专利名称：用于增强植物出苗和生长的生氮假单胞菌种的新的荧光假单胞菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及促进植物出苗和植物生长的领域。更特别地，本发明涉及一种标记为F30A的生氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)新菌株,及其作为植物出苗和植物生长促进剂的用途以及用于该用途的组合物和方法，该菌株已被保藏在德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)且分配有保藏号DSM 22077。
背景技术：
对植物生长具有有利影响的根际细菌(rhizobacteria)通常被称为PGPR (植物生长促进根际细菌)，并且从作物植物的播种/种植生长直到收获的各个阶段均有利于作物植物。在土壤和根际的荧光假单胞菌已在许多研究中被证明在一些农作物中发挥植物生长促进作用(Kloepper 等，1980 a, b ；Brisbane 等，1989 ；DeFreitas 和 Germida 1991)，并且也阻抑植物疾病(Hemning，1990，O' Sullivan 和 O' Gara, 1992, Weller, 1988, Hokeberg等，1997)。在实验条件下，几种荧光假单胞菌已被证实为提高农作物出苗和产量的潜在剂，农作物例如小麦(Kropp等，1996),芥(Deshwal等,2006),糖用甜菜(Suslow和Schroth,1982)，马铃薯(Kloepper 等，1980 ；Howie 和 Echandi, 1983)，萝卜(Kloepper 和 Schroth,1978 ;Davies 和 Whitbread, 1989)和菠菜(Urashima 等,2006)。深入研究和描述了与其植物生长促进活性相关的几个机制。它们尤其包括根定植能力(Benizri等，2001)，产生广泛的酶和激素的能力(Vivekananthan 等,2004 ；Lucy 等，2004, Patten 和 Glick 1996 ；Garcia de Salamone等,2001)以及通常具有抗微生物活性的其他代谢物(Loper和Buyer,1991 fowling和O' Gara, 1994) 0涵盖它们的不同活性领域的专利/专利申请的实例也是可得的，并且大多涉及具有生物防治特性的菌株/分离株(isolate)。有关具有植物生长促进性质的荧光假单胞菌的专利/专利申请大多通常涵盖发明的活性组分(细菌菌株)连同为选择需要的分离株所需要的筛选和测试方法的描述。本文合并的以下专利申请提供一些关于包括具有植物生长促进和/或生物防治性质的荧光假单胞菌的发明的实例W0/1987/000194, US1996/5503652、W00051435, US1996/5503651、US2002/6447770 和US2002/6495362。尽管上面列出的文献和专利/专利申请，但是到目前为止，没有属于生氮假单胞菌种的其他分离株，已显示和证明在数年的田间试验期间能够一贯地提高许多重要农作物的出苗、生长和产量。相反，以前研究的来源于土壤的生氮假单胞菌分离株在水稻试验中没有显示出任何显著的生长促进作用(Piao等，2005)。有关生氮假单胞菌分离株的植物生长促进特性的仅有的简短信息并未基于任何证实其植物生长促进特性的实验数据，所述分离株涉及匈牙利Lake Velencei健康芦苇丛的根茎相关细菌群落(Micsinai等，2003)。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的荧光假单胞菌株，其在几种重要农作物中显示植物出苗和/或植物生长促进。此目的通过来自生氮假单胞菌种的荧光假单胞菌的异常分离株(标记为菌株F30A)实现。以前从未报道生氮假单胞菌株用于植物生长促进特性。将该分离株施用于栽培在温室和田间条件下的不同作物后，其提供了显著的植物出苗和生长促进。此外，根据可得到的文献数据，其作用一贯比任何其他先前记录的植物生长促进微生物剂更加稳定和可重复。一种生氮假单胞菌的生物学纯菌株(菌株F30A)，已保藏在德意志微生物保藏中心，且分配有保藏号DSM 22077。因此，本发明涉及一种生氮假单胞菌的生物学纯菌株，菌株F30A，其已保藏在德意志微生物保藏中心，且分配有保藏号DSM 22077。本发明还涉及一种获自生氮假单胞菌的生物学纯菌株菌株F30A的培养物的上清液，该菌株已保藏在德意志微生物保藏中心，且分配有保藏号DSM 22077。 本发明还涉及生氮假单胞菌的生物学纯菌株菌株F30A或其上清液用于增强种子萌发、植物出苗和/或植物生长的用途。所述种子和/或植物可为例如双子叶或单子叶的。本发明还涉及一种生氮假单胞菌的生物学纯菌株菌株F30A的发酵产物。本发明还涉及一种农业组合物，其包含任选与一种或多种液体和/或固体载体组合的生氮假单胞菌的生物学纯菌株菌株F30A或其上清液。农业组合物还可包含一种或多种其他植物生长促进微生物、生物防治微生物、有机肥料和/或农用化学品。本发明还涉及一种用于增强种子萌发、植物出苗和/或植物生长的方法，该方法包括将本文定义的发酵产物或农业组合物施用于种子、植物和/或所述种子或植物的周围环境的步骤。可以施用于例如植物的根。可在植物的根出现之前和/或之后施用。发酵产物或农业组合物可备选地施用于植物无性繁殖个体(vegetative propagation unit)。发酵产物或农业组合物也可施用于植物无性繁殖个体或施用于种子和/或植物周围的植物栽培介质中。该植物可为或该种子可发育成单子叶植物或双子叶植物。本发明还涉及一种用于制备本文定义的农业组合物的方法，该方法包括以下步骤将所述生氮假单胞菌菌株F30A或所述上清液与一种或多种液体或固体载体以及任选的一种或多种其他植物生长促进微生物、生物防治微生物、有机肥料和/或农用化学品混
八
口 ο
图I.基于16S rDNA的1390个核苷酸的比对，分离株F30A与代表25种不同假单胞菌种的菌株和I种大肠杆菌(E. coli)的参照菌株(Gene Bank保藏号J01695)比较的分
类学位置。图2.以不同浓度对种子施用F30A发酵产物和其上清液后，春小麦(未感染种子批)的出苗(A)和干重(B)。温室试验。方块表示CFU/ml。误差棒代表平均值的标准误差(η = 4)。图3.对种子施用不同浓度的F30A发酵产物和生理盐溶液中悬浮的F30A细胞后，春小麦(未感染种子批)的出苗㈧和干重(B)。温室试验。方块表示CFU/ml。误差棒代表平均值的标准误差(η = 4)。
图4.对种子施用不同浓度的F30A发酵产物、悬浮在自来水中的F30A细胞和分离株上清液后，菠菜的出苗。来自两个不同的发酵产物批次的结果批次F0M115(A)和批次F0M139(B)。温室试验。方块表示CFU/ml。误差棒代表平均值的标准误差(η = 4)。图5.对根/ 土壤施用不同浓度的F30A发酵产物和施用其上清液后，卷心莴苣的绿色质量(green mass)产量。使用两个不同的发酵产物批次批次F0M173 (A)和批次F0M176(B)。(A)和(B)代表两个独立的温室试验。方块表示CFU/ml。误差棒代表平均值的标准误差(η = 12) ο图6.对根/ 土壤施用F30A的贮存发酵产物批次后，卷心莴苣的绿色质量产量。批次F0M203在4°C贮存2周，批次F0M196贮存6周，批次F0M192贮存14周。温室试验。方块表不CFU/ml ο误差棒代表平均值的标准误差(η = 12)。
图7.对根/ 土壤施用不同浓度的F30A发酵产物(批次F0M076)后，辣椒的果实产量。温室试验。方块表示CFU/ml。误差棒代表平均值的标准误差(η = 8)。图8.卷心莴苣的土壤/根处理。左盆水对照；右盆F30A发酵产物。图9.对种子施用F30A发酵产物(批次F0M233)后，田间试验中菠菜的出苗。在三个不同时刻记录出苗。图中显示与未处理对照相比，出苗的增加/减少百分比。误差棒代表平均值的标准误差(η = 4)。图10.对种子施用F30A发酵产物(批次F0M233)后，田间试验中的菠菜产量。在两个不同时间点测量产量。误差棒代表平均值的标准误差(η = 4)。图11.田间试验中对种子施用F30A发酵产物(批次F0M154)后，紫花南芥在两个时刻的产量(棒)和出苗(方块)。误差棒代表平均值的标准误差(η = 12)。图12.田间试验中对种子施用F30A发酵产物(批次F0M150)后，蔓生豌豆(viningpea)的产量。误差棒代表平均值的标准误差(η = 4)。图13.田间试验中对种子施用F30A发酵产物(批次F0M076)后，胡萝卜的产量。误差棒代表平均值的标准误差(未处理η = 9 ;水η = 12 ；F30A :n = 6)。图14.田间试验中对根/ 土壤施用F30A发酵产物(批次F0M233)后，卷心莴苣的产量。误差棒代表平均值的标准误差(η = 5)。图15.田间试验中对根/ 土壤施用F30A发酵产物(批次F0M095和F0M147)后，草莓花的数量。深色棒F30A ;浅色棒水处理对照。误差棒代表平均值的标准误差(η =4)。图16.田间试验中对根/ 土壤施用F30A发酵产物(批次F0M095和F0M147)后，草莓的产量。深色棒F30A ;浅色棒水处理对照。误差棒代表平均值的标准误差(η = 4)。图17.田间试验中对根/ 土壤施用F30A发酵产物(批次F0M076)后，花椰菜的产量。深色棒F30A ;浅色棒水处理对照。误差棒代表平均值的标准误差(η = 5)。图18.田间试验中对根/ 土壤施用F30A发酵产物后,夏卷心菜(summer cabbage)的产量。深色棒F30A ;浅色棒水处理对照；方块可销售产量的百分比(> 350克)。误差棒代表平均值的标准误差(η = 50)。图19.田间试验中对块茎施用F30A发酵产物后，早熟马铃薯的值株发育和块茎产量。具有不同字母的平均值显著不同，根据Duncan多范围测试(ρ = O. 05)。图20.对块茎施用F30A发酵产物和分离株的湿配方后，一个早熟马铃薯和一个晚熟马铃薯品种的相对块茎产量。来自田间试验的数据。具有不同字母的平均值显著不同，根据Duncan多范围测试(P = O. 05)。图21.与未处理幼苗(左)比较，在用分离株F30A的发酵产物处理(右)后，欧洲赤松10周龄幼苗根和枝条(shoot)生长的增强。
具体实施例方式本发明的植物生长促进剂本发明涉及一种生氮假单胞菌的新菌株菌株F3A，其已于2008年12月3日保藏在德意志微生物保藏中心(InhoffenstraPe 7B ；D-38124 Braunschweig ;Germany),且分配有保藏号DSM 22077。保藏人为兰特曼伦生物农业有限公司(LantmamenBioAgri AB)(P.O.Box 914 ；751 09 Uppsala ;Sweden)。本发明的F30A菌株是一种生物学纯菌株。
生氮假单胞菌的新菌株菌株F30A下面也标记为“分离株”、“剂”或生氮假单胞菌F30A。生氮假单胞菌下面可缩写为生氮假单胞菌(P. azotoformans)。生氮假单胞菌菌株F30A还可在下面简化标记为“F30A”。本发明的植物生长促进生氮假单胞菌F30A包含荧光假单胞菌的生物学纯菌株，其有以下具体的鉴定特征(i)分离株是根相关革兰氏阴性菌，荧光假单胞菌(P. f Iuorescens)谱系的成员，它有不同于最近亲的特定Biolog GM利用特征；选择和鉴定特征在后面将介绍；(ii)分离株具有如下所述的其他独特的形态、生化和代谢特性，以及固氮、溶解磷和溶解/氧化硫的能力；(iii)分离株增强至少属于下列植物科的农作物的种子萌发、植物生长和/或产量觅科，十字花科，爺科，菊科(Astraceae),伞形科,豆科,蔷薇科，葫芦科，唇形科，葱科(Aliaceae)，以及增强植物苗圃中树幼苗成根和生长。下文将给出这种影响的具体实例。本发明的分离株具有以下的其他鉴定特征在活跃生长的分离株存在下，浓密暗绿色至接近黑色的色素积累在有机培养基(PF琼脂，具有大豆蛋白胨、小麦蛋白胨和其他植物蛋白胨作为基质的液体培养基)中和/或蓝绿色素积累在添加了甘油的无机培养基(例如Lemna培养基(Maeng和Khudairi, 1973))中。这种色素积累没有在任何其他已知假单胞菌中报导。此外，分离株具有独特的生化特性，其中通过Biolog GN系统测试的特定的碳水化合物利用特征不同于生氮假单胞菌的典型菌株和其他最近亲荧光假单胞菌的。本发明分离株的选择首先是收集包括根的整株植物样本。样本稀释液来自根块，并且接种在适合细菌分离的培养基上。收集具有不同形态特征的菌落并作为-80°C原种维持。合适的微生物基质上的液体培养物来自原种，并且用于植物生长促进特性的选择是通过温室生物测定与个体分离株接种的小麦和糖用甜菜种子。选择、鉴定出增强萌发和植物生长的分离株，并进行初步的安全性评估以便确认其大规模温室和田间试验的可行性。基于形态、生化和遗传特性的集合，本发明选出的分离株是一种革兰氏阴性鞭毛菌且为荧光假单胞菌谱系的成员，鉴定为生氮假单胞菌菌种(图I)。但是，它与生氮假单胞菌典型菌株IAM1603和其他近亲假单胞菌种(表I)相比，具有独特的Biolog GN系统的利用特征。结合表I中列出的性状，以下特征对于本发明菌株是非常特异的其利用三个最近亲物种的成员不利用的蔗糖和癸二酸，并且它不利用三个最近亲物种的成员利用的木糖醇和腐胺。
表I区分分离株F30A和近亲的生氮假单胞菌、P. Iibanensis和类黄假单胞菌(P. synxantha)典型菌株的关键生化特性。a取自Dabboussi等(1999)的数据基于几个菌株而非仅菌株LMG2190的特性，菌株LMG2190用作MASE实验室中进行的Biolog测试的参照；(-)阴性、⑴阳性、(d)分歧的、nt (没有测试)。
权利要求
1.一种生氮假单胞菌的生物学纯菌株菌株F30A，其已保藏在德意志微生物保藏中心，分配的保藏号为DSM 22077。
2.一种获自生氮假单胞菌的生物学纯菌株菌株F30A的培养物的上清液，所述菌株F30A已保藏在德意志微生物保藏中心，分配的保藏号为DSM 22077。
3.权利要求I的生氮假单胞菌的生物学纯菌株菌株F30A或权利要求2的上清液用于增强种子萌发、植物出苗和/或植物生长的用途。
4.权利要求3的用途，其中所述种子和/或植物是双子叶的。
5.权利要求3的用途，其中所述种子和/或植物是单子叶的。
6.权利要求I的生氮假单胞菌的生物学纯菌株菌株F30A的发酵产物。
7.—种农业组合物，其包含任选与一种或多种液体和/或固体载体组合的权利要求I的生氮假单胞菌的生物学纯菌株菌株F30A或权利要求2的上清液。
8.权利要求7的农业组合物，其进一步包含一种或多种其他的植物生长促进微生物、生物防治微生物、有机肥料和/或农用化学品。
9.一种用于增强种子萌发、植物出苗和/或植物生长的方法，其包括如下步骤将权利要求6的发酵产物或权利要求7或8中任一项的农业组合物施用于种子、植物和/或所述种子或植物的周围环境。
10.权利要求9的方法，其中将权利要求6的所述发酵产物或权利要求7或8中任一项的所述农业组合物施用于植物的根。
11.权利要求9的方法，其中将权利要求6的所述发酵产物或权利要求7或8中任一项的所述农业组合物在植物的根出现之前和/或之后施用于土壤。
12.权利要求9的方法，其中将权利要求6的所述发酵产物或权利要求7或8中任一项的所述农业组合物施用于植物无性繁殖个体。
13.权利要求9的方法，其中将权利要求6的所述发酵产物或权利要求7或8中任一项的所述农业组合物施用于种子和/或植物周围的植物栽培介质中。
14.权利要求9-13中任一项的方法，其中所述植物为或所述种子会发育成单子叶植物。
15.权利要求9-13中任一项的方法，其中所述植物为或所述种子会发育成双子叶植物。
16.一种用于制备权利要求7或8中任一项的农业组合物的方法，其包括如下步骤将所述生氮假单胞菌菌株F30A或所述上清液与一种或多种液体或固体载体和任选的一种或多种其他的植物生长促进微生物、生物防治微生物、有机肥料和/或农用化学品混合。
全文摘要
本发明描述了生氮假单胞菌种的荧光假单胞菌的分离株，菌株F30A，其已保藏在德意志微生物保藏中心，分配的保藏号为DSM 22077，该菌株能够增强其处理的作物的种子萌发、成苗、植物出苗、植物生长和/或产量。因此，本发明还包括该假单胞菌用于增强植物出苗和生长的用途以及包含该假单胞菌的农业组合物。
文档编号C12R1/38GK102946713SQ201080058990
公开日2013年2月27日 申请日期2010年12月22日 优先权日2009年12月22日
发明者J·莱文福斯, C·福尔克森维尔赫, J·法特希, M·威克斯特伦, S·拉斯姆森, M·赫克贝格 申请人:兰特曼伦生物农业有限公司