专利名称：一种石莼孢子的采集和培养方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种石莼孢子的采集和培养方法。
背景技术：
根据我国沿海各海区污损生物的调查结果可以看出，石莼、浒苔、水云等大型藻类 均为秋、冬、春季节常见的藻类污损生物优势种。藻类的附着会显著增大波浪和海流对海洋 设施产生的动力载荷效应，引发漂移甚至倾覆；堵塞水产养殖网箱、笼具、围网等的网孔，影 响内外环境水体交换，降低内部环境的溶解氧，妨碍养殖对象的正常生长发育。
石莼(Ulva lactuca)可食用和药用，多生长在中、低潮带的岩石上或石沼中，也可 附生在大型海藻和各类人工设施上，在世界各地沿海均有分布，中国则多分布在中国东海 和南海沿岸。其藻体一般高10 30cm，最高可达40cm，黄绿色，近似卵圆形，边缘稍呈波 状，或呈广宽的叶片状，为两层细胞构成的膜状体，基部由营养细胞延伸成假根丝，形成固 着器。通过无性生殖和有性生殖方式进行繁殖。生活史属于同形世代交替，由孢子体和配 子体两种世代的同形藻体交替出现以延续后代。生长盛期在2 6月，为秋、冬、春期间主 要污损性藻类。 目前，有关石莼的研究涉及化学组分、生理生态、分类遗传等方面，近来Bhattarai 等人还报道了孔石莼(U.pertusa)和裂片石莼(U. fasciata)孢子低温储存技术以期在污 染、附着机理和防除测试等领域应用。然而，该方法不仅没涉及石莼孢子的采集技术，而且
整个过程较为烦琐、复杂首先把新鲜采集、用过滤海水洗净的藻体浸泡在4t:氨苄青霉素 浓度为100i! g/ml的f/2配方培养基中1天，再用高压消毒海水漂洗，然后室温下在层流洁 净台上干燥10小时，再浸泡于过滤海水中10分钟，4000rpm离心5分钟收集释放的游孢子， 最后通过光吸引选择活泼的游孢子。 为便于开展防污剂筛选和环保监测方面的研究工作，简化、縮短孢子采集过程和 掌握孢子附着萌发培养技术极为关键。另外，考虑到石莼又是重要的经济海藻，具有较高的 营养和药用价值，掌握其孢子采集和培养技术，在大规模养殖和人工栽培领域也具有广阔 的应用前景。 可以说，现有技术中并没有探讨大量采集石莼游孢子的方法，而且也没有提出借 助何种方法和设备可简便、持续、稳定地大量获得其游孢子并对其进行培养。因此，了解和 掌握石莼孢子大量采集的方法和在此基础上的培养技术，是本技术领域中亟待开发的。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种通过人工生物培养技术，能在小 水体中短时间内采集到大量石莼孢子并进行培养的方法。
本发明通过以下技术方案实现上述目的 —种石莼孢子的采集和培养方法，是取成熟的石莼片段置于载玻片上并滴加适量 海水，用光照强度3500 4200Lx的光照射剌激，时间控制在10分钟以内(具体时间的长
3短取决于孢子释放状况，且需适时滴加少量海水防止蒸发导致藻体干枯)，发现游孢子大量 释放时即将其收集，收集后进行培养。 本发明上述的方法优选是在显微镜下完成，并利用显微镜的内置光源来照射；承 载成熟的石莼片段优选采用载玻片，但载玻片并非本发明实施的唯一方式，与载玻片起到 相同或相近似作用的承载物仍然是本发明的保护范围。
所述成熟的石莼是指黄绿色、边缘呈褐色的藻体。 为更好地实施本发明，在上述采集方法的基础上，本发明还可进一步进行培养，所 述培养是完成采集后将采集到的游孢子计数并用海水稀释至特定浓度，室温下置于黑暗环 境中使其均匀分布，均匀分布后进行间歇性光照培养。 孢子采集是观察分析藻类孢子附着萌发状况的基础，没有足够数量的孢子就不能 满足生物统计分析的要求，从而妨碍利用这种我国沿海常见的大型海洋藻类孢子开展防除 测试及环境监测等方面的工作；然而，如果没有一个适当的孢子附着萌发培养技术来匹配， 即使能采集到大量孢子仍然无法开展相关方面的研究，因此，孢子采集和培养技术的这两 个环节是相互相承、作为一个专有技术的整体而存在，任一环节的缺失都不能完成相关测 试分析工作，故将其分割开来仅掌握其中一个方面没有任何意义。 所述室温下进行间歇性光照培养是每天光照强度为900 1300Lx照射12小时， 培养4天为优选方案；室温为26 28°C 。 所述用海水稀释至特定浓度是为了将游孢子接种培养时的密度调整为3. 5X10—2 个/mm2;本发明采用这一孢子密度进行接种培养，是因为该密度下最易进行观察和操作，能 更好地实施本发明。 所述黑暗环境下使游孢子均匀分布的时间为2小时，这是由于游孢子具趋光性， 在黑暗环境下可使之均匀分布在培养皿底部；本发明所述的2小时是优选方案。
所述海水为天然海水，但为更好地实现为本发明，海水需经过滤、煮沸消毒、冷却 至室温的消毒处理后，放置于经高温消毒的器皿中备用。 本发明所述培石莼孢子的培养在直径为60mm左右的培养皿中进行，是一种在小 水体中培养石莼孢子的方法。 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果本发明为本技术领域提供了一种简 便可行的大量采集石莼孢子并进行培养观察其附着萌发状况的方法，填充了这一技术领域 中的空白。 本发明通过对成熟的石莼进行强光照射，可促进游孢子的释放，满足大量采集的 需要。本发明的培养方法操作简便，实用性强，周期短，对藻体成熟度要求不高，不仅可稳定 持续获得石莼孢子，而且产量大，孢子繁殖力强，并便于观察其附着萌发状况，为大规模人 工培养奠定了技术基础，可用于解决稳定、持续、大量获得其孢子的难题，确保防污测试、环 境毒理研究、培苗育种等方面工作的顺利进行，满足基础研究和应用开发等领域工作的需 要，在海藻养殖及防除测试研究等方面具有广阔的应用前景。
具体实施例方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
培养介质为天然海水，海水经过滤、煮沸消毒、冷却至室温后，放置于经高温消毒 的器皿中备用。 将采集的新鲜石莼置于消毒海水中通气暂养。 取黄绿色、边缘呈褐色藻体约2cm于载玻片上并滴加少量消毒海水，置于Nikon MD-TS100型显微镜载物台上。 孢子采集试验分三个组，分别为A组，光强度3500Lx ;B组，光强度500 3000Lx ; C组，对照组，室内自然光照射。光照时间均为IO分钟，期间适时滴加海水防止蒸发导致藻 体干枯。镜检，用吸管吸取释放的发现游孢子，即以吸管吸取，置于50ml小烧杯中备用。重 复以上步骤继续采集孢子2次。另换新鲜藻体片段，重复上述步骤采集孢子。
实验结果表明，B组和C组的光照强度对藻体的成熟度要求较高，常因藻体成熟度 较差而不能有效地释放足够数量的孢子；A组光照强度则较为理想，在其剌激下，能稳定、 持续、大量获得所需孢子。可见，强度为3500Lx的光照射可促进游孢子的释放，方便在短时 间内大量采集游孢子。
实施例2 培养介质为天然海水，海水经过滤、煮沸消毒、冷却至室温后，放置于经高温消毒 的器皿中备用。 将采集的新鲜石莼置于消毒海水中通气暂养。 取黄绿色、边缘呈褐色藻体约2cm于载玻片上并滴加少量消毒海水，置于Nikon MD-TS100型显微镜载物台上，以4000Lx的光照强度剌激5分钟。镜检发现游孢子即以吸管 吸取，置于50ml小烧杯中备用。重复以上步骤继续采集孢子2次。另换新鲜藻体片段，重 复上述步骤采集孢子。 取少量烧杯中的孢子液于血球计数板进行计数，确定每毫升水体中游孢子的数 量，用消毒海水将其稀释为浓度不同的孢子液稀释液。 将孢子液稀释液置于直径为60mm培养皿中，置于黑暗环境下培养2小时后游孢子 均匀分布，再移至光照藻类培养架上，每天光照12小时，光照强度为900Lx，26 2『C下培
养4天。 实验分5个组进行，区别在于孢子的接种密度分别为1. 7X 10—2个/mm2 ;3. 5X 10—2 个/mm2 ;1. 7X10—1个/mm2 ;3. 5 X 10—1个/mm2 ;7. 0 X 10—1个/mm2。 实验结果表明，当接种培养时孢子密度大于或等于1. 7X 10—1个/mm2时，可以发现 培养皿底部附着萌发的孢子数量过多，密度极大，严重妨碍统计观察的进行；而当孢子密度 为3. 5 X 10—2个/mm2时，附着在培养皿底部的孢子数量最为合适，便于观察统计其附着萌发 状况。 实施例3 培养介质为天然海水，海水经过滤、煮沸消毒、冷却至室温后，放置于经高温消毒 的器皿中备用。 将采集的新鲜石莼置于消毒海水中通气暂养。 取黄绿色、边缘呈褐色藻体约2cm于载玻片上并滴加少量消毒海水，置于Nikon MD-TS100型显微镜载物台上，以420Q Lx的光照强度剌激3分钟。镜检发现游孢子释放即 以吸管吸取，置于50ml小烧杯中备用。重复以上步骤继续采集孢子2次。另换新鲜藻体片段，重复上述步骤采集孢子。 取少量烧杯中的孢子液于血球计数板进行计数，确定每毫升水体中游孢子的数 量，用消毒海水将其稀释为浓度为不同浓度的孢子液稀释液。 将孢子液稀释液置于直径为60mm培养皿中，置于黑暗环境下培养2小时后游孢子 均匀分布，再移至光照藻类培养架上，每天光照12时，光照强度为1300Lx，26 2『C下培养。 实验分三个组进行，区别在于培养时间分别为2天、4天和6天。 实验结果表明，当培养时间为2天时，孢子尚未萌发，不便观察；而当培养时间为6
天时，孢子已发育形成完整的幼孢子体；当培养时间为4天时，孢子开始发育形成叶状体的
细胞团，故此时观察孢子的附着萌发状况最为理想。
权利要求
一种石莼孢子的采集和培养方法，其特征是取成熟的石莼片段置于载玻片上并滴加海水，用光照强度3500～4200Lx的光照射刺激，发现游孢子释放即将其收集，收集后进行培养。
2. 如权利要求1所述的采集和培养方法，其特征在于所述光照的光源采用显微镜的内置光源；所述光照射剌激的时间不超过10分钟。
3. 如权利要求2所述的采集和培养方法，其特征在于所述培养是将收集到的游孢子用海水稀释，室温下置于黑暗环境中使其均匀分布，均匀分布后进行间歇性光照培养。
4. 如权利要求3所述的采集和培养方法，其特征在于所述室温下进行间歇性光照培养是每天光照强度为900 1300Lx照射12小时，培养4天，室温为26 28°C 。
5. 如权利要求4所述的采集和培养方法，其特征在于所述游孢子的接种密度为3. 5X10—2个/mm2 。
6. 如权利要求5所述的采集和培养方法，其特征在于所述置于黑暗环境下使游孢子均匀分布时间为2小时。
7. 如权利要求1 6所述的任一种采集和培养方法，其特征在于所述海水经过滤、煮沸消毒、冷却至室温的消毒处理。
全文摘要
本发明公开了一种石莼孢子的采集和培养方法，是取成熟的石莼片段置于载玻片上并滴加海水，用光照强度3500～4200Lx的光照射刺激，发现游孢子释放即将其收集，然后进行培养。本发明通过对成熟的石莼进行强光照射，可促使游孢子的释放，满足大量采集的需要；本发明的采集培养方法操作简便实用，对藻体成熟度要求不高，不仅可为实验工作稳定持续提供具备正常生长发育能力的大量孢子，而且便于大批量观察孢子的附着萌发状况。所提供的方法填补了石莼孢子采集培养领域的空白，为大规模人工培养奠定了技术基础，在海藻养殖及防除测试研究等方面具有广阔的应用前景。
文档编号A01G33/00GK101692787SQ200910042348
公开日2010年4月14日 申请日期2009年9月1日 优先权日2009年9月1日
发明者严涛, 刘姗姗, 谢恩义 申请人:中国科学院南海海洋研究所;