专利名称：诱导脂肪源性成体干细胞迁移的方法
技术领域：
本发明涉及脂肪组织源性成体干细胞迁移的能力，且尤其是涉及脂肪组织源性成体干细胞及其特定分泌产物的新型用途，所述脂肪组织源性成体干细胞及其特定分泌产物具有迁移至有趋化因子或生长因子在其中表达的疾病部位的能力，以及本发明涉及能够更有效地增强趋化因子或生长因子受体功能的方法。
背景技术：
干细胞是指不仅具有自我复制能力，而且具有分化为至少两种类型细胞的能力的细胞，并可分为全能干细胞、多能干细胞(pluripotent stem cell)和多潜能干细胞(专能干细胞，multipotent stem cell)。 全能干细胞是具有能够发育为一个完整个体的全能特性的细胞，卵细胞和精子受精后达8细胞阶段的细胞拥有这些特性。当将这些细胞分离并移植至子宫时，它们能够发育成一个完整个体。多能干细胞源自受精后4-5天产生的位于囊胚内侧的内细胞团，是能够发育为源自外胚层、中胚层和内胚层的多种细胞及组织的细胞。这些细胞被称为“胚胎干细胞”并且能够分化为其他各种组织细胞，但不形成新的生物体。专能干细胞是指能够分化为对含有这些细胞的组织和器官特异的单一细胞，且不但涉及胎儿、新生儿及成人时期多种组织和器官的生长与发育，还涉及保持成体组织的体内平衡以及在组织损伤时诱导再生的功能。将组织特异的专能细胞(multipotent cell)共同称为“成体干细胞”。成体干细胞是通过从各种人体器官取出细胞并将细胞发育为干细胞而获得，且其特征在于它们分化为单一特定组织。然而，最近，关于将成体干细胞分化为包括肝细胞在内的多种组织的实验相当成功，这成为了焦点。人们在再生医学领域已做出了努力，利用细胞来再生生物组织及器官，并恢复它们由于疾病或事故及类似原因而丧失的功能。通常用于再生医学领域的方法包括以下步骤收集干细胞、来自患者的血源性单核细胞或骨髓源性单核细胞；通过试管培养诱导细胞的增殖和/或分化；并通过移植将选定的未分化(干细胞和/或祖细胞)和/或分化细胞引入患者的身体。因此，预期现有的通过药物或外科手术治疗疾病的传统方法将被细胞/组织替代疗法取代，该疗法采用健康的细胞、组织或器官来替代损伤的细胞、组织或器官，因而干细胞的应用将进一步增加。因此，人们目前正研究干细胞的多种功能。特别地，正在进行关于干细胞的有效分离、未分化状态的干细胞的维持和增殖以及干细胞分化为组织细胞的多种研究。已有一些关于通过趋化因子处理来诱导骨髓源性干细胞迁移的报告(Adriana Lopez Ponteet al.，Stem Cells，25 :1737-1745，2007 ；Marek Honczarenko et al.，Stem Cells，24 1031-1041，2006 ；Sordi V et al. ， Blood，106 :419-427,2005 ；Fiedler J et al. ， J CellBiochem,87 :305-312,2002 ；Forte G et al.，Stem Cells，24 :23-33,2006 ；Wright DE etal.，Blood，87 :4100-4108,1996 ；Son BR et al.，Stem Cells，24 :1254-1264，2006)，但还没有关于脂肪干细胞迁移的报道。
由此，本申请发明人已发现脂肪间充质干细胞具有迁移的能力，且当干细胞以各种趋化因子或生长因子进行前处理时，显著诱导了通过特定趋化因子或生长因子的脂肪间充质干细胞的迁移。基于此结果，本申请发明人发现了能够增强脂肪源性间充质干细胞表达趋化因子或生长因子受体能力的方法，由此完成了本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于诱导脂肪干细胞迁移的组合物，该组合物含有作为活性成分的一种或多种脂肪组织源性成体干细胞及其分泌产物。本发明的另一目的在于提供一种用于诱导脂肪组织源性成体干细胞迁移至疾病部位的方法。
本发明涉及表达趋化因子或生长因子受体的脂肪组织源性成体干细胞或来自该干细胞的分泌产物的用途及功能。为了实现上述目标，本发明提供了一种用于诱导脂肪干细胞迁移的组合物，该组合物含有作为活性成分的脂肪源性成体干细胞和/或其分泌产物。本发明组合物中的脂肪源性成体干细胞分泌产物的实例包括RantesMCP-I (单核细胞趋化蛋白-1)、MIP_3P (单核细胞炎性蛋白-3P)、SDF_la (基质细胞衍生因子-I a )、BCA-1(B细胞吸引趋化因子-I)、CXCL16(趋化因子C-X-C基序配体16)、EGF(内皮生长因子)、b-FGF (碱性成纤维细胞生长因子)、HGF (肝细胞生长因子)、TGF-0 I (转化生长因子^ I)、IGF-I (胰岛素样生长因子I)、H)GF-AB(血小板源性生长因子AB) >TNF-a (肿瘤坏死因子- a )、脂联素、瘦素以及前胶原的受体。优选地，分泌产物可为脂联素和/或瘦素。脂肪组织源性成体干细胞和/或其分泌产物可用作人脂肪组织源性成体干细胞的培养液，所述培养液通过在含有特定成分的培养基中培养人脂肪组织源性成体干细胞，收获培养基，并从培养基中移除细胞碎片来获得。此外，组合物可进一步含有FBS。优选地，组合物可含有大约30%的FBS。脂肪源性成体干细胞及其分泌产物表达一种或多种趋化因子或生长因子的受体，并随所述趋化因子或生长因子迁移，所述趋化因子或生长因子选自由Rantes、MCP-I (单核细胞趋化蛋白-1)、MIP_3P (单核细胞炎性蛋白-3P)、SDF_la (基质细胞衍生因子-I a )、BCA-1(B细胞吸引趋化因子-I)、CXCL16(趋化因子C-X-C基序配体16)、EGF(内皮生长因子)、b-FGF (碱性成纤维细胞生长因子)、HGF (肝细胞生长因子)、TGF-0 I (转化生长因子3 I)、IGF-I (胰岛素样生长因子I)、PDGF-AB(血小板源性生长因子AB)以及TNF_a (肿瘤坏死因子-a)构成的组。此外，本发明组合物中的脂肪源性成体干细胞可优选源自哺乳动物，更优选源自人。例如，脂肪源性成体干细胞可为人脂肪组织源性间充质干细胞(AdMSC)。特别地，本发明中使用的脂肪组织源性成体干细胞优选以含有趋化因子或生长因子的混合物(cocktail)进行前处理。优选地，该混合物可含有选自由Rantes、MCP-I (单核细胞趋化蛋白-I)、MIP-3 ^ (单核细胞炎性蛋白-3 ^ ) ,SDF-I a (基质细胞衍生因子-I a ) ,BCA-I (B细胞吸引趋化因子-I)、CXCL16 (趋化因子C-X-C基序配体16)、EGF (内皮生长因子)、b_FGF(碱性成纤维细胞生长因子)、HGF (肝细胞生长因子)、TGF-P I (转化生长因子P I)、IGF-I (胰岛素样生长因子I)、PDGF-AB (血小板源性生长因子AB)以及TNF- α (肿瘤坏死因子-α )构成的组中的ー种或多种因子。特别地，该混合物更优选可含有选自由Rantes、SDF-Ια (基质细胞衍生因子-I α )、HGF (肝细胞生长因子)、TNF_a (肿瘤坏死因子-a )、TOGF-AB (血小板源性生长因子AB)以及TGF-βΙ (转化生长因子β )构成的组中的ー种或多种因子。人成体干细胞优选含有总计约I X IO7至I X 101°的细胞，且更优选为约I X IO8至IXio9的细胞。本发明也提供了ー种用于诱导脂肪组织源性成体干细胞迁移的方法，该方法包括以下步骤(a)以含有趋化因子或生长因子的混合物对脂肪组织源性成体干细胞进行前处理；以及(b)将含经前处理的脂肪组织源性成体干细胞及其分泌产物的组合物施用于不与疾病部位直接接触的体内部位。在这一方法中，组合物最优选为进行静脉给药。
图I以图表显示了由多种趋化因子或生长因子诱导脂肪组织源性专能间充质干细胞迁移的結果。图2为在诱导细胞迁移后，脂肪组织源性专能间充质干细胞的一组显微图片。图3以图表显示了通过10%的FBS诱导以多种趋化因子或生长因子进行前处理的脂肪组织源性专能间充质干细胞迁移的結果。图4以图表显示了通过多种趋化因子或生长因子诱导以TNF-α进行前处理的脂肪组织源性专能间充质干细胞迁移的結果。图5以图表显示了以多种趋化因子或生长因子进行前处理的脂肪组织源性专能间充质干细胞，通过与用于前处理细胞相同的趋化因子或生长因子来诱导迁移的結果。图6是显示为确定各种趋化因子或生长因子受体是否在脂肪组织源性专能间充质干细胞及A549细胞中表达而进行的FACS结果的ー组图片。图7为是显示为确定各种趋化因子或生长因子受体的mRNA是否在脂肪组织源性专能间充质干细胞中表达而进行的RT-PCR结果的ー组图片。在图7A中，泳道I :CCRl (380bp)，泳道 2 CCR2 (474bp)，泳道 3 CCR7 (46 lbp)，泳道 4 CXCR4 (489bp)，泳道5 CXCR5 (494bp)，泳道 6 CXCR6 (517bp)以及泳道 7 GAPDH (362bp)。在图 7B 中，M :分子标记，泳道 I EGFR (419bp)，泳道 2 TGFBR2 (498bp)，泳道 3 =PDGFRA (187bp)，泳道 4 :PDGFRB (508bp)，泳道 5 IGFlR (299bp)，泳道 6 c-MET (201bp)，泳道 7 TNFRSF1A (218bp)，泳道 8 FGFR1 (250bp)以及泳道 9 GAPDH (362bp)。图8描绘了图表及ー组显微图片，其显示了通过1、10及100ng/ml的脂联素诱导以脂联素进行前处理的脂肪组织源性多能间充质干细胞迁移的結果。图9是显示为确定脂联素受体I和2的mRNA是否在脂肪组织源性专能间充质干细胞中表达而进行的RT-PCR结果的ー组图片。在图9中，泳道I :ADIP0Rl(337bp)，泳道2 ADIP0R2 (538bp)，泳道 3 GAPDH (362bp)。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术及科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。一般地，本文中使用的命名及将在下文描述的实验方法是本领域公知且通常采用的。干细胞是指不仅具有自我复制能力，而且具有分化为至少两种类型细胞的能力的细胞。成体干细胞是出现在发育过程后胚胎中各器官已形成的阶段或成体阶段的干细胞。已知成体干细胞是多潜能的，且能够分化为组织及器官特异性细胞。这样的多潜能干细、胞(专能干细胞)，是能够分化为对含有这些细胞的组织及器官特异的细胞，且不但涉及胎JL、新生儿及成人时期中多种组织和器官的生长与发育，还涉及保持成体组织的体内平衡，以及在组织损伤时诱导再生的功能。在本发明中，可采用源自脂肪组织或上皮组织如毛囊或羊膜的成体干细胞。优选地，采用人脂肪组织源性成体干细胞。可采用间充质干细胞(MSC)。特别地，可采用人脂肪组织源性间充质干细胞(AdMSC)。所述脂肪组织或上皮组织优选源自哺乳动物，更优选源自人。在本发明的ー个实例中，采用了人脂肪组织源性间充质干细胞(AdMSC)。本文中所使用的“脂肪组织源性成体干细胞”或“脂肪组织源性间充质干细胞”是指从脂肪组织中分离的未分化成体干细胞，且在本文中也称作“脂肪干细胞”。可根据本领域已知的任ー常规方法来获得这些细胞。可采用本领域已知的适于干细胞培养的任一常规培养基来获得脂肪干细胞。例如，本发明中采用了 DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)。培养脂肪干细胞的培养基可补充添加剤，该添加剂促进脂肪干细胞未分化表型增殖，同时抑制细胞分化。并且，培养基一般可含有等渗溶液的中性缓冲液(如磷酸盐和/或高浓度碳酸氢盐)；蛋白营养物(例如，血清如FBS、血清替代品、白蛋白或必需及非必需氨基酸如谷氨酰胺)。此外，培养基可含有脂类(脂肪酸、胆固醇、血清HDL或LDL抽提物)以及在大部分这类培养基中发现的其他成分(如胰岛素或转铁蛋白、核苷或核苷酸、丙酮酸、糖源如葡萄糖、呈任何离子形式或盐的硒、糖皮质激素如氢化可的松和/或还原剂如巯基こ醇)O此外，为了防止细胞彼此附着，附着在容器壁上或形成过大的聚簇，在培养基中包括抗凝剂如Invitrogen出售的抗凝剂(Cat#0010057AE)可能有益处。在这些中，采用下列ー种或多种添加剂可能是有利的 干细胞因子(SCF、Steel因子)、ニ聚化c_kit的其他配体或抗体，以及相同信号传导通路的其他活化剂 其他酪氨酸激活酶相关受体的配体，例如血小板源性生长因子(TOGF)、巨噬细胞集落刺激因子、Flt-3配体以及血管内皮生长因子(VEGF)受体的配体·提高环腺苷酸cAMP水平的因子,如弗斯可林(forskolin)·诱导gpl30的因子，如LIF或制瘤素-M 造血生长因子，如血栓形成素(TPO)·转化生长因子，如TGF β I 其他生长因子，如上皮生长因子(EGF)
·神经生长因子，如CNTF· N-こ酰-L-半胱氨酸(NAC)·氢化可的松 抗坏血酸特别地，本发明ー个实施方式中用来培养脂肪干细胞的培养基优选含有NAC、抗坏血酸、钙、胰岛素及氢化可的松。更优选地,培养基含有FBS、NAC、抗坏血 酸、钙、rEGF、胰岛素及氢化可的松。本发明的组合物可含有作为活性成分的来自脂肪组织源性间充质干细胞的分泌产物。分泌产物的实例包括多种趋化因子、氨基酸、生长因子及类似物。本发明组合物中可含有的分泌产物特定实例包括TGF、bFGF、IGF-U KGF, HGF、纤连蛋白、VEGF、脂联素、瘦素及前胶原，以及它们的受体。在来自脂肪源性成体干细胞的这些分泌产物中，脂联素或瘦素特别源自脂肪组织，且非常有助于诱导细胞迁移。人成体干细胞和/或其分泌产物可用作人脂肪组织源性成体干细胞的培养液，通过在含有特定成分的培养基中培养人脂肪组织源性成体干细胞，收获培养基，并从培养基中移除细胞碎片来获得。可选地，培养液提取物可単独或联合使用。換言之，本发明的组合物可为含有脂肪源性成体干细胞及其分泌产物和培养基成分的组合物，或者含有细胞分泌产物及培养基成分的组合物，或者含有单独的的细胞分泌产物或的细胞分泌产物与成体干细胞结合的组合物，或者仅含有在体内产生分泌产物的脂肪源性成体干细胞的组合物。在ー个方面，本发明涉及脂肪组织源性成体干细胞和/或其分泌产物用于诱导干细胞迁移的用途。更特别地，本发明是基于发现了脂肪组织源性成体干细胞及其特定分泌产物显示出趋化因子或生长因子受体的功能，它们在疾病部位表达。本文中所使用的短语“显示出趋化因子或生长因子受体的功能”是指脂肪组织源性成体干细胞在细胞表面表达特异性结合特定趋化因子或生长因子的受体，或来自这些细胞的分泌产物为该受体或包括该受体。換言之，这意味着脂肪干细胞具有与特定趋化因子或生长因子反应的能力。生长因子是指促进各种细胞分裂、生长及分化的多肽的集合，且已知它们參与细胞信号。生长因子根据结构相似性被分类为家族，并通过如自分泌、旁分泌、内分泌及类似机制作用于目标细胞。生长因子受体通常在胞内区具有酪氨酸激酶活性，且当它们与配体受体结合时，生长因子受体本身或胞内蛋白的酪氨酸残基磷酸化，并发生细胞増殖或分化。趋化因子由在炎症中产生并调节白细胞募集的小细胞因子家族构成。这些趋化因子能够选择性诱导血液有形成分(除了红血球)的趋化性，包括白细胞如中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞及淋巴细胞，如T细胞和B细胞。除了刺激趋化性，可通过应答细胞中与白细胞活化有关的趋化因子来选择性诱导其他变化，包括细胞形状的变化、胞内游离钙离子(Ca2+)浓度的瞬时上升、颗粒胞吐、上调整合、生物活性脂类(例如，白细胞三烯)的形成以及呼吸爆发。因此，趋化因子是炎症反应的早期触发物，引发炎症介质释放、趋向及外渗至感染或炎症部位。总之，趋化因子/受体相互作用倾向于是混杂的，即ー个趋化因子能结合至许多趋化因子受体，并且相反地，单个趋化因子受体能与若干趋化因子相互作用。先前还未了解趋化因子受体信号以及对配体选择性的许多方面。基于脂肪源性成体干细胞及其分泌产物显示出趋化因子受体功能的新发现，本申请旨在利用脂肪源性成体干细胞对在疾病部位表达的特定趋化因子反应而迁移至感染或炎症部位(例如，疾病部位)的功能(这迁移也称作“目标迁移”)。在本发明中，也考虑到了反应不仅是对趋化因子，而且也对特定生长因子。特别地，脂肪源性成体干细胞对选自由Rantes, MCP-I (单核细胞趋化蛋白-I)、MIP-3 β (单核细胞炎性蛋白_3 β )、SDF-I α (基质细胞衍生因子-la)、BCA-I (B细胞吸引趋化因子-I)、CXCL16 (趋化因子C-X-C基序配体16)、EGF(内皮生长因子)、b-FGF(碱性成纤维细胞生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)、TGF-β I (转化生长因子β I)、IGF-I (胰岛素样生长因子I)、I3DGF-AB (血小板源性生长因子AB)以及TNF-α (肿瘤坏死因子-α)构成的组中的趋化因子或生长因子反应极佳。为了通过趋化因子或生长因子与其受体相互作用来增强细胞迁移的能力，本发明的组合物可进ー步含有FBS。优选地，组合物含有大约30%的FBS。应理解，即便组合物中不含FBS，施用至体内时也能够利用现存于体内的FBS。同吋，为了提高脂肪组织源性成体干细胞和/或脂肪组织源性成体干细胞的分泌产物受体的表达水平或反应，脂肪组织源性成体干细胞优选以含有趋化因子或生长因子的混合物进行前处理。特别地，混合物可优选含有选自由Rantes、MCP-I (单核细胞趋化蛋白-I)、ΜΙΡ-3 β (单核细胞炎性蛋白_3 β ) ,SDF-I α (基质细胞衍生因子-I a ) ,BCA-I (B细胞吸引趋化因子-1)、CXCL16(趋化因子C-X-C基序配体16)、EGF (内皮生长因子)、b_FGF (碱性成纤维细胞生长因子)、HGF (肝细胞生长因子)、TGF-β I (转化生长因子β I)、IGF-I (胰岛素样生长因子I)、TOGF-AB (血小板源性生长因子AB)以及TNF-α (肿瘤坏死因子-α)构成的组中的ー种或多种因子。混合物可更优选含有选自由RanteS、SDF-la (基质细胞衍生因子-I α )、HGF (肝细胞生长因子)、TNF_a (肿瘤坏死因子-a )、TOGF-AB (血小板源性生长因子AB)以及TGF-βΙ (转化生长因子β )构成的组中的ー种或多种因子。如本发明的实施例5所示，在以特定趋化因子或生长因子和/或细胞的分泌产物对脂肪组织源性成体干细胞进行前处理的情形下，对趋化因子或生长因子反应的细胞迁移显著增加了。因此，在另一方面，本发明涉及用于诱导脂肪组织源性成体干细胞迁移的方法，该方法包括以下步骤(a)以含有趋化因子或生长因子的混合物对脂肪组织源性成体干细胞进行前处理；以及(b)将含经前处理的脂肪组织源性成体干细胞及其分泌产物的组合物施用于体内部位，该部位不与疾病部位直接接触。本发明的方法中，通过在含有趋化因子或生长因子的培养基中培养成体干细胞来实施以含有趋化因子或生长因子的混合物对成体干细胞进行前处理的步骤(a)。成体干细胞的前处理约进行20-60小时,优选约20-50小时。本发明的一个实施方式中，成体干细胞的前处理进行24小吋。此外，在脂肪干细胞培养之前、期间或之后实施以混合物对脂肪干细胞进行前处理。优选地，在脂肪干细胞培养之后实施前处理。
混合物可优选含有选自由Rantes、MCP-I (单核细胞趋化蛋白_1)、ΜΙΡ_3β (单核细胞炎性蛋白_3 β ) >SDF-1 α (基质细胞衍生因子-I a ) ,BCA-I (B细胞吸引趋化因子_1)、CXCL16(趋化因子C-X-C基序配体16)、EGF(内皮生长因子)、b_FGF (碱性成纤维细胞生长因子)、HGF (肝细胞生长因子)、TGF- β I (转化生长因子β I)、IGF-I (胰岛素样生长因子1)、H)GF-AB (血小板源性生长因子AB)以及TNF-α (肿瘤坏死因子-α)构成的组中的ー种或多种因子。更优选地，混合物可含有选自由Rantes、SDF-l α (基质细胞衍生因子-I α )、HGF (肝细胞生长因子)、TNF- α (肿瘤坏死因子-α )、PDGF-AB (血小板源性生长因子AB)以及TGF-β I (转化生长因子β I)构成的组中的ー种或多种因子。此外，用于步骤(b)的含经前处理的脂肪源性成体干细胞和/或其分泌产物的组合物可为含有所有经前处理的脂肪干细胞、分泌产物及培养基的组合物，或者含有分泌产物和未经前处理的脂肪干细胞的培养基的组合物，或者含有无分泌产物的经前处理的脂肪干细胞及培养基的组合物。因此，可以各种方式使用经前处理的脂肪干细胞、分泌产物及培养基，但无特别限制。进ー步，本文中所使用的短语“将组合物施用于体内部位，该部位不与疾病部位直 接接触”意味着通过诱导干细胞的至少部分定位于疾病部位外的部位的方法或途径，排除移植干细胞至疾病部位的方法，来在受试者中定位干细胞。本发明的组合物能通过任ー适合途径来施用于受试者，以便将其递送至受试者的期望位置，在该位置中细胞的ー些成分仍存活。本文中所使用的术语“施用”可与“引入”、“递送”、“定位”或类似语互換使用。在临床施用上，本发明的组合物可肠道外施用，例如，通过肌肉内或静脉注射。最优选地，本发明的组合物通过静脉注射施用。因此，本发明涉及用于诱导脂肪组织源性成体干细胞迁移的方法，该方法包括静脉内施用含有以趋化因子或生长因子和/或其分泌产物进行前处理的脂肪组织源性成体干细胞的组合物。再一方面，本发明涉及用于诱导脂肪组织源性成体干细胞目标迁移的方法，使得细胞到达疾病部位，从而治疗该疾病部位。因此，本发明涉及含有脂肪组织源性成体干细胞及其分泌产物作为活性成分的细胞治疗剂，以及利用该细胞治疗剂治疗疾病部位的方法。除非另有指示，否则本文中所使用的术语“治疗”意味着逆转、缓和、抑制该术语所适用的失调或病症或者这种失调或病症的ー种或多种症状的进展，或防止它们。本文中所使用的术语“治疗(treatment)”是指如上述定义的“进行治疗”这样的治疗行为。因此，本文中所使用的，对哺乳动物“进行治疗”疾病或疾病“治疗”包括以下ー种或多种(I)抑制疾病的生长，例如，阻止它的发展；(2)防止疾病的扩散，例如，防止转移；(3)减轻疾病，例如，使癌症消退；(4)防止疾病复发；以及(5)缓和疾病症状。为了通过使干细胞迁移至疾病部位来治疗疾病部位，本发明的组合物以药物有效量进行施用。本文中所使用的术语“治疗有效量”意味着待施用化合物缓和所治疗疾病的ー种或多种症状至某种程度的剂量。因此，治疗有效量是指具有以下效果的剂量(I)逆转疾病进展的速度；(2)抑制疾病进展至某种程度；或者(3)减轻(优选消除)与疾病相关的ー种或多种症状至某种程度。本发明的组合物(细胞治疗剂)在临床上可由肠胃外施用，如肌肉内或静脉内。最优选地，本发明的组合物通过静脉注射施用。为了注射，本发明的组合物优选地可用药学上可接受的缓冲液配制，如Hank溶液，Ringer溶液或生理盐水缓冲液。为了穿过黏液(transmucous)施用，制剂中采用适于穿过组合物待通过的屏障的非侵入试剂。这些非侵入试剂是本领域中通常已知的。肠道外施用的制剂包括无菌水溶液、非水性溶剤、悬浮剂、乳化剤。可用于本发明的悬浮剂及乳化剂包括植物油，如丙ニ醇、聚こニ醇和橄榄油，以及可注射酯如油酸こ酷。对于人，本发明的细胞治疗剂通常可以IO4-IOltl细胞/个体，且优选以IO6-IO8细胞/个体的剂量施用一次或若干次。特别地，本发明的组合物优选含有浓度为IXlO8细胞/100 μ I至I X IO9细胞/100 μ I的成体干细胞。 然而，应当理解组合物活性成分的实际剂量应根据多种相关因素来确定，包括待治疗的疾病，施用途径，患者年龄、性别及体重，以及疾病的严重程度。因此，上述剂量不应以任何方式限制本发明的保护范围。实施例下文中，将參考实施例进ー步详细描述本发明。本领域技术人员显而易见，这些实例仅作为示意用途，且不构成对本发明保护范围的限制。下表I显示了实施例中使用的培养基及试剂的来源。表I
广品品牌
抗坏血酸SigmaUSA
CaCl2SigraaUSA
I型胶原酶GibcoUSA
DMEMGibcoUSADPBSVVelgeneKorea---
EGFGibcoUSAFBSGibcoUSA
氢化可的松SigmaUSA
脇岛素GibcoUSA
K-SFMGibcoUSANACSigmaUSA
实施例I :源自人脂肪组织的间充质干细胞的分离通过吸脂术从腹部脂肪中分离人脂肪组织，并用PBS洗涤。细致切割分离的组织，且之后用补充了 I型胶原酶(lmg/ml)的DMEM培养基在37°C消化2小吋。用PBS洗涤后，将消化的组织以IOOOrpm离心5分钟。吸掉上清液，并用PBS洗涤残留在底部的沉淀，且之后以IOOOrpm离心5分钟。留下的细胞通过100-μ m网状过滤器过滤来移除碎片，然后用PBS洗涤细胞且之后在DMEM(10% FBS、2mM NAC、O. 2mM抗坏血酸)中培养过夜。随后，通过PBS洗涤来移除非附着细胞，且传代培养残留的细胞，同时每隔两天以 Keratinocyte-SFM 培养基(含有 5% FBS、2mM NAC,O. 2mM 抗坏血酸、O. 09mM 钙、5ng/mlrEGF,5 μ g/ml胰岛素以及74ng/ml氢化可的松)替代培养基，由此分离脂肪组织源性专能间充质干细胞。实施例2 :诱导脂肪干细胞的迁移2-1 :通过表2中示出的趋化因子或生长因子诱导细胞迁移将实施例I中分离的脂肪组织源性多潜能间充质干细胞以2X IO4细胞/200 μ I的浓度接种至各孔，并通过下表2中示出的趋化因子或生长因子诱导迁移。以30%的FBS作为阳性对照组。表权利要求
1.一种诱导脂肪干细胞迁移的组合物，其中所述组合物含有作为活性成分的一种或多种脂肪组织源性成体干细胞及其分泌产物。
2.如权利要求I所述的组合物，其中所述脂肪组织源性成体干细胞在细胞表面表达趋化因子或生长因子受体，或者来自这些干细胞的分泌产物包含所述趋化因子或生长因子受体。
3.如权利要求I所述的组合物，其中所述脂肪组织源性成体干细胞的所述分泌产物为脂联素和/或瘦素。
4.如权利要求I所述的组合物,进一步含有FBS(胎牛血清)。
5.如权利要求I或4所述的组合物，其中所述趋化因子或生长因子受体是选自由Rantes、MCP-I (单核细胞趋化蛋白-I)、MIP_3 P (单核细胞炎性蛋白_3 P )、SDF-I a (基质细胞衍生因子_la)、BCA-I (B细胞吸引趋化因子-I)、CXCL16 (趋化因子C_X_C基序配体16)、EGF(内皮生长因子)、b-FGF (碱性成纤维细胞生长因子)、HGF (肝细胞生长因子)、TGF-^ I (转化生长因子P I)、IGF-I (胰岛素样生长因子I)、I3DGF-AB (血小板源性生长因子AB)以及TNF-a (肿瘤坏死因子-a)构成的组。
6.如权利要求I所述的组合物，其中所述脂肪组织源性成体干细胞以含有趋化因子或生长因子的混合物进行前处理。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述混合物含有选自由Rantes、MCP-I(单核细胞趋化蛋白-I)、MIP-3 P (单核细胞炎性蛋白-33)、SDF-I a (基质细胞衍生因子-I a )、BCA-1(B细胞吸引趋化因子-I)、CXCL16(趋化因子C-X-C基序配体16)、EGF(内皮生长因子)、b-FGF (碱性成纤维细胞生长因子)、HGF (肝细胞生长因子)、TGF-0 I (转化生长因子^ I)、IGF-I (胰岛素样生长因子I)、H)GF-AB(血小板源性生长因子AB)以及TNF-a (肿瘤坏死因子-a)构成的组中的一种或多种因子。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述混合物含有选自由Rantes、SDF-la (基质细胞衍生因子-I a )、HGF (肝细胞生长因子)、TNF_a (肿瘤坏死因子-a )、TOGF-AB (血小板源性生长因子AB)以及TGF-0 1(转化生长因子￠1)构成的组中的一种或多种因子。
9.如权利要求I所述的组合物，其中所述脂肪组织源性成体干细胞为人脂肪组织源性间充质干细胞(AdMSC)。
10.如权利要求I所述的组合物，其中所述组合物中含有大约IX IO7个细胞至I X IO10个细胞量的所述脂肪组织源性成体干细胞。
11.一种诱导脂肪组织源性成体干细胞迁移的方法，所述方法包括以下步骤 (a)以含有趋化因子或生长因子的混合物对脂肪组织源性成体干细胞进行前处理；以及 (b)将含有经前处理的脂肪组织源性成体干细胞及其分泌产物的组合物施用于体内部位，该体内部位不与疾病部位直接接触。
12.如权利要求11所述的方法，其中步骤(a)进一步包括以FBS对成体干细胞进行前处理。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述混合物含有选自由Rantes、SDF-la (基质细胞衍生因子-I a )、HGF (肝细胞生长因子)、TNF_a (肿瘤坏死因子-a )、TOGF-AB (血小板源性生长因子AB)以及TGF-0 1(转化生长因子￠1)构成的组中的一种或多种因子。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述施用的步骤是通过静脉给药实施。
全文摘要
本发明涉及脂肪组织源性成体干细胞迁移的性能，且尤其是涉及以特定趋化因子或生长因子前处理的脂肪组织源性成体干细胞及其特定分泌产物的新型用途，所述成体干细胞及其特定分泌产物更有效地迁移至体内疾病部位。本发明组合物含有脂肪组织源性成体干细胞或以特定趋化因子或生长因子前处理的脂肪组织源性成体干细胞，可通过简单方式如静脉给药来施用，且能够诱导干细胞靶向疾病部位。因此，组合物可用作细胞治疗剂。
文档编号C12N5/071GK102666840SQ201080058811
公开日2012年9月12日 申请日期2010年10月25日 优先权日2009年10月23日
发明者姜成根, 白善轸, 罗廷灿 申请人:Rnl生物技术株式会社