黄瓜游离小孢子的培养方法

专利名称：黄瓜游离小孢子的培养方法
技术领域：
本发明是黄瓜游离小孢子的培养方法，涉及黄瓜小孢子游离、纯化及悬浮液制备和 游离小孢子培养方法，属于生物技术科学领域。
背景技术：
单倍体是指仅携有配子染色体数目的个体，在作物育种实践和遗传育种理论研究中 均具有重要意义。单倍体经染色体加倍即可获得纯合的双单倍体。在育种实践中，对单 倍体进行染色体加倍当代就可以获得纯系即双单倍体群体，而利用常规育种手段培育自 交系需要6 7年，甚至更长的时间。同时，双单倍体是绝对纯合的，基因型与表现型完 全一致，而通过高代自交获得的自交系仍会有少数位点是杂合的。因此，利用单倍体或 双单倍体进行新品种选育和品种改良可以大大縮短育种周期，提高选择效率。在遗传育 种理论研究中，双单倍体在遗传上具有绝对的纯合性，是进行AFLP、 RFLP和RAPD等 分子标记和遗传图谱绘制研究的良好材料，也是进行物种进化研究、遗传分析和植物基 因克隆筛选的理想材料。此外，从一些特殊材料中诱导获得的单倍体具有特异的染色体 组成，如单体、三体和易位系等。譬如对远缘杂交种Fi进行花粉培养可以得到异源附加 系、代换系和异位系等。这些材料都是非常好的染色体工程材料。
单倍体材料的获得途径包括自然发生单倍体及人工诱导单倍体。前者发生频率极低，
难以应用。目前人工诱导单倍体的方法主要有化学药剂诱导孤雌生殖获得单倍体、种间 远缘授粉或辐射花粉授粉诱导孤雌生殖获得单倍体、延迟授粉、未授粉子房和胚珠培养、 花药培养和游离小孢子培养等。其中前3种方法需要种植较大的植株群体进行人工诱导， 工作量巨大，周期长，耗时耗力，成本较高且诱导率低，难以利用；而未授粉子房和胚 珠培养、花药培养胚状体诱导率和植株再生率较低，并存在体细胞干扰的问题，对再生 植株鉴定的工作量增大。而游离小孢子培养与其他几个方法相比具有明显的优势直接 从花药或者花蕾中游离出来的小孢子是天然分散的单倍体细胞，数量巨大，基因型丰富， 便于进行多种遗传操作和研究小孢子离体发育机制，能够在较宽的基因范围内以较高的 诱导率得到小孢子胚和再生植株，可以排除体细胞影响，更易获得纯合体植株，小孢子 培养获得的植株后代一般表现整齐，生活力稳定。因此该技术越来越受到关注，应用最 为广泛，是人工获得单倍体的重要途径。同时，在游离小孢子培养过程中也有可能发生 染色体加倍，直接获得双单倍体材料。

发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种黄瓜游离小孢子培养方法，有效地游离纯化黄瓜小孢子，制备小孢子悬浮液，并进行小孢子离体培养获得再生植株。该方法可用于黄 瓜游离小孢子培养获得单倍体、双单倍体等黄瓜材料，也为其他作物的小孢子游离、纯 化、小孢子悬浮液制备及游离小孢子培养提供借鉴。
技术方案本发明提供了一种黄瓜游离小孢子的培养方法。其过程是将单核靠边期 小孢子从花药中游离出来，之后纯化小孢子、制备小孢子悬浮液进行游离小孢子培养， 获得再生植株。具体步骤如下
1) 取样与预处理在盛花期于晴天上午9: 00 10: OO从健壮植株上取花蕾。采用 显微镜镜检的方法鉴定小孢子发育时期。选取小孢子发育处于单核靠边期的花蕾进行低 温预处理。
2) 花蕾消毒将花蕾先在75%酒精溶液里浸30 s，然后用0.1%升汞消毒8 min，最 后用无菌水冲洗3次，每次30 60s;
3) 游离、纯化小孢子及悬浮液制备采用挤压法游离小孢子，使用过滤和离心的 方法纯化小孢子，之后用用液体培养基悬浮小孢子，并用血球计数板计数调整小孢子密度。
4) 胚状体诱导用直径60mm的培养皿分装小孢子悬浮液，用Parafilm封口膜封 口后，在25'C下静止暗培养至产生肉眼可见的胚状体，之后进行60fmin"振荡暗培养 至形成子叶形胚。
5) 胚状体萌发将子叶形胚转移至胚状体萌发培养基上，在25 °C、4000LX、16h-d—1 下光照培养，至形成无根苗或根较弱的再生植株。
6) 诱导生根与植株再生将无根苗以及根较弱的再生植株转接至生根培养基上，在 25°C、 4000 LX、 16tvd"下进行光照培养至形成健壮的根。
7) 驯化与移栽将生长健壮的再生植株从培养瓶中取出并用无菌水洗净培养基，然 后转移到装有灭菌土的育苗穴盘。将穴盘苗置于小拱棚中驯化，2周后将其移栽定植于大 棚温室。
8) 染色体鉴定参照陈劲枫和钱春桃(陈劲枫，钱春桃.利用几种园艺作物巻须制 片鉴定染色体数目的研究.园艺学报，2002,29 (4): 378 380)的方法对再生植株进行 体细胞染色体计数，确定其倍性。
9) SSR分析SSR以孟德尔方式遗传，呈共显性，可鉴别纯合子和杂合子。参照 Katzir (Katzir N， Danin Y, Tzuri G. Length polymorphism and homologies of microsatellites in several Cucurbitacese species. Theor. Appl. Genet, 1996, 93: 1282-1290)的方法在分子水平
(SSR)上鉴定再生植株的纯合性。 有益效果
1)本发明首次在黄瓜中利用游离小孢子培养获得了胚状体和双单倍体再生植株，可 用于研究离体雄核发育机制，同时双单倍体可作为育种材料，也可用于遗传分析、遗传图谱绘制等理论研究。
2) 黄瓜(C"c"m" L.)属葫芦科甜瓜属，是一种被广泛种植的重要的蔬菜 作物。然而，由于黄瓜遗传基础狭窄，种质资源有限，仅采用常规育种手段选育新品种 不仅耗时耗力、效率低，且难以使新品种在抗性和品质等方面有显著提高。而利用本发 明方法可快速获得纯系和突变体，不仅可以缩短育种年限，提高育种效率，而且可以提 供新的种质资源，使新品种在抗性和品质等方面得到显著提高。应用本发明获得的双单 倍体中性状优良的个体当代即可直接作为育种材料用于新品种的培育。
3) 双单倍体在遗传上具有绝对的纯合性，由其组成的群体是一个纯合的永久性群 体，可避免二倍体由于来自双亲的两条染色体在DNA碱基序列的细微差异，可以多年 多点对同一群体进行重复试验，从而大大提高基因定位标图的准确性，并且保证了研究 的延续性，所以是进行AFLP、 RFLP和RAPD等分子标记和遗传图谱绘制研究，以及物 种进化研究、遗传分析和植物基因克隆筛选等的理想材料。
4) 本发明是基于植物细胞全能性学说即植物体的每一个细胞都携带有一套完整的 基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力和对黄瓜小孢子游离、纯化方法和悬浮液 制备方法的研究及黄瓜游离小孢子培养影响因素包括基因型、小孢子发育时期、温度处 理和培养基成分等系统研究的工作基础。小孢子具有单倍性、结构简单、基因型丰富、 发育同步和群体数量大等优点，因此对小孢子进行离体培养可以更好地控制雄核发育条 件和研究雄核发育机制，可以快速获得多种基因型的单倍体或双单倍体材料。同时游离 小孢子培养是对单倍性的单个细胞进行培养，因此更易发生基因突变，扩大黄瓜基因池， 提供新种质。总之，本方法具有坚实的理论依据，科学性强、方法较简便，易于操作和 实际应用。


图l黄瓜游离小孢子培养的流程图 图2单核靠边期小孢子(200x)
图3黄瓜小孢子离体发育过程和植株再生。A.新接种的单核靠边期小孢子(200 x); B.膨大的细
胞(200 x)，箭头所指即为膨大的细胞；C培养4d后，细胞发生第一次均等分裂(200 x); D.培
养14d后，形成肉眼可见的球形胚(20 x); E.培养20d后形成的心形胚(40 x); F.培养30d后
形成的子叶形胚(20 x): G子叶形胚萌发及未能正常萌发的胚状体；H.根芽叶俱全的再生小植株
图4驯化再生植株
图5移栽定植后的再生植株
图6 染色体计数，2n- 14(1000x)
图7 SSR带型，CMAG59:引物代号
具体实施例方式
单倍体及双单倍体在作物遗传育种理论研究和育种实践中均具有重要意义和广阔的 应用前景。单倍体材料的获得途径包括自然发生单倍体及人工诱导单倍体。前者发生频 率极低；后者以游离小孢子培养应用最为广泛。游离小孢子培养是以从花药中游离出来 的小孢子作为外植体进行离体培养的一种方法。小孢子具有单倍性、结构简单、基因型 丰富、发育同步和群体数量大等优点，因此对小孢子进行离体培养可以更好地控制雄核 发育条件，快速获得多种基因型的单倍体或双单倍体材料，也更易发生基因突变，获得 新种质，扩大黄瓜基因池。我们应用本发明的方法，获得了双单倍体黄瓜材料。
本实例就以'Poinsett97'(杨寅桂，李为观，娄群峰，陈劲枫.黄瓜苗期热害症状 及其发生发展规律研究.中国瓜菜，2007(5):1 3)作为材料，采用本发明方法获取了双单 倍体。实施过程如下
1. 在盛花期于晴天上午9: 00 10: OO从健壮植株上取花蕾。采用显微镜镜检的方 法鉴定小孢子发育时期，即，将花药从花蕾中剥出，置于载玻片上，滴几滴去离子水浸 没花药，用镊子轻轧花药使小孢子游离出来，去除残留的花药组织，盖上盖玻片，在 OLYMPUS显微镜下鉴定小孢子发育时期。选取小孢子发育处于单核靠边期(图，2)的 花蕾用于游离小孢子培养。
2. 将小孢子发育处于单核靠边期的花蕾置于4 'C下低温预处理2d。
3. 将花蕾先在75免酒精溶液里浸30s，然后用0.1免升汞消毒8min，最后用无菌水冲 洗3次，每次30 60s。
4. 将消毒后的花蕾置于IO mL离心管中，加入4 5 mL配方为Bs+质量比13%蔗 糖，pH为5.8，经0.22 ^m微孔滤膜过滤灭菌的Bs-13提取液，用玻璃棒挤压花蕾使小 孢子释放出来；使用孔径为76的细胞筛过滤；滤液在600 r.min-1的转速下离心5 min， 重复离心3次，至上清无色透明；弃上清，用配方为NLN+0.5 mg丄4 2，4-D+0.2 mg-U1 6-BA+质量比13%蔗糖，pH为5.8，用0.22 /mi微孔滤膜过滤灭菌的液体培养基悬浮小 孢子；最后使用血球计数板计数，调整小孢子密度约为1.0x105个.mU1 (图2, A)。
5. 用直径60mm的培养皿分装小孢子悬浮液，每皿2mL，用Parafilm封口膜封口 后，在25 'C下进行静止暗培养，至产生肉眼可见的胚状体(图3， D和E)，之后进行 60rmii^振荡暗培养，至形成子叶形胚(图3， F)。
6. 将子叶形胚转移至配方为MS+0.2mg1—16-BA+质量比3%蔗糖+质量比0.8%琼脂， pH为5.8，在121 。C下高压灭菌20min的胚状体萌发培养基MS-BA上，在25 。C、4000LX、 16h《i下光照培养，20 25d后形成无根苗或根较弱的再生植株(图3， G)。
7. 将无根苗以及根较弱的再生植株转接至配方为MS+0.2 mg七—1 IBA+质量比3免蔗 糖+质量比0.8%琼脂，pH为5.8，在121 。C下高压灭菌20min的生根培养基MS-IBA上，在 25°C、 4000LX、 161vd—工下进行光照培养，10 d后即可获得大量的根，形成完整的再生植株(图3， H)。
8. 生长健壮的再生植株从培养瓶中取出并用无菌水洗净培养基,然后转移到装有的 在121 'C下高压灭菌20 min灭菌土 (蛭石草木灰=1:1)的育苗穴盘。将穴盘苗置于小 拱棚中驯化，相对湿度80 90%，温度20 25'C。 l周后揭开小拱棚，驯化2周后将再生 植株移栽定植于大棚温室(图4和5)。
9. 参照陈劲枫和钱春桃(陈劲枫，钱春桃.利用几种园艺作物巻须制片鉴定染色体 数目的研究.园艺学报，2002,29 (4): 378 380)的方法对再生植株进行体细胞染色体 计数，确定染色体数为2n-14，初步表明小孢子再生植株为双单倍体(图6)。
10. 通常供体材料SSR位点是杂合的，而双单倍体的位点为纯合的，所以可以利用 SSR手段在分子水平上鉴定再生植株的纯合性。参照Katzir等的方法(Katzir N, Danin Y， Tzuri G. Length polymorphism and homologies of microsatellites in several Cucurbitacese species. Theor. Appl. Genet, 1996， 93:1282-1290)检测SSR位点的多态性。由上海生工代 理合成16对SSR引物，扩增反应体系总体积25uL (其中dNTPs0.2mM;前后引物0.2 uM;模板DNA50ng; Taq酶lunit)。扩增反应在PTC-100 PCR仪中进行，反应条件为 94。C预变性5min; 94 。C30s， 55。C 30s， 72°C 80s， 35个循环;72。C延伸5min，最后在 4匸下保存。PCR产物在9X聚丙烯酰胺上电泳，采用改良的Charters的银染方法检测。 根据再生植株和供体二倍体材料'Poinsett97，经SSR分析后条带的类型来鉴定再生植株 的纯合性'Poinsett97'有两条带，小孢子单倍体再生植株只有一条，进一步表明小孢 子再生植株为双单倍体(图7)。
双单倍体在遗传上是绝对纯合的，基因型和表现型相一致。由双单倍体构成的群体 是一个稳定纯合的永久性群体。因此，双单倍体在黄瓜育种实践和理论研究中都具有十 分重要的意义。
首先，在黄瓜新品种培育和品种改良中利用双单倍体可以縮短育种周期，提高选择 效率。自交系选育是现代优势杂交育种的关键。采用传统育种手段需要自交6 7代，甚 至更长时间才能够获得纯系，而应用本发明仅需5 6个月即可获得纯系，其中性状优良 的可以直接作为育种材料，进行新品种培育或品种改良，大大縮短育种年限。双单倍体 具有纯合性，显隐性基因当代就可以得到完全表达，因此可以提高目标性状的选择效率。 其次，双单倍体群体在黄瓜遗传育种理论研究中也具有重要作用。双单倍体植株经自交 繁种，次年即可创建双单倍体群体，该群体具有绝对的纯合性，是一个永久性群体，因 此利用该群体进行AFLP、 RFLP和RAPD等分子标记和遗传图谱绘制研究，物种进化研 究、遗传分析、植物基因克隆筛选等研究可以多年多点对同一群体进行重复试验，从而 使结果更加准确，并保证了研究的延续性。
权利要求
1、黄瓜游离小孢子的培养方法，包含下列步骤1)取样在盛花期于晴天上午9:00～10:00从健壮植株上取花蕾，将花药从花蕾中剥出，置于载玻片上，滴几滴去离子水浸没花药，用镊子轻轧花药使小孢子游离出来，去除残留的花药组织，盖上盖玻片，在OLYMPUS显微镜下观察，选取小孢子发育处于单核靠边期的花蕾用于游离小孢子培养，将花蕾置于4℃下预处理2d；2)花蕾消毒将花蕾先在75％酒精溶液里浸30s，然后用0.1％升汞消毒8min，最后用无菌水冲洗3次，每次30～60s；3)游离、纯化小孢子将消毒后的花蕾置于10mL离心管中，加入4～5mL配方为B5+质量比13％蔗糖，pH为5.8，用0.22μm微孔滤膜过滤灭菌的B5-13提取液，用玻璃棒挤压花蕾使小孢子释放出来；使用孔径为76μm的细胞筛过滤；滤液在600r·min-1的转速下离心5min，重复离心3次，至上清无色透明；弃上清，用配方为NLN+0.5mg·L-12，4-D+0.2mg·L-16-BA+质量比13％蔗糖，pH为5.8，用0.22μm微孔滤膜过滤灭菌的液体培养基悬浮小孢子；最后使用血球计数板计数，调整小孢子密度约为1.0×105个·mL-1；4)胚状体诱导用直径60mm的培养皿分装小孢子悬浮液，每皿2mL，用Parafilm封口膜封口后，在25℃下进行静止暗培养至产生肉眼可见的胚状体，之后进行60r·min-1振荡暗培养至形成子叶形胚；5)胚状体萌发将子叶形胚转移至配方为MS+0.2mg·L-1 6-BA+质量比3％蔗糖+质量比0.8％琼脂，pH为5.8，在121℃下高压灭菌20分钟的MS-BA胚状体萌发培养基上，在25℃、4000LX、16h·d-1下光照培养，20～25d后形成无根苗或根较弱的再生植株；6)诱导生根与植株再生将无根苗以及根较弱的再生植株转接至配方为MS+0.2mg·L-1IBA+质量比3％蔗糖+质量比0.8％琼脂，pH为5.8，在121℃下高压灭菌20分钟的生根培养基上，在25℃、4000LX、16h·d-1下进行光照培养，10d后即获得完整的再生植株。
全文摘要
本发明是一种黄瓜游离小孢子培养的方法，属于生物技术领域。包括取花蕾，鉴定小孢子发育时期，预处理，花蕾消毒，用B₅-13提取液采用挤压法游离小孢子，用76μm细胞筛过滤，离心，纯化小孢子，在25℃下进行静止暗培养至产生肉眼可见的胚状体，之后60r·min^-1振荡暗培养形成子叶形胚，在MS-BA胚状体萌发培养基上形成再生植株或无根苗，最后在生根培养基MS-IBA上诱导生根获得完整的再生植株。本发明可以获得单倍体或双单倍体。双单倍体既是良好的育种材料，可用于新品种的选育或品种改良，大大缩短育种年限，提高选择效率；也是进行AFLP、RFLP和RAPD等分子标记和遗传图谱绘制研究和进行物种进化研究、遗传分析、植物基因克隆筛选等的理想材料。
文档编号A01H1/04GK101317548SQ200810022098
公开日2008年12月10日 申请日期2008年7月18日 优先权日2008年7月18日
发明者娄群峰, 艳 詹, 钱春桃, 陈劲枫 申请人:南京农业大学