专利名称：具有降血压作用的酱油及其制造方法
技术领域：
本发明涉及不添加降压剂的、具有降血压作用的酱油。更详细而言，涉及以组合低蛋白酶活性酱油曲的利用和该酱油曲的加温消化法为最大特征、含有大量的降压肽、血管紧张素I转化酶抑制活性高且具有降血压作用的酱油及其制造方法。
背景技术：
目前，为了得到具有降血压作用的酱油，期待来自降压剂的降血压作用，已知有向酱油中添加属于肾素-血管紧张素系抑制物质(例如烟酰胺)、抑制性神经递质(例如Y -氨基丁酸)、一氧化氮产生促进物质(例如异黄酮)、利尿物质、钙拮抗物质的血管扩张物质等的方法(例如參照专利文献I、专利文献2);添加多酚类的方法(例如參照专利文献3);添加具有血管紧张素I转化酶抑制活性的肽的方法(例如參照专利文献4);通过使用富集有Y -氨基丁酸的大豆胚芽、在酱油醪液汁中大量生成积累Y -氨基丁酸的方法(例如，參照专利文献5)。但是，这些方法具有必须重新制备降压剂的缺点，并且，这些降压剂具有使酱油的味道恶化的危险性。另ー方面，在酱油制造方法中，要求酱油从业人员一个劲儿地努力，以得到良曲，并要求该良曲中酶活性、特别是蛋白酶強大。其原因在于酱油是以氨基酸为主体的调味料，最需要将蛋白质先分解为肽，肽再充分分解为氨基酸。因此，在酱油业界中，考虑寻求并使用分泌強力蛋白酶的曲霉菌，或适当进行曲的原料处理，使曲霉菌充分发育繁殖，使酶活性尽可能大等。因此，目前，在酱油的制造方法中，在制曲中极カ抑制曲霉菌的蛋白酶的分泌，另夕卜，将蛋白酶活性的少量的酱油曲用于具有降血压作用的酱油的制造中仍是未知的。另ー方面，还已知有在45 60°C将酱油曲加温消化3 8小吋、缩短酱油的制造时间(即，进行快速酿造)的方法(例如參照专利文献6)。S卩，已知使用促进蛋白酶的生成的酱油曲，对该曲进行加温消化，由此，快速分解醪成分、特别是蛋白质，快速酿造总氮中50%为a-氨基氮的芳香性优异的酱油。但是，该发明也不能期待酱油的肽(非 a-氨基氮)的増加。这样，在酱油的制造方法中，增大肽含量、得到具有降血压作用酱油仍是未知的。另ー方面，还已知肽通常具有内源性阿片作用、调节免疫作用、促进钙吸收作用、抑制胆固醇上升作用、血管紧张素I转化酶(ACE)抑制作用、抗氧化作用、抗癌作用等功能性(例如，參照专利文献7、非专利文献I)。另外，已知特定的ニ肽Gly-Tyr和Ser-Tyr具有血管紧张素I转化酶抑制作用和降血压作用(下面，有时称为降压肽Gly-Tyr和降压肽Ser-Tyr)(例如，參照非专利文献2)。另外，已知使正常高值血压者和轻度高血压者连续8周摄取含有48 y g/ml的降压肽Gly-Tyr和32 ii g/ml的Ser-Tyr的减盐酱油，与摄取普通减盐酱油时相比,可使这些被检查者的收缩期血压值和扩张期血压值显著降低(例如，非专利文献3參照)。
因此，认为如果可以在酱油制造中大量含有肽类、特别是降压肽Gly-Tyr和Ser-Tyr、得到它们的含量多的酱油，则能够不添加降压剂而得到具有降血压作用的酱油，对于酱油业界来说，是巨大的贡献，但不知道这种方法。另外，通常，将酱油曲和盐水混合时，曲的酶良好地发挥作用，将蛋白质和淀粉充分分解，形成相当粘糊的浓厚粘稠的醪，在该醪液汁中生成积累的肽类在醪的发酵成熟过程中进ー步分解为氨基酸，因此，随着醪的成熟的进展，该肽类逐渐消失。因此，存在难以将这些肽、特别是降压肽Gly-Tyr和Ser-Tyr残留保持到酱油成品的课题。另ー方面，还已知在压榨酱油醪而得到的酱油糟中含有显示血管紧张素(Angiotensin Converting Enzyme)I转化酶抑制活性(下面，有时称为ACE抑制活性)的物质(例如，參照专利文献7)。但是，该显示ACE抑制活性的物质是酱油糟中特有的物质，在酱油中没有发现，因此，由普通酱油中含有的肽的ACE抑制活性得到的降血压作用是非常微弱的，具有在酱油中不添加降压剂难以期待降血压作用的问题。现有技术文献专利文献专利文献I :日本特开2004-290129号公报专利文献2 :日本特开2006-136262号公报专利文献3 :日本特开2004-194515号公报专利文献4 日本特开2004-290088号公报专利文献5 :日本特开平11-151072号公报专利文献6 :专利第2659105号公报专利文献7 日本特开5-279263号公报
非专利文献非专利文献I :Wenyi Wang et al. , Comprehensive Reviews in Food Scienceand Food Safety, 2005, (4)，p.63-78非专利文献2 K. Suetsuna, J. Nutr. Biochem. , 1998, (9), p. 415-419非专利文献3 Jpn Pharmacol Ther (药理与治疗)vol. 36no. 92008, p837 849
发明内容
发明所要解决的课题本发明的课题在于提供ー种酱油，其不添加降压剂，在酱油醪中生成积累大量的肽类、特别是降压肽Gly-Tyr和Ser-Tyr，血管紧张素I转化酶抑制活性高，可以期待降血压作用。用于解决课题的方法为了解决上述课题，本发明的发明人进行了反复深入研究，结果发现，使用蛋白酶活性为20 300U/g曲的酱油曲，在其中混合盐水，进行加温消化，结果得到含有大量的目前已知具有降血压作用的降压肽Gly-Tyr和Ser_Tyr、ACE抑制活性高的酱油；该酱油曲通过在酱油制曲用原料中接种种曲，进行比通常还短的时间即20 36小时制曲管理后，在非常嫩的曲的状态下进行出曲而得到，基于上述认识，完成了本发明。即，本发明是下面的具有降血压作用的酱油及其制造方法。(I)ー种具有降血压作用的酱油，通过包括如下エ序的方法得到混合蛋白酶活性为20 300U/g曲的酱油曲和盐水，制备酱油醪的エ序；加温消化上述酱油醪的エ序。(2)如上述(I)记载的酱油， 其中，血管紧张素I转化酶(ACE)抑制活性(IC5tl值)为3. 0 u 1/ml以下。(3)如上述(I)或(2)记载的酱油，其中，具有降血压作用的酱油含有78 y g/ml以上的降压肽Gly-Tyr、20 u g/ml以上的降压肽Ser-Tyr。(4) ー种含有上述(I) (3)中任一项记载的酱油的具有降血压作用的饮食品。(5) ー种具有降血压作用的酱油的制造方法，其包括混合蛋白酶活性为20 300U/g曲的酱油曲和盐水，制备酱油醪的エ序；加温消化上述酱油醪的エ序。(6) ー种具有降血压作用的酱油的制造方法，其包括混合蛋白酶活性为20 300U/g曲的酱油曲、未制曲蛋白质原料和盐水，制备酱油醪的エ序；加温消化上述酱油醪的エ序。(7)如上述(5)或(6)记载的酱油的制造方法，加温消化的エ序是以品温为45 55°C对上述酱油醪加温消化I 5日的エ序。(8)如上述(5) (7)中任一项记载的酱油的制造方法，还包括向通过加温消化的エ序加温消化得到的酱油醪中添加酱油乳酸菌和/或酱油酵母，进行发酵成熟的エ序。发明的效果本发明能够不添加降压剂，而在酱油醪中生成积累大量的肽类、特别是降压肽Gly-Tyr和Ser-Tyr，能够容易地得到血管紧张素I转化酶抑制活性高、能够期待降血压作用的酱油。
图I是表示酱油曲的蛋白酶活性和制曲时间、氮利用率、ACE抑制活性、降压肽Gly-Tyr (肽GY)及降压肽Ser-Tyr (肽SY)的关系的图。图2是表示本发明的酱油的HPLC色谱的图。图3是表示按照常用方法得到的酱油的HPLC色谱的图。
具体实施例方式本发明中，就使用的酱油曲而言，向蛋白质原料中添加淀粉原料，在其中接种种曲，进行制曲，只要得到的蛋白酶活性为20 300U/g曲的酱油曲，则可以是任意的酱油曲(通常，在制曲结束后的酱油曲中含有25 35%w/w的水分)。这里，“U/g曲”是指每Ig (湿重量)酱油曲的蛋白酶活性(U)。作为ー个例子，可以列举向蛋白质原料中添加淀粉原料，在其中接种种曲，以20 35で、优选25。。 30°C的品温进行制曲管理20 36小时，之后，在非常嫩的曲的状态下出曲。此外，由于制曲时间短于20小时时，成为蛋白酶的活性几乎消失的曲，因此，酱油原料、特别是氮利用率降低，故而不优选。相反，超过36小时时，蛋白酶活性变高，不能实现本发明的目的，故而不优选。
作为上述蛋白质原料，可以列举大豆、脱脂加工大豆和小麦蛋白等。另外，作为淀粉原料，列举麦类(小麦、大麦、黒麦、薏苡)和米类等。另外，将蛋白质原料和淀粉原料混合作为酱油曲原料，其配合比例优选为30 70 70 30，更优选为40 60 60 40。另夕卜，水分优选为35 50% (w/w),更优选为40 45% (w/w)。作为种曲，可以列举酱油曲霉、米曲霉等酱
在本发明中，使用蛋白酶活性为20 300U/g曲、优选为20 235U/g曲的酱油曲是极其重要的。即，在使用不足20U/g曲的酱油曲时，酱油的氮利用率(原料利用率)低，从原料得到的酱油的获取比例降低，故而不优选。相反，超过300U/g曲时，降压肽Gly-Tyr和Ser-Tyr的生成积累量及血管紧张素I转化酶抑制活性骤减，故而不优选。接着，为了实施本发明，在上述酱油曲中混合盐水(下面，有时将其称为酿造)，制备酱油醪。也可以在酿造时或酿造初期(酿造第二 十日以内)，向酱油醪中添加未制曲蛋白质原料(大豆、小麦蛋白等植物性的蛋白质原料)。其比例相对于酱油曲为20% (w/w)以下，接近本酿造酱油的味道，故而优选。作为醪液汁的食盐浓度，以盐水为5 20% (w/v)、优选8 16% (w/v)的方式计算，相对于酱油曲重量(湿重量)，混合100% 300% (v/w)。接着，在能够控制温度的容器中放入这些混合物，进行加温消化。在本发明中，加温消化也是重要的，在不进行加温消化时，在醪液汁中生成积累的肽类、特别是降压肽Gly-Tyr和Ser-Tyr在醪的发酵成熟过程中进ー步分解为氨基酸并逐渐消失，故而不优选。酱油醪的加温消化优选在品温为45 55°C、进行I 5日。温度不足45°C、或时间短时，随着醪的成熟的进展，在醪中生成的肽类逐渐消失，最终肽的含量降低，故而不优选。另外，温度超过55°C时、或时间超过5日时，消化液(酱油)变浓，还附有温醸臭(异臭)，味道恶化，故而不优选。另外，在本发明中，组合20 300U/g曲的利用和酱油醪的加温消化是极其重要的，在只利用任意一方时，不能实现本发明的目的，故而不优选。加温消化后的醪也可以直接作为酱油样的调味料(该“酱油样的调味料”也是本发明“酱油”的实施方式之一)充分利用。加温消化后的醪，适当地按照常用方法进行压榨过滤、加热、沉淀分离(澄清处理)等，能够作为本发明的酱油使用。其中，该加温消化后的醪，进行盐分等调整，使得发酵成熟后的醪液汁的食盐为12 20% (w/v)，之后，在该醪中接种酱油乳酸菌，使乳酸菌充分繁殖进行乳酸发酵，或在该醪中接种酱油酵母，使酵母充分繁殖进行こ醇发酵，或按照此顺序进行该乳酸发酵及该こ醇发酵后，与加温消化后不久相比，成熟时的味道更好，故而优选。乳Ife发酵，在添加乳Ife囷后，将膠品温以20 30 C、pH为4. 7 5. 3的状态保持充分的时间、例如7 60日左右，使乳酸菌充分繁殖、发酵。酵母发酵，在添加酵母菌后，将醪品温以20 35°C、こ醇为0. 5 4% (v/v)左右的状态保持充分的时间、例如7 90日左右,使之发酵成熟。然后，按照常用方法进行压榨过滤、加热、沉淀分离(澄清处理)等，在加温消化后得到进ー步发酵成熟的本发明的酱油。本发明中得到的酱油是ACE抑制活性(IC5tl值)为3.0ia/ml以下的酱油。还含有78 u g/ml以上的降压肽Gly-Tyr、20 ii g/ml以上的降压肽Ser-Tyr,能够期待降血压作用。本发明中得到的酱油中的Gly-Tyr和Ser-Tyr的浓度上限分别为300 u g/ml。因此，通过将本发明的酱油直接(直接以液体状态)或按照常用方法进行冻结干燥、喷雾干燥、转筒式干燥等，形成膏状、固体状、粉末状后，添加到各种汤汁(面条汁等)、调料汁(烤肉用调料汁等)、橙醋、酱汁、调味汁、汤等液体调味料，再添加到水产、畜牧业肉制品(鱼糕、火腿等)食品中，能够得到能够期待降血压作用的这些的饮食品。此外，ACE抑制活性的测定已知有如下所示的几个方法，使用任意ー种方法均能够測定。Kasahara等的方法(Y. Kasahara Clinical Chemistry, 11, 1981, (27)，P. 1922-1925)。Cushman等的方法(D. W. Cushman et al. , Biochemical, Pharmacology, 1971, (20),P.1637-1648)。 Yamamoto的方法(日本胸部疾病学会杂志，1980, (20)P. 297-302，血清血管紧张素转化酶活性測定法的研究)。Lieberman 的方法(Lieberman, Am. J. Med. , 1975, (59)，P. 365-372，)。具体而言，ACE抑制活性(IC50值)能够按照下面的顺序进行測定。使本发明的酱油通过填充有反相系的固相萃取剂的固相萃取容器，用0. I (v/v)%三氟こ酸(TFA)水溶液进行净洗，消除烟酰胺成分；接着，使60% (v/v)こ腈(含有0. I (v/v)%TFA)水溶液通过上述固相萃取容器，使肽溶出；将提取液进行离心浓缩干固，用超纯水再溶解，得到样品(肽成分)。在ACE的酶促反应系中，将造成50%的ACE抑制率的上述样品的浓度換算成作为上述固相萃取容器的处理前的酱油的浓度，将该浓度做为酱油的ACE抑制活性(IC5tl值)。下面，列举实施例对本发明进行具体地说明，但本发明不限定于这些实施例。实施例I(使用低蛋白酶酱油曲，加温消化后，进行发酵成熟的酱油的制造方法)在14kg脱脂加工大豆中洒水130% (w/w)的80°C的温水，利用饱和水蒸汽以蒸汽压カ2kg/cm2 (表压)对其加压加热蒸煮20分钟，得到蒸煮脱脂大豆。另ー方面，按照常用方法对6kg生小麦进行炒熬、粉碎。接着，混合这两种处理原料，制备水分约为40% (w/w)的制曲用原料。在其中接种
0.1% (w/w)的米曲霉(ATCC14895)的麸种曲(フスマ種麹)(有效胞子数I X IO9个/g)，按照常用方法在20 35°C下进行制曲管理，以表I的时间结束制曲，得到具有各蛋白酶活性的酱油曲。在得到的0. 8kg酱油曲中混合约I. 2升盐水，使得消化后的醪液汁的食盐浓度为13. 0% (w/v)，适当搅拌并在50°C的醪品温消化72小时，得到消化醪。接着，将该消化醪冷却至室温(约20°C )后，平均Ig醪中添加I X IO5个酱油乳酸菌(嗜盐四联球菌，Tetragenococcus halophilus),以20°C进行3周的乳酸发酵,得到pH约为
5.2的酱油醪。接着，以成为5X IO5个/g醪的方式添加酱油酵母(嗜盐鲁氏酵母，Zygosaccharomyces rouxii,按照常用方法以25°C的醪品温进行适时通风,进行I个月的发酵成熟。接着，对该成熟醪进行压榨过滤，将得到的轻炸块(酱油)以80°C加热30分钟，放入澄清罐中澄清3日(进行沉淀分离)，得到清澈、味道良好的各种酱油。按照下面方法对得到的酱油的氮利用率、成分分析值、降压肽及ACE抑制活性(IC5tl值)进行測定。在表I及图I表示其結果。此外，已知酱油中，作为ACE抑制物质，除了含有肽之外，还含有烟酰胺。因此，ACE抑制活性(IC50值)測定法中，为了高精度地测定酱油的肽引起的ACE抑制活性，使用填充有反相系的固相萃取剂(例如，十八烷基硅烷化硅胶)的固相萃取容器、例如反相系的固相萃取Cartridge column (Waters公司制Sep-Pak Plus C18等)进行前处理,从酱油中除去烟酰胺成分，将该除去液供于分析。由此，能够高精度地分析酱油的该肽引起的ACE抑制活性。
(I)酱油的氮利用率测定法參照酱油试验法(财团法人日本酱油研究所，昭和60年3月I日发行)、醪的氮溶解利用率进行測定。(2)蛋白酶活性测定法參照酱油试验法(财团法人日本酱油研究所，昭和60年3月I日发行)、酶活性測定法(全蛋白酶)进行測定。S卩，以酪蛋白为基质，以pH7. 0进行反应，按照Folin显色法測定生成的非蛋白质物质，I分钟内使相当于Iu g酪氨酸的非蛋白质物质游离的酶量设为I单位(Unit)，作为每g酱油曲算出。( 3)酱油的成分分析法使用凯氏(Kjeltec)自动分析系统1035 (Actac公司制)、按照常用方法测定可溶性总氮(TN)。NaCl按照酱油试验法(财团法人日本酱油研究所，昭和60年3月I日发行)食盐分的测定法測定。(4)降压肽Gly-Tyr及同Ser-Tyr的测定法使用LC-MS/MS 系统 2695-QuattroMicro API (Waters 公司制)，按照添加校准曲线法求得。(5) ACE活性(IC50值)的测定法将样品100 il I 提供给 Sep-Pak (注册■商标)Plus C18EnvironmentalCartridges(Waters社制),用4ml的0. I (v/v) %三氟こ酸(TFA)水溶液进行净洗,除去烟酰胺成分。接着，在上述柱中流过5ml的60% (v/v)こ腈(含有0. I (v/v)%TFA)水溶液，使肽溶出，使提取液进行离心浓缩干固后，将用Iml的超纯水进行再溶解得到的溶液作为样品(肽成分)。下面，根据将Kasahara的方法改变后的方法实施。使用“ ACE染色试剂盒”(Fuji Lebio公司制)，按照附帯的手册进行。S卩，向200iU的ACE基质溶液(试剂盒附帯)中添加50 u I的样品(肽成分)溶液、50 u I的酶溶液(0. IU/ml ACE (兔肺由来，Sigma公司制)、200mM的pH8. 3的硼酸缓冲液，在37°C反应20分钟。
接着，添加600u I的反应停止 显色反应液(试剂盒附帯)，混合，在37°C静止放置3分钟。显色后，测定505nm中的吸光度。ACE抑制率用下面公式表示。ACE 抑制率(％) = [I — (ODs — ODsb) / (ODc — ODcb)] X 100其中，此时的ODs是如上所述测得的505nm的吸光度、ODsb是代替酶溶液而添加200mM pH8. 3的硼酸缓冲液时的吸光度，0D。是代替样品溶液而添加超纯水时的吸光度，ODcb是代替酶溶液而添加200mMpH8. 3的硼酸缓冲液、代替样品溶液而添加超纯水时的吸光度。另外，在该酶促反应系(显色液添加前)中，以造成50%的酶活性抑制率的样品的原液的浓度(U I/ml)为IC5tl值,用S印-Pak柱的处理前的原液浓度换算表示。
权利要求
1.ー种具有降血压作用的酱油，其特征在于，通过包括如下エ序的方法得到 混合蛋白酶活性为20 300U/g曲的酱油曲和盐水，制备酱油醪的エ序； 加温消化所述酱油醪的エ序。
2.如权利要求I所述的酱油，其特征在干 血管紧张素I转化酶(ACE)抑制活性(IC5tl值)为3. 0 y 1/ml以下。
3.如权利要求I或2所述的酱油，其特征在于 含有78 u g/ml以上的降压肽Gly-Tyr、20 u g/ml以上的降压肽Ser-Tyr。
4.ー种含有权利要求I 3中任ー项所述的酱油的饮食品。
5.ー种具有降血压作用的酱油的制造方法，其特征在于，包括 混合蛋白酶活性为20 300U/g曲的酱油曲和盐水，制备酱油醪的エ序； 加温消化所述酱油醪的エ序。
6.ー种具有降血压作用的酱油的制造方法，其特征在于，包括 混合蛋白酶活性为20 300U/g曲的醫油曲、未制曲蛋白质原料和盐水，制备醫油膠的ェ序； 加温消化所述酱油醪的エ序。
7.如权利要求5或6所述的酱油的制造方法，其特征在于 加温消化的エ序是以品温为45 55°C对所述酱油醪加温消化I 5日的エ序。
8.如权利要求5 7中任一项所述的酱油的制造方法，其特征在于 还包括向通过加温消化的エ序加温消化得到的酱油醪中添加酱油乳酸菌和/或酱油酵母，进行发酵成熟的エ序。
全文摘要
本发明提供一种酱油，其不添加降压剂，大量含有肽类、特别是降压肽Gly-Tyr和降压肽Ser-Tyr，血管紧张素I转化酶抑制活性高，具有降血压作用。在本发明中，在盐水中混合蛋白酶活性为20～300U/g曲的酱油曲，加温消化后，进行压榨过滤，得到课题的酱油。另外，向该加温消化后的醪中添加酱油乳酸菌及酱油酵母，进行发酵成熟后，进行压榨过滤，得到味道良好的课题的酱油。
文档编号A23L1/238GK102665443SQ20108005899
公开日2012年9月12日 申请日期2010年12月24日 优先权日2009年12月25日
发明者仲原丈晴, 内田理一郎, 小野宏树, 花田洋一, 谷泽茂纪, 远藤良知, 青田仁美 申请人:龟甲万株式会社