α-葡萄糖苷酶及同步糖化转苷制备低聚异麦芽糖的方法

α-葡萄糖苷酶及同步糖化转苷制备低聚异麦芽糖的方法
【专利摘要】本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种α?葡萄糖苷酶及同步糖化转苷制备低聚异麦芽糖的方法。所述α?葡萄糖苷酶在66℃下的半衰期t1/2提高了3.7倍，采用所述α?葡萄糖苷酶与耐高温α?淀粉酶、中温α?淀粉酶、β?淀粉酶、普鲁兰酶进行淀粉液化和同步糖化转苷所制备的低聚异麦芽糖核心组成(IG2+P+IG3)占干物质的比例达到52％～59％。
【专利说明】
a-葡萄糖昔酶及同步糖化转昔制备低聚异麦芽糖的方法
技术领域：
[0001] 本发明属于酶工程技术领域，具体设及一种耐热a-葡萄糖巧酶突变体的获得及高 效制备方法，淀粉液化新方法，糖化转巧同步进行实现高品质低聚异麦芽糖制备的过程。
【背景技术】：
[0002] 低聚异麦芽糖（Isomaltooligosaccharides，W下简称IM0)，又称分枝低聚糖、异 麦芽低聚糖等，是葡萄糖之间至少有一个Wa-1,6糖巧键结合而成的、单糖数为2~6不等的 一类低聚糖。它的主要成分是异麦芽糖(IG2)、潘糖(P)、异麦芽=糖(IG3)及异麦芽四糖(Gn) 等。低聚异麦芽糖属于非可消化性低聚糖，其不可W作为人体能量的直接来源，但其能选择 性的增殖肠道中双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌，其代谢的短链脂肪酸能够降低肠道的抑，抑 制有害菌的生长，来维持肠道微生态的平衡;另外，运些短链脂肪酸可W给其它微生物提供 能量，所W又称功能性低聚糖。低聚异麦芽糖的商业产品规格主要有两种：IM0-50型（IG2+P +IG3+Gn>50%)和 IM0-90 型（IG2+P+IG3+Gn>90%)DlM0-50 中含有一定量的葡萄糖、麦芽糖， 而IM0-90中含较少葡萄糖和麦芽糖，产品纯度较高，是在IM0-50基础上经过纳滤分离制取 的高纯度低聚异麦芽糖。工业化生产IMO的主要方法是用葡萄糖基巧酶糖化转巧为IM0,再 经脱色、浓缩、干燥而成。
[0003] 低聚异麦芽糖具有很多生理功能。其中直接生理功能有：（1)难W被胃酶消化，热 量低，甜度低，基本上不增加血糖血脂；（2)能促进人体肠道内益生菌一一双歧杆菌的增殖， 能抑制肠道内各类有害菌及腐败物质的形成，增加各种维生素的含量，提高机体免疫力；
[3] 離齿预防功能，它不被口腔酶液分解，不被離齿的链球菌利用，因而能防止離齿，低聚异 麦芽糖中的潘糖对阻碍齿垢形成的效果极为明显；（4)它属于非消化低聚糖类，功能等同于 水溶性膳食纤维。间接生理功效有：（1)促进消化系统对食物的消化、吸收，维持肠道正常功 能；（2)恢复抗菌素治疗、放射线治疗、化学治疗期间的肠道正常菌落；（2)防止便秘与改善 腹泻，抑制病原菌和腐败菌；（4)提高机体免疫力，是优良的免疫调节剂；（5)抑制肠道致癌 物质的产生，降低胆固醇含量，改善血清脂质；（6)增加机体对巧、儀等矿物质的吸收，有助 于机体合成站矣维生素。
[0004] 目前，国内外生产IMO的经典方法主要W淀粉为原料，采用淀粉酶系多酶协同法转 化淀粉液得到。工业上首先由淀粉在高溫Q-淀粉酶的作用下液化，液化淀粉在中溫Q-淀粉 酶或者e-淀粉酶继续作用下生成麦芽糖浆，再利用Q-葡萄糖转巧酶进行糖基转换生成IM0， 终产物糖类组分中约含有50 %~60 %的IMO，40 %~50 %的葡萄糖、麦芽糖及麦芽=糖，最 后经过滤、脱色、脱盐、浓缩等得到成品。采用经典生产工艺存在工序多、时间长、工艺参数 控制困难、难W实现连续化生产等缺点，由于生产过程中使用的a-葡萄糖巧酶制剂在国内 生产领域几乎处于空白，主要依赖进口，存在价格昂贵、来源不稳定等问题，同时，产品中功 能性糖分的含量不高，仅占固形物的35% (w/w)，运些都制约着我国IMO的发展。
[0005] 由于经典工艺生产IMO存在的不足，近年来，国内外研究学者致力于酶催化生产 IMO的研究，发现微生物中细菌、酵母、霉菌等都能分泌a-葡萄糖巧酶，相关报道中曲霉属微 生物产酶较高，但是由于具有转巧活性的a-葡萄糖巧酶为胞内酶，酶的表观活力较低，有些 学者针对提高O-葡萄糖巧酶的表观转巧活力展开研究。陈桂光等制备的透性化细胞的表观 酶活达到483.9U/g湿菌体，是完整细胞表观酶活的193.3%，使用透性化细胞转化生产低聚 异麦芽糖，其转化周期为2地，较完整细胞缩短2地，转化率保持在70% W上。并且，他W黑曲 霉GXM-3为出发菌株进行60C-丫射线与紫外线照射复合诱变育种，结果发现，突变株D-597 的转化能力最强，在3L发酵罐中发酵SOh，糖浆产物中低聚异麦芽糖含量达到最高值 169.4mg/mL，比出发菌株提高了 37.2%，发酵周期缩短了 40h。林永贤等用离子注入技术对 黑曲霉出发菌株进行诱变处理，选育出一株高产突变株AL7,通过对产酶条件进行优化，使 其产酶量为9.24U，较出发菌株提高了4.18倍。由于野生Aspe巧i 1 Ius niger产酶水平低，难 W提取纯化，国内外研究学者纷纷开始构建和利用基因工程菌生产具有高转巧活性的O-葡 萄糖巧酶。童星等W毕赤酵母Pichia pastoris KM71为宿主菌表达黑曲霉Aspergillus niger SG136a-葡萄糖巧酶，其中选用的酵母表达载体pPIC9K含有分泌型信号肤，利于胞外 表达，制备的粗酶液的转巧反应在抑5，溫度55°C，反应24h时，低聚异麦芽糖的总含量达到 26%。
[0006] 可见，目前的IMO生产工艺依然存在生产时间长且转化率低的问题。

【发明内容】
：
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明通过合理搭配各种淀粉水解酶的组合方式，采用 了新型耐热O-葡萄糖巧酶，形成了可W-步催化生产低聚异麦芽糖的制作过程，简化了生 产工艺。
[0008] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是:提供一种通过基因工程手段 获得的耐热性显著提高的Q-葡萄糖巧酶突变体，其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:4所示， 其基因序列如序列表SEQ ID NO:3所示；
[0009] 所述突变体较原始a-葡萄糖巧酶60°C下的半衰期ti/2提高了 3.7倍；
[0010] 本发明W黑曲霉NR化3135总RNA为模板逆转录扩增出a-葡萄糖巧酶基因，利用易 错PCR技术对a-葡萄糖巧酶基因a曲进行分子改良，W获得耐热性显著提高的优良突变体。
[0011] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是:提供一种技术方案一所述O- 葡萄糖巧酶突变体的制备方法：
[0012] (1)将SEQ ID N0:3所述基因进行酶切，并与经过相应酶切的质粒pHY-WZX进行连 接，构建重组质粒；
[0013] (2)将重组质粒转化至地衣芽抱杆菌CBB3008感受态细胞，制备重组菌株；
[0014] (3)表达所述的重组菌株，得到SEQ ID N0:4所示的a-葡萄糖巧酶突变体；
[0015] 所述地衣芽抱杆菌CBB3008,保藏编号CCTCC No.M 208236,具体参见中国发明专 利化 200810235368.0,及Dandan Niu,et al.Microbial Cell F'actories,2009,8:58;
[0016] 所述质粒pHY-WZX参考Dandan Niu and Zhengxiang Wang. J Ind Microbiol Biotechnol,2007,34:357-362；
[0017] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之S是:利用耐热性显著提高的a-葡 萄糖巧酶突变体，W淀粉为原料，提供一种同步糖化转巧高效制备低聚异麦芽糖的方法，具 体如下：
[0018] (I)淀粉液化
[0019] 淀粉液化过程可采用喷射液化或加热沸腾两种方式实施；
[0020] 喷射液化:加入4.5t淀粉到装有IOm3水的发酵罐中（边加入淀粉，边揽拌），将淀粉 乳揽拌均匀后，在发酵罐中加水到ISm3，调节抑至5.8~6.5;加入耐高溫a-淀粉酶至发酵罐 终浓度4~抓/mL,经喷射液化器107~Iior喷射液化，维持罐维持后即可用于糖化和转巧。
[0021] 加热沸腾液化:加入4.5t淀粉到装有IOm3水的发酵罐中（边加入淀粉，边揽拌），将 淀粉乳揽拌均匀后加入一定量的水，在发酵罐中定容到18m3,调节抑至5.0~6.5。将淀粉乳 加热至40~50°C，加入耐高溫a-淀粉酶3~抓/mL,继续加热淀粉膠液至沸腾，即完成液化
[0022] 进一步的，加入耐高溫a-淀粉酶的同时加入中溫a-淀粉酶，终浓度为0.1~2U/mL
[0023] (2)同步糖化转巧
[0024] 将上述液化后的膠液冷却至50°C~60°C，加入中溫a-淀粉酶，普鲁兰酶，0-淀粉 酶，Q-葡萄糖巧酶中的几种，维持反应溫度在50°C~60°C，具体有W下=种方案：
[00巧]方案一：添加发酵罐终浓度13~25U/mU3-淀粉酶和0.2~5U/mL普鲁兰酶，在pH 5.0~5.5和溫度50°C~55 °C条件下先行作用1~4h，最后加入发酵罐终浓度40~250U/mL的 a-葡萄糖巧酶，在抑5.8~6.5和溫度55°C~60°C条件下继续作用9~20h进行转巧作用； [00%]方案二:添加发酵罐终浓度2~抓/mL的中溫a-淀粉酶、13~25U/mL的0-淀粉酶和 0.2~抓/mL的普鲁兰酶，在抑5.0~5.5和溫度50°(：~55°(：条件下先行作用1~地，然后加 入终浓度40~250U/mL的a-葡萄糖巧酶，在抑5.5~6.0和溫度55°(：~60°(：条件下作用9~ 20h;
[0027] 方案四个酶按普鲁兰酶、中溫a-淀粉酶、(6-淀粉酶和a-葡萄糖巧酶的先后顺 序，按照中溫a-淀粉酶终浓度2~抓/mL、普鲁兰酶终浓度0.2~抓/mL、0-淀粉酶终浓度13~ 2抓/mL、a-葡萄糖巧酶终浓度40~250U/mL的添加量，在P册.0~6.5和溫度50°C~60°C条件 下相继分别作用1~化完成催化；
[0028] 进一步地，a-葡萄糖巧酶如技术方案一所述；
[0029] 进一步地，所述淀粉液化过程，其DE(水解度)可W达到5~50;
[0030] 更进一步地，本发明中的相关酶催化淀粉制备低聚异麦芽糖(IG2+P+IG3)占干物质 比重52%~59%的低聚异麦芽糖浆。
[0031] 有益效果：
[0032] 1、本发明提供了一种耐热a-葡萄糖巧酶突变体的获得及高效制备方法，所获得突 变酶在60°C下的半衰期ti/2提高了 3.7倍。
[0033] 2、本发明提供了一种W淀粉为同步糖化同步转巧高效制备高品质低聚异麦芽糖 的制造技术，所制备的低聚异麦芽糖核屯、组成（IG2+PWG3)占干物质的比例达到52 %~ 59%;利用本发明所提供的a-葡萄糖巧酶突变体与商品酶组合形成的低聚异麦芽糖制备新 工艺，反应13h低聚异麦芽糖的总含量能达到52% W上。
[0034] 3、本发明的低聚异麦芽糖的制造技术所设及的耐高溫a-淀粉酶、中溫a-淀粉酶、 e-淀粉酶、普鲁兰酶和Q-葡萄糖巧酶采用了新型表达和组合表达方式，具有显著催化性能；
[0035] 4、本发明的淀粉液化过程采用快速简便的制备过程；
[0036] 5、本发明的液化糖浆可W同时或分步地条件下，快速实现低聚异麦芽糖浆的制备 过程。
【附图说明】：
[0037]图化-葡萄糖巧酶基因的PCR扩增
[003引其中，泳道1为UDNA Pst I酶切分子量标定；泳道2为PCR扩增的a-葡萄糖巧酶基 因片段；
[0039] 图2 SDS-PAGE分析纯化的突变酶
[0040] 其中，1为发酵液;2为离子交换柱纯化后的组分;3为凝胶柱纯化后的组分;M为蛋 白分子量标准；
[0041 ]图3制备低聚异麦芽糖样本HPLC解析图谱
[0042] 其中，DPl-葡萄糖，DP2-麦芽糖，版-异麦芽糖，DP3-麦芽立糖，P-潘糖，IG3-异麦芽 立糖，Kk-异麦芽四糖。
【具体实施方式】：
[0043] 下面结合实施例对本发明进行进一步说明；下述实施例并不限定本发明，不能W 下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0044] 实施例1 :a-葡萄糖巧酶编码基因片段的获得
[0045] 采用TR化01总RNA提取试剂提取黑曲霉NR化3135的总RNA。W总RNA为模板，参照 RT-PCR试剂盒说明书，W01 igo (dT)为引物逆转录合成第一链CDNA，然后分别W第一链CDNA 为模板，W引物FUSEQ ID N0:5)和RUSEQ ID N0:6)进行PCR扩增出黑曲霉a-葡萄糖巧酶 基因agD(图1)。将PCR产物与质粒PMD19-T simple vector进行连接，获得重组质粒pMD- agD，转化Escherichia coli JM109感受态细胞。筛选阳性转化子，并提取其质粒进行酶切 验证。再将酶切验证正确的重组质粒进行测序(序列SEQ ID NO: 1，其氨基酸序列为SEQ ID N0:2)〇
[0046] 实施例2:利用易错PCR方法构建a-葡萄糖巧酶突变文库
[0047] 在体外利用易错PCR技术向a-葡萄糖巧酶基因a曲引入核巧酸突变。易错PCR的反 应条件如下：
[004引
[0049] PCR扩增条件：94°C3min; 94°C Imin，58°C Imin，72°C 1.5min，30个循环；72°C IOmin。 所用引物为引物F1(SEQ ID N0:5)和R1(SEQ ID N0:6)。
[0050] 易错PCR扩增产物（WagDX命名）经DNA纯化回收试剂盒纯化后，用限制性内切酶 Xba I和Kpn I对其进行酶切，并与经过相应酶切的质粒pHY-WZX(Dandan Niu and Zhengxiang Wang.J Ind Microbiol Biotechnol,2007,34:357-362)进行连接，构建重组 质粒pHY-WZX-a曲X。取祉L重组质粒pHY-WZX-a曲X DNA与地衣芽胞杆菌CBB3008感受态细胞 混匀，移入预冷的电转杯，电击后，加入复苏培养基(含0.5M山梨醇和0.5M甘露醇的LB培养 基）d37°C、160r/min复苏培养化，然后涂布含卡纳霉素(0.03mg/mU的LB平板，过夜培养。
[0051] 按照上述的方法，W突变体基因组为模板进行多轮易错PCR，构建突变文库。
[0052] 实施例3:热稳定性突变菌株的筛选
[0化3]挑取LB平板上的单菌落，采用96孔板用LB液体培养基于30~32°C培养55~70h，装 液量为200~250化，同时W初始的重组菌B. Iicheniformis CBB3008(pHY-WZX)为对照。
[0054] 将96孔板I离屯、去除菌体，依次从每孔取10化上清液转移入另一 96板II中。并将该 96孔板正置于60°C热处理60min。向每孔中加入0.2%的底物邻甲氧基苯基-a-D-葡萄糖巧 5化L，30°C溫浴lOmin。加入80化2.5mol/L的化OH溶液终止反应(对照组先加入终止液，再 加入底物）。同时制备重氮盐溶液：取〇.2g/L NaN〇2 IOOmL,然后加入3mol/L的HCl 5mL，使 溶液呈酸性，30°C溫浴5min，加入50g/L的苯胺IOmL，30°C反应6min。取11化L重氮盐溶液加 入酶反应体系中，室溫显色2min"450nm处酶标仪测定吸光值。残留的酶活高于对照菌株的 即为目的菌株，采用该方法共筛选到6株菌株。
[0055] 实施例4:突变酶的热稳定性研究
[0056] 将目的菌株的发酵液经过硫酸锭沉淀、透析、DEAE-Sepharose离子交换W及 Superdex? 200凝胶过滤进行分离纯化（图2)。
[0057] 采用实施例3的酶活测定方法，测定60°C下的半衰期ti/2。具体测定方法为：IOU纯 化酶放于60°C下，经不同的时间间隔取出，室溫平衡5min，测定酶活。取出后酶活为未热处 理时的50%的时间，即为酶在60°C下的半衰期ti/2。
[0058] W易错PCR构建的突变文库为基础进行筛选，获得6株酶活明显提高的菌株，测定 Ct-葡萄糖巧酶核巧酸序列，利用S联体密码子推测a-葡萄糖巧酶的氨基酸序列，a-葡萄糖 巧酶突变体的氨基酸取代及60°C下的半衰期ti/2提高倍数如表1所示。其中突变体2-5的耐 热性能最为优良，对应的菌种为B. Iicheniformis化-25。作为a-葡萄糖巧酶的生产菌种后 续使用。其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:4所示，其基因序列如序列表SEQ ID N0:3所示。
[0059] 表1原始酶和突变酶在60°C下的半衰期 [00601
[C
[0062] 实施例5:1化发酵体系下化-25菌种制备a-葡萄糖巧酶
[0063] 将菌种化-25接种到种子培养基(酵母膏3%，蛋白腺3.8%，葡萄糖10%，其余为 水，pH 7.0)培养到对数生长期，进一步在1化发酵罐中进行发酵实验，发酵培养基为(w/v): 酵母膏1%，蛋白腺3%，乳糖10%，碳酸巧1.4%，余量为水，发酵过程中用硫酸或氨水控制 pH为7.0，W5%的接种量接种，37°C、发酵12化后，此菌株产生a-葡萄糖巧酶的发酵液酶活 水平可达到llOOOU/mL。实施例6:1化发酵体系下化-25菌种制备a-葡萄糖巧酶
[0064] 将菌种化-25接种到种子培养基(酵母膏5 %，蛋白腺6.2 %，葡萄糖20 %，其余为 水，pH 7.0)培养到对数生长期，进一步在1化发酵罐中进行发酵实验，发酵培养基为(w/v): 酵母膏1%，蛋白腺3%，乳糖10%，碳酸巧1.4%，余量为水，发酵过程中用硫酸或氨水控制 pH为7.0。W5%的接种量接种，37°C、发酵15化后，此菌株产生a-葡萄糖巧酶的酶活水平可 达到 13000U/mL。
[0065] 实施例7:在30m3体系下菌种化-25发酵制备a-葡萄糖巧酶
[0066] 将实施例6的工艺调整为30m3发酵体系对应的比例。分别完成种子培养，接种15L 一级种子罐，移种3m3二级种子罐，主发酵罐移种等操作后，培养菌体，经补料生长阶段后， 发酵产酶90~12化后发酵结束。发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液至合适浓度， 添加辅助制剂后精滤制备O-葡萄糖巧酶液体成品，或添加适量食品级淀粉后喷雾干燥制备 粉末剂型a-葡萄糖巧酶成品，成品酶活为350000U/g~370000U/g。
[0067] 实施例8:30m3制糖体系制备低聚异麦芽糖工艺一
[006引加入4.5t淀粉到装有IOm3水的发酵罐中（边加入淀粉，边揽拌），将淀粉乳揽拌均 匀后，在发酵罐中加水到18m3，调节抑至6.1;加入耐高溫a-淀粉酶4U/mL，经喷射液化器109 °C喷射液化，维持罐维持化后即可用于糖化和转巧。
[0069] 如方案一将上述液化后的膠液冷却至54°C，调节抑为5.5加入普鲁兰酶2U/mL、(6- 淀粉酶14U/mL、作用化后pH调整为6.0，加入实施例6所得a-葡萄糖巧酶220U/mL，维持反应 溫度在57°C，反应13h即可得到低聚异麦芽糖（IG2+P+IG3)占干物质含量为38%~49%的糖 浆。（上述酶的添加量均为发酵罐中的终浓度）。
[0070] 实施案例9:30m3制糖体系制备低聚异麦芽糖工艺二
[0071] 淀粉液化和糖化:加入4.5t淀粉到装有IOm3水的发酵罐中（边加入淀粉，边揽拌）， 将淀粉乳揽拌均匀后加入一定量的水，在发酵罐中定容到18m3,调节抑至6.0。将淀粉乳加 热至45°C，加入耐高溫a-淀粉酶4.抓/mL,继续加热淀粉膠液至沸腾，即完成液化。将上述液 化后的膠液冷却至59°C，加入普鲁兰酶1.8U/mL、e-淀粉酶14.2U/mL、实施例7所得a-葡萄糖 巧酶16抓/mL,维持反应溫度在59°C，反应IOh即可得到低聚异麦芽糖（IG2+P+IG3)占干物质 含量为35%~45%的糖浆。（上述酶的添加量均为发酵罐中的终浓度）。
[0072] 实施案例10:30m3制糖体系制备低聚异麦芽糖工艺S
[0073] 淀粉液化和糖化:加入4.5t淀粉到装有IOm3水的发酵罐中（边加入淀粉，边揽拌）， 将淀粉乳揽拌均匀后加入一定量的水，在发酵罐中定容到18m3,调节抑至6.0。将淀粉乳加 热至48 °C，加入耐高溫a-淀粉酶4.3U/mL和中溫a-淀粉酶1.2U/mL，继续加热淀粉膠液至沸 腾，即完成液化。将上述液化后的膠液冷却至59°C，加入普鲁兰酶1.8U/mL、e-淀粉酶14.2U/ mU实施例7所得a-葡萄糖巧酶16抓/mL,维持反应溫度在59°C，反应IOh即可得到低聚异麦 芽糖(IG2+P+IG3)占干物质含量为40%~50%的糖浆。（上述酶的添加量均为发酵罐中的终 浓度）。
[0074] 实施案例11:30m3制糖体系制备低聚异麦芽糖工艺四
[0075] 淀粉液化和糖化:加入4.5t淀粉到装有IOm3水的发酵罐中（边加入淀粉，边揽拌）， 将淀粉乳揽拌均匀后加入一定量的水，在发酵罐中定容到18m3,调节抑至6.0。将淀粉乳加 热至49°C，加入耐高溫a-淀粉酶4.洲/mL和中溫a-淀粉酶1. lU/mL，继续加热淀粉膠液至沸 腾，即完成液化。
[0076] 如方案二将上述液化后的膠液冷却至55 °C，调节抑为5.5加入普鲁兰酶1.抓/mL、 e-淀粉酶13.抓/mL、中溫a-淀粉酶2. OU/mL，作用化后抑调整为6.0，加入实施例7所得a-葡 萄糖巧酶18抓/mL,维持反应溫度在55°C，反应13h即可得到低聚异麦芽糖（IG2+P+IG3)占干 物质含量为52%~59%的糖浆。（上述酶的添加量均为发酵罐中的终浓度）。
[0077] 实施案例12:30m3制糖体系制备低聚异麦芽糖工艺五
[0078] 淀粉液化和糖化:加入4.5t淀粉到装有IOm3水的发酵罐中（边加入淀粉，边揽拌）， 将淀粉乳揽拌均匀后加入一定量的水，在发酵罐中定容到18m3,调节抑至6.0。将淀粉乳加 热至49°C，加入耐高溫a-淀粉酶4.洲/mL和中溫a-淀粉酶1. lU/mL，继续加热淀粉膠液至沸 腾，即完成液化。
[0079] 如方案S将上述液化后的膠液冷却至54°C，调节抑为5.巧日入普鲁兰酶1.7U/血作 用化后，加入中溫a-淀粉酶2.2U/mL继续作用4h后，加入0-淀粉酶15.洲/mL继续作用化后， pH调整为6.0,加入实施例7所得a-葡萄糖巧酶186U/mL，维持反应溫度在55°C反应地，共计 反应13h即可得到低聚异麦芽糖（IG2+P+IG3)占干物质含量为49%~56%的糖浆。（上述酶 的添加量均为发酵罐中的终浓度）。
【主权项】
1. 一种α-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体其氨基酸序列如SEQ ID No.4所 不。2. 权利要求1所述α-葡萄糖苷酶突变体的编码基因。3. 如权利要求2所述的α-葡萄糖苷酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因如 SEQ ID No .3所示。4. 权利要求1所述α-葡萄糖苷酶突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于， 用于制备低聚异麦芽糖。5. -种利用权利要求1所述突变体同步糖化转苷高效制备低聚异麦芽糖的方法，具体 如下： (1) 淀粉液化 (2) 同步糖化转苷 将液化后的醪液冷却至50°C~60°C，添加终浓度13~25U/mL的β-淀粉酶和0.2~5U/mL 的普鲁兰酶在pH 5.0~5.5和温度50°C~55°C条件下先行作用1~4h，最后加入终浓度40~ 250U/mL的α-葡萄糖苷酶在pH 5.8~6.5和温度55°C~60°C条件下继续作用9~20h进行转 苷。6. 如权利要求5所述的一种同步糖化转苷高效制备低聚异麦芽糖的方法，其特征在于， 所述淀粉液化采用喷射液化;加入4.5t淀粉到装有IOm 3水的发酵罐中，将淀粉乳搅拌均匀 后，在发酵罐中加水到ISm3，调节pH至5.8~6.5;加入耐高温α-淀粉酶至发酵罐终浓度4~ 5U/mL，经喷射液化器101~IHTC喷射液化，维持罐维持后即可用于糖化和转苷。7. 如权利要求5所述的一种同步糖化转苷高效制备低聚异麦芽糖的方法，其特征在于， 所述淀粉液化采用加热沸腾液化:加入4.5t淀粉到装有IOm 3水的发酵罐中，将淀粉乳搅拌 均匀后加入一定量的水，在发酵罐中定容到18m3，调节pH至5.0~6.5;将淀粉乳加热至40~ 50°C，加入耐高温α-淀粉酶3~5U/mL，继续加热淀粉醪液至沸腾，即完成液化。8. 如权利要求1所述的一种同步糖化转苷高效制备低聚异麦芽糖的方法，其特征在于， 加入耐高温α-淀粉酶的同时加入终浓度为0.1~2U/mL的中温α-淀粉酶。9. 如权利要求5所述的一种同步糖化转苷高效制备低聚异麦芽糖的方法，其特征在于， 同步糖化转苷过程中加入淀粉酶和普鲁兰酶的同时，加入终浓度2~5U/mL的中温α-淀粉 酶，共同作用1~4h，之后添加终浓度40~250U/mL α-葡萄糖苷酶在pH 5.5~6.0和温度55 。(:~60°C条件下作用9~20h。10. 如权利要求5所述的一种同步糖化转苷高效制备低聚异麦芽糖的方法，其特征在 于，同步糖化转苷过程如下：将液化后的醪液冷却至50°C~60°C，四个酶按普鲁兰酶、中温 α-淀粉酶、β_淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的先后顺序，分别按照终浓度0.2~5U/mL、2~5U/mL、 13~25U/mL、40~250U/mL的添加量在pH 5.0~6.5和温度50°(：~60°(：条件下相继分别作用 1~6h完成催化。
【文档编号】C12P19/14GK105925550SQ201610461264
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】牛丹丹
【申请人】福州大学