专利名称：一种鉴定双歧杆菌的方法
技术领域：
本发明涉及双歧杆菌，特别是一种鉴定双歧杆菌的分子生物学方法。更准确地说， 本发明提供了一种通过对双歧杆菌16S rRNA基因上两段目标片段和丙酮酸激酶基因上一 段目标片段进行PCR (Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应，简称PCR)扩增和测序 分析，将双歧杆菌菌株鉴定到种水平的方法。
背景技术：
双歧杆菌属革兰氏阳性菌，是一种专性厌氧菌，具有多形态特性，但是总体看来 其具有“有分叉”的典型形态特征。依据《伯杰氏细菌鉴定手册》中的描述，双歧杆菌属 (Bifidobacterium)归属于放线菌纲(Actinobacteria)双歧杆菌目(Bifidobacteriales) 双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)。1899年法国巴斯德研究院Tisser博士首次从母乳喂 养的婴儿粪便中发现双歧杆菌。一个世纪的研究与实践表明，双歧杆菌是人和动物肠道中 对机体有益的生理性细菌，它在婴儿出生数小时后便在其肠道内定植，直至生命终结，与人 的健康长寿息息相关。大量国内外微生态学研究表明，双歧杆菌具有调节人体肠道菌群的 微生态平衡及抑菌、防癌、营养等多种功效。正因如此，对双歧制品的研究已成为近年研究 的热点。但是，迄今为止，国际国内尚无统一的可将双歧杆菌菌株准确鉴定至种水平的方 法。随着双歧杆菌菌株在益生菌制剂方面越来越广泛的应用，双歧杆菌菌种的鉴定越 发显得重要，甚至需要鉴定至种的水平。细菌传统的鉴定方法主要是依据其形态学及生理 生化等特性进行的，由于双歧杆菌形态的多变性以及专性厌氧和营养要求的复杂性，采用 糖发酵等方法往往无法将性状相近的双歧杆菌菌种区分至种的水平。随着近年来分子生物 学的发展，采用分子生物学方法对双歧杆菌进行属、种水平鉴定已有较大进展。目前的双歧 杆菌分子生物学检测技术主要可包括三大类(1)基于特异性核酸前体或探针的直接检测 鉴定；(2)基于分子标记技术的检测鉴定；(3)基于PCR相关技术的检测鉴定。16S rRNA基因序列分析是目前最常见的分子生物学鉴定技术之一，对双歧杆 菌16S rRNA基因部分序列的分析能通过属特异性的PCR引物或寡核苷酸探针将双歧杆 菌属从一堆形态相似的细菌中分离开来。但是因为16S rRNA基因序列是高度保守的，某 些种的双歧杆菌之间16S rRNA基因序列差别很小，所以它很难用来明确地将细菌区分到 禾中的水平(Rossello-Mora & Amman(2001), Thespecies concept for prokaryotes. FEMS Microbiology Reviews, 25 :39_67)，我们需要寻求一种能够方便快速地鉴定双歧杆菌菌株 至种水平的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种方便、快速、准确地鉴定双歧杆菌的方法，该方法可以将 双歧杆菌菌株鉴定到种的水平，有利于双歧杆菌菌株的分类及研究工作。为解决上述技术问题，本发明是这样实现的
—种鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于，采用PCR扩增和序列比对分析方法，将双 歧杆菌菌株鉴定到种或亚种的水平。所述鉴定双歧杆菌的方法包括如下步骤(1)设计合适的PCR引物对；(2)使用所述PCR引物对扩增待测双歧杆菌的DNA溶液，得到所述待测双歧杆菌的 扩增产物；(3)对所述扩增产物进行测序分析，综合序列分析结果，在美国国立生物技术信息 中心的双歧杆菌序列数据库中寻找序列同源性最高的菌株，由此鉴定双歧杆菌至种及亚种 水平。所述PCR引物对是Bif500引物对、Bif900引物对和Pk300引物对。所述Bif500 引物对是序列为 5，-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3，的 Bif500F 和序 列为 5，-CCA CCG TTA CAC CGG GAA-3，的 Bif500R ；所述 Bif900 引物对是序列为 5，-ATA ATG CGG CCG CAC GGG CGG TGT GTR C-3，的 Bif900F 和序列为 5，-TAA TAG CGG CCG CAG CMG CCG CGG TAA TWC-3，的Bif900R ；所述Pk300 引物对是序列为 5，_TM TCG ATG ATG GCA AGG TCC G-3，的 Pk300F 和序列为 5，-TAA TAC GCG GGC TAC CAT GAT GCC-3，的 Pk300R。所述扩增产物是双歧杆菌16S rRNA基因的500bp目标片段、16S rRNA基因的 900bp目标片段和丙酮酸激酶基因的300bp目标片段。所述16S rRNA基因的500bp目标片段按如下条件设置PCR扩增体系的反应条件 ① 94°C，10min ；② 80°C保持，加 Taq 酶；③ 94°C，lmin ；④ 62°C，lmin ；⑤ 72°C，2min ；⑥第 3 5步重复34个循环；⑦72°C，4min ；⑧4°C保持。所述16S rRNA基因的900bp目标片段按如下条件设置PCR扩增体系的反应条件 ① 94°C，10min ；② 80°C保持，加 Taq 酶；③ 94°C，lmin ；④ 45°C，lmin ；⑤ 72°C，2min ；⑥第 3 5步重复29个循环；⑦72°C，4min ’⑧4°C保持。所述丙酮酸激酶基因的300bp目标片段按如下条件设置PCR扩增体系的反应条 件① 94°C，IOmin ；② 80°C保持，加 Taq 酶；③ 94°C，Imin ；④ 45°C，lmin ；⑤ 72°C，2min ；⑥ 第3 5步重复29个循环；⑦72°C，4min ；⑧4°C保持。
图1是实施例中Bif500F和Bif500R引物对PCR扩增产物的电泳图；图2是实施例中Bif900F和Bif900R引物对PCR扩增产物的电泳图；图3是实施例中Pk300F和Pk300R引物对PCR扩增产物的电泳图；其中，图1、图2、图3中的M是DNA250bp的梯形条带，1是空白对照液，2是菌株 BL99被扩增获得的目标片段，3是菌株BL88被扩增获得的目标片段，4是菌株BB8被扩增获 得的目标片段，5是菌株BB47被扩增获得的目标片段。
具体实施例方式下面，通过以下实施例对本发明作进一步说明，它将有助于理解本发明，但并不限 制本发明的内容。本发明提供了一种鉴定双歧杆菌的方法，主要技术方案就是以三对引物，分别扩增其16S rRNA基因上的两段目标片段和丙酮酸激酶基因上的一段目标片段，扩增产物经测 序后，与GenBank中已知菌种序列进行比对分析，鉴定双歧杆菌。具体情况详述如下1.培养基与培养条件均采用MRS液体培养基，37°C厌氧培养24小时。2. DNA 的提取(1)吸取Iml待测菌株培养液，IOOOOrpm离心3min，弃去上清液；(2)加入Iml无菌TE buffer重悬菌体，IOOOOrpm离心3min，弃去上清液；(3)重复步骤⑵一次，再次加入Iml的TE buffer和100 μ L的10% SDS溶液，
重悬菌体；(4)将上述菌悬液用细胞破壁仪进行破壁，振荡强度系数4. 0，持续时间40s，重复 6次；(5)破壁后的液体IOOOOrpm离心3min，将上清液转至新的无菌离心管中；(6)加入等体积Tris-饱和酚(pH 8. 0)溶液，颠倒混勻后，静置IOmin ；(7)将上清液转移至新离心管中，加入等体积的有机溶液(该有机溶剂是酚氯 仿异戊醇的体积比为25 24 1的混合溶剂)，颠倒混勻后，静置IOmin ；(8)将步骤(7)最后得到的上清液转移至新离心管中，加入上清液十分之一体积 的3M NaAc溶液，再加入上清液2倍体积的95%乙醇，颠倒混勻，可见白色絮状沉淀；(9) IOOOOrpm离心lmin，弃上清液，用70%乙醇溶液洗涤沉淀两次，晾干沉淀；(10)加入IOOul灭菌蒸馏水溶解均勻，-20°C保存。3.引物设计(1) 16S rDNA 基因片段 Bif500 引物对正向引物Bif500F :5，-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3，反向引物Bif500R :5，-CCA CCG TTA CAC CGG GAA-3，(2) 16S rDNA 基因片段 Bif9OO 引物对正向引物Bif900F :5，-ATA ATG CGG CCG CAC GGG CGG TGT GTRC-3，反向引物Bif900R :5，-TAA TAG CGG CCG CAG CMG CCG CGG TAATWC-3，(3)丙酮酸激酶基因片段Pk300弓丨物对正向引物Pk300F :5，-TAA TCG ATG ATG GCA AGG TCC G-3，反向引物Pk300R :5，-TAA TAC GCG GGC TAC CAT GAT GCC-3，4. PCR反应体系总体积50μ 1 无菌蒸馏水 34. 5μ l，10XBuffer 5 μ 1, dNTP 4μ1，正向引物 (2. 5mM)2y 1，反向引物(2. 5mM)2y 1，DNA 模板 2 μ 1，DNA 聚合酶 0· 5 μ 1。5. PCR反应程序(1) 16S rRNA基因500bp片段的PCR扩增程序按如下条件设置PCR扩增体系的反应条件①94°C，IOmin ；②80°C保持，加Taq 酶；③94°C，Imin ；④62°C，lmin ；⑤72°C，2min ；⑥第3 5步重复34个循环；⑦72°C， 4min ；⑧4°C保持。由此，得到与所述样本溶液相对应的16S rRNA基因500bp片段的扩增产物。(2) 16S rRNA基因900bp片段的PCR扩增程序
按如下条件设置PCR扩增体系的反应条件①94°C，IOmin ；②80°C保持，加Taq 酶；③94°C，Imin ；④45°C，Imin ；⑤72°C，2min ；⑥第3 5步重复29个循环；⑦72°C， 4min ；⑧4°C保持。由此，得到与所述样本溶液相对应的16S rRNA基因900bp片段的扩增产物。(3)丙酮酸激酶基因300bp片段的PCR扩增程序按如下条件设置PCR扩增体系的反应条件①94°C，IOmin ；②80°C保持，加Taq 酶；③94°C，Imin ；④45°C，Imin ；⑤72°C，2min ；⑥第3 5步重复29个循环；⑦72°C， 4min ’⑧4°C保持。由此，得到与所述样本溶液相对应的丙酮酸激酶基因300bp片段的扩增产物。6.分析方法(1)琼脂糖凝胶电泳PCR产物进行1. 2%琼脂糖凝胶电泳以确定PCR反应结果。(2)测序PCR产物经纯化后送测序公司测序。(3)序列比对分析将得到的待鉴定菌株的序列与美国国立生物技术信息中心 (NCBI)的GenBank数据库中已知双歧杆菌的序列进行比对，综合分析三段目标片段序列的 比对结果，得出与待鉴定菌株同源性最高的双歧杆菌菌种，即为最终鉴定结果。实施例1乳双歧杆菌BL99的鉴定乳双歧杆菌菌株BL99在MRS液体培养基中厌氧培养24小时后，取Iml菌液提取 基因组DNA，以该菌株的DNA为模板，以属特异性引物对Bif500F &Bif500R为引物进行PCR 扩增，菌株BL99可以被扩增获得约500bp的目标片段，表示该菌株属于双歧杆菌属；同时以 引物对Bif900F & Bif900R及Pk300F &Pk00R进行PCR扩增，扩增产物的电泳图如图1所不。将获得的三段目标基因片段分别纯化测序，得到如下结果目标片段一(Bif500引物对)比对结果同源性最高的菌株有动物双歧杆菌乳 双歧亚种(B. animalis supsp. Iactis)，动物双歧杆菌动物双歧亚种(B. animal is supsp. animalis)。该目标片段序列如图4-1所示。目标片段二(Bif900弓丨物对)比对结果同源性最高的菌株有动物双歧杆菌乳双 歧亚种(B. animalis supsp. Iactis)，青春双歧杆菌(B. adolescentis)，动物双歧杆菌动物 双歧亚种(B. animalis supsp. animalis)。该目标片段序列如图4-2所示。目标片段三(Pk300引物对)比对结果假小链双歧杆菌(B. pseudolongum)， 动物双歧杆菌(B. animalis)，婴儿双歧杆菌(B. infantis)，动物双歧杆菌乳双歧亚种 (B. animalis supsp. Iactis)。该目标片段序列如图4-3所示。综合以上三段目标基因片段的序列分析结果，将该菌株鉴定为动物双歧杆菌乳双 歧亚种。实施例2长双歧杆菌的鉴定BL88-0nlly长双歧杆菌菌株BL88在MRS液体培养基中厌氧培养24小时后，取Iml菌液提取 基因组DNA，以该菌的DNA为模板，以属特异性引物对Bif500F &Bif500R为引物进行PCR扩 增，菌株BL88-0nl Iy可以被扩增获得约500bp的目标片段，表示该菌株属于双歧杆菌属。同 时以引物对Bif900F & Bif900R及Pk300F& PkOOR进行PCR扩增，扩增产物的电泳图如图 1所示。
将获得的三段目标基因片段分别纯化测序，得到如下结果目标片段一(Bif500引物对)比对结果同源性最高的菌株有长双歧杆菌长双歧 亚种(B. Iongum subsp. Iongum)，婴儿双歧杆菌(B. infantis)，长双歧杆菌婴儿双歧亚种 (B. Iongum bv. Infantis)。该目标片段序列如图5-1所示。目标片段二(Bif900引物对)比对结果长双歧杆菌长双歧亚种(B. Iongum subsp. Iongum)，长双歧杆菌(B. Iongum)。该目标片段序列如图5_2所示。目标片段三(Pk300引物对)比对结果长双歧杆菌(B. Iongum subsp. Iongum)， 长双歧杆菌长双歧亚种(B. Iongum subsp. Iongum)。该目标片段序列如图5_3所示。综合以上三段目标基因片段的序列分析结果，将该菌株鉴定为长双歧杆菌长双歧 亚种。实施例3短双歧杆菌鉴定BB8短双歧杆菌菌株BB8在MRS液体培养基中厌氧培养24小时后，取Iml菌液提取基 因组DNA，以该菌的DNA为模板，以属特异性引物对Bif500F &Bif500R为引物进行PCR扩 增，菌株BB8可以被扩增获得约500bp的目标片段，表示该菌株属于双歧杆菌属。同时以引 物对Bif900F & Bif900R及Pk300F &PkOOR进行PCR扩增，扩增产物的电泳图如图1所示。将获得的三段目标基因片段分别纯化测序，得到如下结果目标片段一(Bif500引物对)比对结果同源性最高的菌株短双歧杆菌B. breve。 该目标片段序列如图6-1所示。目标片段二(Bif900引物对)比对结果同源性最高的菌株短双歧杆菌B. breve。 该目标片段序列如图6-2所示。目标片段三(Pk300引物对)比对结果同源性最高的菌株短双歧杆菌B. breve。 该目标片段序列如图6-3所示。综合以上三段目标基因片段的序列分析结果，将该菌株鉴定为短双歧杆菌。
实施例4两歧双歧杆菌BB47的鉴定两歧双歧杆菌菌株BB47在MRS液体培养基中厌氧培养24小时后，取Iml菌液提 取基因组DNA，以该菌的DNA为模板，以属特异性引物对Bif500F &Bif500R为引物进行PCR 扩增，菌株BB47可以被扩增获得约500bp的目标片段，表示该菌株属于双歧杆菌属。同时 以引物对Bif900F & Bif900R及Pk300F &PkOOR进行PCR扩增，扩增产物的电泳图如图1所示。将获得的三段目标基因片段分别纯化测序，得到如下结果目标片段一(Bif50引物对)比对结果同源性最高的菌株两歧双歧杆菌 (B.bifidum)。该目标片段序列如图7-1所示。目标片段二(Bif90引物对)比对结果同源性最高的菌株两歧双歧杆菌 (B. bifidum)。该目标片段序列如图7-2所示目标片段三(Pk300引物对)比对结果同源性最高的菌株两歧双歧杆菌 (B.bifidum)。该目标片段序列如图7-3所示。综合以上三段目标基因片段的序列分析结果，将该菌株鉴定两歧双歧杆菌 (B. bifidum)。本发明方法的作用原理是
16S rRNA基因序列分析是目前最常见的分子生物学鉴定技术之一。其过程包括 设计引物、PCR扩增16S rRNA基因(全长或片段)、测序、序列比对分析等关键的几个步骤。 rRNA作为基本上所有生物体必须的组成物之一，序列中的大部分具有高度的保守性，而且 rRNA的基因在细菌内具有高拷贝数，所以rRNA序列分析被用作作为双歧杆菌菌种鉴定。细 菌的rRNA主要有5S、16S和23S rRNA三种，编码它们的基因核苷酸长度分别大约为120bp、 1540bp和3000bp，从所需信息量和测序成本的角度看，16S rRNA的基因片段长度既能提供 足够长度的序列信息，又不会如3000bp的23S rRNA测序需要的成本那么高，所以在三者中 被选中。利用16S rRNA两翼保守序列设计的引物，能够作为属通用引物扩增几乎所有的 双歧杆菌菌种的相应基因，扩增的片段内部序列的差异，反映了双歧杆菌的进化，导致了 不同种的形成，也就是说，相对可变的非固定保守区的序列差异是序列比对鉴定的依据。 GenBank上有大量的科研工作者辛勤的劳动提供的基因序列信息，为序列比对鉴定菌种打 下了坚实的基础。但是有些双歧杆菌种间的16SrRNA基因序列差别很小，不足以进行种和亚种间的 区分，只能严格地鉴定出这些分离菌株约10%的数量。因此除了利用16SrRNA这个保守基 因外，还需要采用另一个与细菌代谢相关的基因——丙酮酸激酶(pyruvate kinase)基因 序列进行分析。通过比较约40个丙酮酸激酶蛋白的氨基酸序列，我们合成了能够扩增菌株 相应基因片段的两段引物。依据这些丙酮酸激酶部分基因序列片段分析，可以区分一些在 鉴定时非常具争论性的菌株，比如动物双歧杆菌(B. animal is)和乳双歧杆菌(B. Iactis), 婴儿双歧杆菌(B. infantis)和长双歧杆菌(B. Iongum)之间的区分和鉴定。因此，将两段16S rRNA基因片段序列与丙酮酸激酶基因片段序列相结合，可以提 高双歧杆菌鉴定的准确性，做到种及亚种水平的鉴定。
权利要求
1.一种鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于，采用PCR扩增和序列比对分析方法，将双歧 杆菌菌株鉴定到种或亚种的水平。
2.根据权利要求1所述的鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤(1)设计合适的PCR引物对；(2)使用所述PCR引物对扩增待测双歧杆菌的DNA溶液，得到所述待测双歧杆菌的扩增 产物；(3)对所述扩增产物进行测序分析，综合序列分析结果，在美国国立生物技术信息中 心的双歧杆菌序列数据库中寻找序列同源性最高的菌株，由此鉴定双歧杆菌至种及亚种水平。
3.根据权利要求2所述的鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于，所述PCR引物对是 Bif500引物对、Bif900引物对和Pk300引物对。
4.根据权利要求3所述的鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于，所述Bif500引物对是 序列为 5，-CAT CCG GCA TTA CCA CCC-3，的 Bif500F 和序列为 5，-CCACCG TTA CAC CGG GAA-3，的 Bif500R ；所述Bif900 引物对是序列为 5，-ATMTG CGG CCG CAC GGG CGG TGT GTR C-3，的 Bif900F 和序列为 5，-TAA TAGCGG CCG CAG CMG CCG CGG TAA TWC-3，的 Bif900R ； 所述Pk300引物对是序列为5，-TAA TCG ATG ATG GCA AGG TCC G-3，的Pk300F和序列为 5' -TAATAC GCG GGC TAC CAT GAT GCC-3'的 Pk300Ro
5.根据权利要求2所述的鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于，所述扩增产物是双歧杆 菌16S rRNA基因的500bp目标片段、16S rRNA基因的900bp目标片段和丙酮酸激酶基因的 300bp目标片段。
6.根据权利要求5所述的鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于，所述16SrRNA基因的 500bp目标片段按如下条件设置PCR扩增体系的反应条件①94°C，IOmin ；②80°C保持，加 Taq 酶；③ 94°C，Imin ；④ 62°C，Imin ；⑤ 72°C，2min ；⑥第 3 5 步重复 34 个循环；⑦ 72°C， 4min ；⑧4°C保持。
7.根据权利要求5所述的鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于，所述16SrRNA基因的 900bp目标片段按如下条件设置PCR扩增体系的反应条件①94°C，IOmin ；②80°C保持，加 Taq 酶；③ 94°C，Imin ④ 45°C，Imin ；⑤ 72°C，2min ；⑥第 3 5 步重复 29 个循环；⑦ 72°C， 4min ；⑧4°C保持。
8.根据权利要求5所述的鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于，所述丙酮酸激酶基因的 300bp目标片段按如下条件设置PCR扩增体系的反应条件①94°C，IOmin ；②80°C保持，加 Taq 酶；③ 94°C，Imin ；④ 45°C，Imin ；⑤ 72°C，2min ；⑥第 3 5 步重复 29 个循环；⑦ 72°C， 4min⑧4°C保持。
全文摘要
本发明涉及一种鉴定双歧杆菌的方法，具体涉及一种新的鉴定双歧杆菌的分子生物学方法。该方法通过对双歧杆菌16SrDNA上两段目标基因片段及丙酮酸激酶编码基因上一段目标基因片段的PCR扩增和测序分析，可以将双歧杆菌菌株鉴定到种的水平。本发明将为双歧杆菌鉴定提供一种更加准确、更易于操作的实用方法，有利于双歧杆菌菌株的分类及研究工作。
文档编号C12Q1/68GK102108400SQ20101057824
公开日2011年6月29日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者张和春, 张旻, 杭晓敏, 陈培青 申请人:上海交大昂立股份有限公司