔洞或损伤，促使裂解酶能接近其作用靶位，有效调节裂解酶裂解细菌。噬菌体穿孔素与裂解酶配合使用，能大大提高裂解酶特异性攻击细菌的效率。所以，穿孔素作为新型抗菌药物具有一定的优势。本发明通过原核表达猪链球菌烈性噬菌体SMP的holin基因，获得了纯化的有活性的穿孔素，在体外可对多株临床分离的猪链球菌有裂解作用。经文献检索发现，王丽平、陆承平、唐家琪在《微生物学报》2004年第44卷第6期第794799页发表了“32种抗菌药物对临床分离猪源链球菌的体外抗菌活性”，文中提及，一些猪场分离的猪链球菌对32种抗菌药物的耐药性的研究结果显示，临床分离菌株以耐药菌为主，且大都呈多重耐药，尤其对磺胺类药物、林可胺类、四环素类、大环内酯类、氨基甙类药物的耐药性最为严重，耐药不仅普遍，且多为高度耐药，寻找另一种抗菌机制或抗菌药物显得尤为重要。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种裂解猪链球菌的穿孔素的制备方法。本发明获得的纯化的有活性的穿孔素，它可在体外裂解多株猪链球菌或增强裂解酶的裂解效率。本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明包括如下步骤步骤一，纯化得到猪链球菌2型烈性噬菌体，提取噬菌体的DNA；步骤二，以步骤一所得DNA为模板，应用PCR扩增穿孔素基因；步骤三，原核表达步骤二扩增所得DNA，得到融合蛋白；步骤四，纯化融合蛋白，复性，得到穿孔素。步骤三中，所述的原核表达采用的质粒是pET_28a(+)，表达的穿孔素分子约16kDa。步骤三中，所述的融合蛋白是指一个分子量为16kDa的融合蛋白。步骤四中，所述的纯化融合蛋白是指经过M柱纯化，得到有活性的穿孔素。所述的步骤四中的穿孔素发挥最佳裂解作用的条件是采用pH5.2醋酸钠缓冲液、最佳反应温度是37°C。本发明利用PCR扩增猪链球菌烈性噬菌体SMP的holin基因，获得目的片断，再将目的片断与pET-28a(+)载体连接，得到重组表达质粒，导入大肠杆菌BL21表达，经纯化得到有活性的穿孔素，获得的穿孔素在体外可裂解或增强裂解酶对多株临床分离的猪链球菌的裂解作用，并且对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有独立裂解作用。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明通过原核表达猪链球菌烈性噬菌体SMP的holin基因，获得纯化的有活性的穿孔素，它可在体外裂解多株猪链球菌或增强裂解酶的裂解效率。比较噬菌体穿孔素与裂解酶对细菌的裂解效率发现，裂解酶对高压处理过的猪链球菌具有裂解作用，当加入穿孔素后，其与裂解酶可协同、高效裂解未经处理的猪链球菌，裂解效率显著提高。具体实施例方式以下实例对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如实验室手册(NewYork=ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一、噬菌体的提纯、DNA的制备和穿孔素的表达步骤一，取平板上长成密集相连噬斑的噬菌体SMP(Ma，Y.L.，Lu，C.P.，IsolationandidentificationofabacteriophagecapableofinfectingStreptococcussuistype2strains.VeterinaryMicrobiology,2008，132:340_347，全基因组序列已提交GenBank，登录号EF116926.)，每板加入5mLSM(噬菌体稀释液，每升含5.8gNaCl，2gMgS04·7H20，50mLIMTris_Cl，pH7.5，5mL2%明胶)，4°C摇床晃动3小时，收集SM液放无菌离心管4000g离心10分钟去除细胞碎片。上清液加入胰DNaseI和RNaseI至终浓度为1μg/mL，37°C温育30分钟。加入NaCl至终浓度lmol/L，冰浴1小时后，4°CIlOOOg离心10分钟，收集上清。上清液加入PEG8000至终浓度10%室温搅拌溶解后冰浴1小时，使噬菌体颗粒发生沉淀。40C12000g离心10分钟，弃上清，沉淀的噬菌体颗粒用SM液过夜重；塁、ο步骤二，在重悬液中加入20mg/mL蛋白酶K至终浓度50μg/mL，37°C温育30分钟，再加10%SDS至终浓度为0.5%，混勻后将消化混合物于56°C温育1小时，冷却至室温。用等体积酚/氯仿抽提，3000g离心5分钟将两相分开，将亲水相收集至另一个离心管中。在回收的亲水相中加入3mol/L乙酸钠至终浓度0.3mol/L，混勻后加两倍体积的无水乙醇轻轻洗涤，13000g离心2分钟，弃上清，回收DNA沉淀。用适当体积的TE(核酸溶解缓冲液)溶解噬菌体DNA。步骤三，holin基因的原核表达(1)猪链球菌烈性噬菌体SMPholin基因的克隆根据猪链球菌烈性噬菌体SMP的基因序列设计引物进行PCR扩增。连接到pMD_18T载体(Takara公司)上测序。所设计的引物上游包含EcoRI限制性酶切位点，下游包含XhoI限制性酶切位点。(2)表达载体的构建EcoRI和XhoI分别酶切PCR产物和pET_28a(+)，T4DNA连接酶(Takara公司)1016°C过夜连接。连接产物转入大肠杆菌DH5α中，37°C过夜培养，提取质粒。用EcoRI和XhoI酶切鉴定。鉴定的阳性重组质粒测序。(3)融合蛋白的表达筛选阳性克隆提取质粒，转入大肠杆菌BL21(祝昊丹，顾宏伟，陆承平.体内表达新基因trag在猪链球菌的分布及其免疫反应性分析，微生物学报，2008,48(12)1642-1648)中。挑取1个菌落接种5ml卡那霉素LB培养基过夜培养。取5mL过夜培养菌液接种IL卡那霉素LB培养基，37°C200转/分摇菌培养5h，至0D600为0.41。加IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至终浓度为lmM，27°C摇菌培养4h后，收取菌液。(4)SDS-PAGE电泳配制12%的分离胶和5%的浓缩胶，样品用上样缓冲液沸水煮4min，浓缩胶电压80V，分离胶电压136V，电泳45h，考马斯亮兰染色2h。脱色观察，在16kDa处有明显的条带出现。二、融合蛋白的纯化IPTG诱导的细菌IL溶于25mL预冷的裂解缓冲液(含50mM磷酸钠缓冲液，ρΗ8.0)，超声破碎。SOOOg离心取上清。以8个柱体积的裂解缓冲液洗Ni柱，将样品上至柱内，再用预冷的裂解缓冲液洗柱，直至OD28tl<0.1。用预冷的清洗缓冲液A(裂解缓冲液加5mM咪唑)洗柱，直至OD28tl<0.1。用预冷的清洗缓冲液B(裂解缓冲液加20mM咪唑)洗柱，直至OD280<0.1。最后用溶出液(裂解缓冲液加250mM咪唑)洗柱，收集洗脱液，即为纯化的穿孔素。三、穿孔素最佳裂解条件的确定将猪链球菌SS2-4(Wang.Y,Sun.J.H.，Lu.C.P.，PurifiedRecombinantPhageLysinLySMP:AnExtensiveSpectrumofLyticActivityforSwineStreptococci.CurrentofMicrobiology.2009，58:609_615)离心，重悬于pH5.2的醋酸钠缓冲液，配成0D630为1.0左右的细菌悬液，加入96孔板中，每孔100μ1。20μg/ml纯化的穿孔素中，分别加入0%、0.5%、0.8%、1.0%、3.0%和5.0%(V/V)β-巯基乙醇，各取100μ1加入细菌混悬液中。每个浓度各做3个重复，裂解缓冲液作为空白对照。室温下反应30min后，在600nm处读取吸光度，取吸光度减少最大的浓度作为β-巯基乙醇加入的最佳浓度，测定的最佳浓度为0.5%。将猪链球菌SS2-4离心，重悬于ρΗ5.2的醋酸钠缓冲液，配成OD63tl为1.0左右的细菌悬液，加入96孔板中，每孔100μ1。20μg/ml纯化的穿孔素中，分别加入lmM、2mM、4mM、5mM、8mM、10mM、15mM半胱氨酸，各取100μ1加入细菌混悬液中。每个浓度各做3个重复，裂解缓冲液作为空白对照。室温下反应30min后，在600nm处读取吸光度，取吸光度减少最大的浓度作为半胱氨酸加入的最佳浓度，测定的最佳浓度为10mM。分别用20mMpH5.2醋酸钠缓冲液、IOmMpH6.8磷酸盐缓冲液、IOmMpH7.2磷酸盐缓冲液、20mMpH8.5Tris-Cl缓冲液重悬链球菌，其余步骤与上面同，测定最佳反应缓冲液为20mMpH5.2醋酸钠缓冲液。分别在4°C、18°C、25V、37V和42V作用30min，其余步骤与上面同，测定穿孔素最佳反应温度为37°C。四、穿孔素对细菌的裂解作用测定分别取200mL表达菌lys_BL21和holin_BL21(Wang.Y,Sun.J.H.，Lu.C.P.，PurifiedRecombinantPhageLysinLySMP:AnExtensiveSpectrumofLyticActivityforSwineStreptococci.CurrentofMicrobiology.2009,58609-615)经过IPTG诱导4小时后离心，各用5mL灭菌0.01MPBS(pH7.2)重悬，悬浮物超声破碎。获得的裂解液做细菌裂解试验。过夜培养的50mL菌株培养物长至OD6qqL0后离心，以lmLPBS(pH7.2)重悬，以PBS(pH7.2)洗3遍。处理后的细菌加入0.7%融化的琼脂糖中，倒入平皿中冷却后，在平板上打孔，分别滴加两种裂解液以及两种裂解液的混合液，37°C培养5h以上，观察培养基上出现的透明抑菌圈。以含有pET-28a(+)质粒的BL21作为空白对照。观察两种表达菌裂解物以及混合液对猪链球菌2型(SS2)、猪链球菌7型(SS7)、猪链球菌9型(SS9)菌株、马链球菌兽疫亚种参考株ATCC35246、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌的裂解情况(见表1)(Wang.Y,Sun.J.H.，Lu.C.P.，PurifiedRecombinantPhageLysinLySMP:AnExtensiveSpectrumofLyticActivityforSwineStreptococci.CurrentofMicrobiology.2009.58:609_615)。表1穿孔素对猪链球菌等的裂解作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注+具有裂解活性；++具有较强裂解活性；-无裂解活性表中所列菌株的信息已经在以下文献中公开Wang.Y，Sun.J.H.，Lu.C.P.，PurifiedRecombinantPhageLysinLySMP:AnExtensiveSpectrumofLyticActivityforSwineStreptococci.CurrentofMicrobiology.2009,58609-615.；祝昊丹，顾宏伟，陆承平.体内表达新基因trag在猪链球菌的分布及其免疫反应性分析，微生物学报，2008,48(12):1642-1648；范红结，陆承平，唐家琪.马链球菌兽疫亚种类M基因和猪链球菌2型mrp基因片段的融合表达及仔猪免疫试验，南京农业大学学报，2003，26(4)78-81；宋世平，解晓珍，席道友，等.158株金黄色葡萄球菌的耐药性监测与分析，中华医院感染学杂志，2003，13(4):384-385;李晶，杨谦.生防枯草芽孢杆菌的研究进展，安徽农业科学，2008,36(1):106-111；张河战.沙门氏菌的分类、命名及中国沙门氏菌菌型分布，微生物学免疫学进展，2002，30(2)74-76。权利要求一种猪链球菌噬菌体穿孔素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，纯化得到猪链球菌2型烈性噬菌体，提取噬菌体的DNA；步骤二，以步骤一所得DNA为模板，应用PCR扩增穿孔素基因；步骤三，原核表达步骤二扩增所得DNA，得到融合蛋白；步骤四，纯化融合蛋白，复性，得到穿孔素。2.根据权利要求1所述的猪链球菌噬菌体穿孔素的制备方法，其特征是，步骤三中，所述原核表达采用的质粒是pET-28a(+)，表达的穿孔素分子约16kDa。3.根据权利要求1或者2所述的猪链球菌噬菌体穿孔素的制备方法，其特征是，步骤三中，所述的原核表达是指(1)根据猪链球菌烈性噬菌体SMP的基因序列设计引物进行PCR扩增，连接到pMD-18T载体上测序，所设计的引物上游包含EcoRI限制性酶切位点，下游包含XhoI限制性酶切位点；(2)表达载体的构建EcoRI和XhoI分别酶切PCR产物和pET-28a(+)，T4DNA连接酶1016°C过夜连接，连接产物转入大肠杆菌DH5ci中，37°C过夜培养，提取质粒，用EcoRI和XhoI酶切鉴定，鉴定的阳性重组质粒测序；(3)融合蛋白的表达筛选阳性克隆提取质粒，挑取1个菌落接种5ml卡那霉素LB培养基过夜培养，取5mL过夜培养菌液接种1L卡那霉素LB培养基，37°C200转/分摇菌培养5h，至0D600为0.41，加异丙基硫代-3-D-半乳糖苷至终浓度为lmM，27°C摇菌培养4h后，收取菌液；(4)配制12%的分离胶和5%的浓缩胶，样品用上样缓冲液沸水煮4min，浓缩胶电压80V，分离胶电压136V，电泳45h，考马斯亮兰染色2h，脱色观察，在16kDa处有明显的条带出现。4.根据权利要求1所述的猪链球菌噬菌体穿孔素的制备方法，其特征是，步骤三中，所述的融合蛋白是指获得一个分子量为16kDa的融合蛋白。5.根据权利要求1所述的猪链球菌噬菌体穿孔素的制备方法，其特征是，步骤四中，所述的纯化融合蛋白是指经过M柱纯化，得到有活性的穿孔素。6.根据权利要求1或者5所述的猪链球菌噬菌体穿孔素的制备方法，其特征是，步骤四中，所述的纯化融合蛋白，包括如下步骤①IPTG诱导的细菌1L溶于25mL预冷的裂解缓冲液，其中含50mM磷酸钠缓冲液，pH8.0，超声破碎；②8000g离心取上清；③以8个柱体积的裂解缓冲液洗M柱，将样品上至柱内，再用预冷的裂解缓冲液洗柱，直至0D28Q<0.1；④用预冷的裂解缓冲液加5mM咪唑的清洗缓冲液A洗柱，直至0D28(1<0.1；⑤用预冷的裂解缓冲液加20mM咪唑的清洗缓冲液B洗柱，直至0D28(1<0.1；⑥最后用裂解缓冲液加250mM咪唑的溶出液洗柱，收集洗脱液，即为纯化的穿孔素。7.根据权利要求1或者5所述的猪链球菌噬菌体穿孔素的制备方法，其特征是，所述的步骤四中的穿孔素发挥最佳裂解作用的条件是采用PH5.2醋酸钠缓冲液、最佳反应温度是37°C。8.根据权利要求1所述的猪链球菌噬菌体穿孔素的制备方法，其特征是，所述的步骤二按照以下方式进行在重悬液中加入20mg/mL蛋白酶K至终浓度50ug/mL,37°C温育30分钟；再加10%SDS至终浓度为0.5%，混勻后将消化混合物于56°C温育1小时，冷却至室用等体积酚/氯仿抽提，3000g离心5分钟将两相分开，将亲水相收集至另一个离心管中；在回收的亲水相中加入3mol/L乙酸钠至终浓度0.3mol/L，混勻后加两倍体积的无水乙醇轻轻洗涤，13000g离心2分钟，弃上清，回收DNA沉淀；用核酸溶解缓冲液溶解噬菌体DNA。全文摘要一种生物材料
技术领域：
的猪链球菌噬菌体穿孔素的制备方法，通过纯化得到猪链球菌2型烈性噬菌体，提取噬菌体的DNA；以步骤一所得DNA为模板，应用PCR扩增穿孔素基因；原核表达步骤二扩增所得DNA，得到融合蛋白；纯化融合蛋白，复性，得到穿孔素。本发明获得的纯化的有活性的穿孔素，它可在体外裂解多株猪链球菌或增强裂解酶的裂解效率。文档编号C12N15/70GK101831442SQ201010168940公开日2010年9月15日申请日期2010年5月12日优先权日2010年5月12日发明者严亚贤,史一博,孙建和,李宁,陆承平申请人:上海交通大学