专利名称：使用硫酯酶变异体的含有脂肪酸的脂质的制造方法
技术领域：
本发明涉及一种使用硫酯酶变异体的脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的制造方法。另外，本发明还涉及含有编码硫酯酶变异体的基因的转化体。
背景技术：
脂肪酸是脂质的主要构成成分之一，在生物体内与甘油形成酯键而构成三酰基甘油等脂质，是在很多的动植物中作为能量源被储存利用的物质。在动植物中储存的脂肪酸和脂质作为食用或者工业用而被广泛利用，例如作为单酰基甘油、二酰基甘油等的食品中间原料和其他各种工业制品的添加剂、中间原料而被利用。另外，还原碳原子数为12 18左右的闻级脂肪酸得到的闻级醇的衍生物被作为表面活性剂而使用。例如烧基硫酸酷盐和烧基苯磺酸盐等作为阴离子表面活性剂，另外，聚氧化烯烷基醚和烷基聚葡萄糖苷等作为非 离子性表面活性剂，都可以作为清洗剂或者杀菌剂而被利用。同样，作为高级醇的衍生物的烷基胺盐和单烷基季胺盐或者二烷基季胺盐作为纤维处理剂和毛发护发素或者杀菌剂，苯甲烷铵型季铵盐作为杀菌剂和防腐剂而被日常利用。进而，碳原子数为18左右的高级醇作为植物的成长促进剂也有用。这样脂肪酸类的利用覆盖多方面，因此，尝试在动植物等中提高在生物体内的脂肪酸和脂质的生产率。例如，提出有通过乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的导入来提高种子中的脂质量的方法(专利文献I、非专利文献I、专利文献5);通过酵母sn-2酰基转移酶(SLCl-I)的导入来提高种子中的脂质量的方法(专利文献2、专利文献3以及非专利文献2);通过二酰基甘油酰基转移酶基因(DGAT)的导入来提高种子中的脂质量的方法(专利文献4和非专利文献3)等。现有技术文献专利文献专利文献I :特开2002-335786号公报专利文献2 :特表平11-506323号公报专利文献3 :国际公开第2008/076377号小册子专利文献4 :国际公开第2000/036114号小册子专利文献5 :美国专利第5，925，805号说明书非专利文献非专利文献I :Madoka Y, Tomizawa K, Mizoi J, Nishidal, Nagano Y, SasakiY. , uChloroplast transformation with modified accD operon increases acetyl-CoAcarboxylase and causes extension of leaf longevity and increase in seed yieldin tobacco”，Plant Cell Physiol. , 2002 Dec, 43 (12)，p. 1518-1525非专利文献2 :Zou J, Katavic V, Giblin EM, Barton DL, MacKenzie SL, KellerWA, Hu X, Taylor DC. , “Modification of seed oil content and acyl compositionin the brassicaceae by expression of a yeast sn-2acyItransferase gene，，，PlantCell,1997 Jun，9 (6),p.909-923非专利文献3 :Jako C, Kumar A, Wei Y, Zou J, Barton DL, Giblin EM, CovelloPS, Taylor DC.，“Seed-specific over-expression of an Arabidopsis cDNA encoding adiacylglycerol acyltransferase enhances seed oil content and seed weight”, PlantPhysiol. , 2001, 126 (2) ,p. 861-87
发明内容
本发明的课题在于提供使用改变了野生型硫酯酶的氨基酸序列的硫酯酶变异体，制造生产率优异的脂肪酸或者含有此脂肪酸的脂质的制造方法。另外，本发明的课题在于提供含有硫酯酶变异体的、脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质生产能力提高的转化体。 本发明者们为了提高动植物等中的脂质生产率而进行了详细探讨。其结果发现，在将来自加州月桂(Umbellularia californica)的硫酯酶的氨基酸序列的一部分改变后，导入该硫酯酶变异体的转化体中，与导入野生型硫酯酶的转化体相比较，脂肪酸及含有该脂肪酸的脂质的生产率显著提高。本发明是基于此发现完成的。本发明涉及使用下述(a) (c)中的任意种的硫酯酶变异体的脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的制造方法。(a)具有在序列号I所示的氨基酸序列中第231位氨基酸从苏氨酸取代为赖氨酸而成的氨基酸序列的硫酯酶变异体、(b)具有在(a)的氨基酸序列中除第231位以外的I个至数个氨基酸被缺失、取代、插入、和/或添加而成的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶变异体、(c)至少具有在(a)或(b)的氨基酸序列中与序列号I所示的氨基酸序列的从第84位至第382位相当的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶变异体。另外，本发明涉及提高含有脂肪酸的脂质的生产率的方法，该方法包含通过向宿主中导入编码上述(a广(C)中的任意种的硫酯酶变异体的基因，从而得到脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的生广能力提闻的转化体的工序。进一步，本发明还涉及向宿主中导入编码上述(a广(C)中的任意种的硫酯酶变异体的基因，从而得到脂肪酸或含有该脂肪酸的脂质的生产能力提高的转化体。根据本发明，可以提供使用硫酯酶变异体、生产率优异的脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的制造方法。另外，根据本发明，可以提供含有硫酯酶变异体的脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的生产能力提高的转化体。本发明的制造方法以及转化体可以适用于脂肪酸和脂质的工业生产。本发明的上述以及其他的特征和优点可以参照适合的附图，从下述的记载中更明确。
[图I]表示导入野生型硫酯酶基因或者硫酯酶变异体基因并转化的大肠杆菌中各脂肪酸的生产量的图。另外，图中的标尺表示从连续进行3次实验的结果得到的标准偏差。[图2]表示导入野生型硫酯酶基因或者硫酯酶变异体基因并转化的大肠杆菌中总脂肪酸生产量的图。另外，图中的标尺表示从连续进行3次实验的结果得到的标准偏差。[图3]表示由拟南芥野生株WT、导入野生型硫酯酶基因的拟南芥Pnapin_BTE、以及导入硫酯酶变异体基因的拟南芥=Pnapin-BTE (T231K)得到的种子中含有的总脂肪酸量的图。[图4]在导入硫酯酶变异体(BTE(MRR197RRH))基因的大肠杆菌、导入野生型硫酯酶(BTE)基因的大肠杆菌、以及导入硫酯酶变异体(BTE (T231K))基因的大肠杆菌中，比较各自的总脂肪酸生产量的图。另外，总脂肪酸生产量通过合计C12 0到C18 1的各脂肪酸算出。各图中的误差棒(error bar)表示从来自3个独立的克隆的培养液中所含的总脂 肪酸生产量算出的标准偏差。
具体实施例方式本发明的脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的制造方法是使用下述(a) (c)中的任意种的硫酯酶变异体的方法。通过将该硫酯酶变异体用于脂肪酸或者脂质的制造中，与使用野生型的硫酯酶的情况相比，可以显著提高脂肪酸以及含有脂肪酸的脂质的生产率。I.硫酯酶变异体本发明中所用的硫酯酶变异体是下述的(a) (c)的硫酯酶变异体。(a)具有在序列号I所示的氨基酸序列中第231位氨基酸从苏氨酸取代为赖氨酸而成的氨基酸序列(即，序列号3所表示的氨基酸序列)的硫酯酶变异体。作为本发明中使用的硫酯酶变异体的第I方式，是具有在序列号I所表示的氨基酸序列中与第231位相当的氨基酸从苏氨酸(Thr)取代为赖氨酸(Lys)而成的氨基酸序列的硫酯酶变异体。序列号I所表示的氨基酸序列为来自加州月桂(Umbellulariacalifornica,也称作California bay)的硫酯酶的氨基酸序列(以下仅称为野生型硫酯酶，简记为BTE)。在序列号I所表示的野生型硫酯酶中，与第231位相当的氨基酸从苏氨酸取代为赖氨酸而成的硫酯酶变异体具有水解酰基-酰基载体蛋白的硫酯键的活性(硫酯酶活性)。(b)具有在(a)的氨基酸序列中除第231位以外的I个至数个氨基酸被缺失、取代、插入、和/或添加而成的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶变异体。作为第2方式，可以列举具有在序列号I所表示的氨基酸序列中第231位氨基酸从苏氨酸取代为赖氨酸，进一步在该氨基酸序列的除第231位以外的位置上I个至数个氨基酸被缺失、取代、插入、和/或添加而成的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶变异体。通常已知，编码酶蛋白质的氨基酸序列不一定是必须全部区域的序列加以保留才显示酶活性，也存在即使氨基酸序列改变了也不会影响酶活性的区域。在这样的对于酶活性不必须的区域中，即使导入氨基酸的缺失、取代、插入或者添加这样的变异，也可以维持酶本来的活性。在本发明中，可以使用通过由此保持了硫酯酶活性并且氨基酸序列的一部分缺失等改变了的变异体。这种情况下，被缺失、取代、插入、和/或添加的氨基酸优选为f 10个，进一步优选为I飞个，特别优选为广2个。进一步优选具有在序列号I所示的氨基酸序列中氨基酸被保留如下、且第231位氨基酸从苏氨酸取代为赖氨酸而成的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的变异体，其中，该氨基酸被保留为第113位氨基酸为缬氨酸或者异亮氨酸，第114位氨基酸为精氨酸，第117位氨基酸为谷氨酸，第118位氨基酸为缬氨酸或者异亮氨酸，第134位氨基酸为谷氨酸或者精氨酸，第135位氨基酸为谷氨酸或者天冬氨酸，第136位氨基酸为苏氨酸或者丙氨酸，第145位氨基酸为甘氨酸、第154位氨基酸为苏氨酸或者丙氨酸，第162位氨基酸为亮氨酸，第163位氨基酸为异亮氨酸、苯丙氨酸或者蛋氨酸，第165位氨基酸为缬氨酸，第176位氨基酸为酪氨酸或者组氨酸，第177位氨基酸为脯氨酸，第179位氨基酸为色氨酸，第181位氨基酸为谷氨酸、天冬氨酸或者天门冬氨，第185位氨基酸为异亮氨酸、缬氨酸或者蛋氨酸，第201位氨基酸为色氨酸或者苯丙氨酸，第215位氨基酸为丙氨酸或者半胱氨酸，第216位氨基酸为丝氨酸或者苏氨酸，第217位氨基酸为丝氨酸，第222位氨基酸蛋氨酸、第226位氨基酸为苏氨酸、第227位氨基酸为精氨酸或者赖氨酸，第229位氨基酸为亮氨酸、苯丙氨酸或者异亮氨酸、第239位氨基酸为谷氨酸或者赖氨酸，第257位氨基酸为赖氨酸或者精氨酸，第260位氨基酸为赖氨酸、精氨酸或者组氨酸，第300位氨基酸为脯氨酸，第309位氨 基酸为亮氨酸或者异亮氨酸，第314位氨基酸为亮氨酸、蛋氨酸或者缬氨酸，第315位氨基酸为谷氨酸或者天冬氨酸，第316位氨基酸为酪氨酸，第317位氨基酸为精氨酸或者赖氨酸，第318位氨基酸为精氨酸或者赖氨酸，第319位氨基酸为谷氨酸。另外，也优选具有在序列号I所示的氨基酸序列中除了上面所举的位置以外的区域内I个至数个氨基酸被缺失、取代、插入、和/或添加而成的氨基酸序列，而且硫酯酶活性被保持的变异体。这种情况下，被缺失、取代、插入、和/或添加的氨基酸优选为f 10个，进一步优选为Γ5个，特别优选为I 2个。特别地，优选使用具有与序列号I中第8Γ230位以及第232 382位的区域相当的氨基酸序列被保留、且第231位氨基酸从苏氨酸取代为赖氨酸而成的氨基酸序列，而且硫酯酶活性被保持的变异体。另外，还优选具有在序列号I所表示的氨基酸序列中除了上述所举的位置以外的区域内I个至数个氨基酸被缺失、取代、插入、和/或添加而成的氨基酸序列，而且硫酯酶活性被保持的变异体。在这种情况下，被缺失、取代、插入、和/或添加的氨基酸优选为广10个，进一步优选为Γ5个，特别优选为Γ2个。(c)至少具有在(a)或(b)的氨基酸序列中与序列号I所示的氨基酸序列的从第84位至第382位相当的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶变异体。作为第3方式，可以举上述(C)的变异体。这是在本发明中特别优选的方式。已知在序列号I所表示的野生型硫酯酶的氨基酸序列中，从第84位至第382位的区域内对于作为硫酯酶发挥作用特别重要，该蛋白质是显示硫酯酶活性非常必要的区域(参照 Voelker, T. A. , A. C. Worrell, L. Anderson, J. Bleibaum, C. Fan, D. H. Hawkins, S.E. Radke, and Η. M. Davies, “Fatty acid biosynthesis redirected to medium chainsin transgenic oilseed plants，，，Science, 1992，257，p. 72-74)。具有在序列号 I 所不的氨基酸序列中至少与从第84位至第382位的区域相当的氨基酸序列的蛋白质能够显示硫酯酶活性。因此，具有在上述(a)或(b)的氨基酸序列中至少与序列号I所表示的氨基酸序列的从第84位至第382位的区域的氨基酸序列相当的蛋白质也可以作为本发明的硫酯酶变异体使用。以下，将本发明中所用的上述(a) (c)的硫酯酶变异体统称为硫酯酶变异体，简记为 BTE (T231K)。
硫酯酶是作为参与甘油三酯生物合成体系的酶的酰基-酰基载体蛋白(Acyl-ACP )硫酯酶，是水解作为叶绿体内或者色素体中脂肪酸生物合成过程的中间体的酰基-酰基载体蛋白(由作为脂肪酸残基的酰基和酰基载体蛋白构成的复合体)的硫酯键，生成游离脂肪酸的酶。通过硫酯酶的作用，在酰基载体蛋白上的脂肪酸合成结束，游离的脂肪酸从色素体被输送供给到甘油三酯的合成中。已知硫酯酶根据构成作为基质的酰基-酰基载体蛋白酶的脂肪酸残基的种类不同而显示不同的反应特异性，因此被认为是决定生物体内的脂肪酸组成的重要因素。具有序列号I所表示的氨基酸序列的野生型硫酯酶在酰基上带有月桂酸(12 0)残基的基质上具有特别高的特异性。已知如果将野生型硫酯酶导入到大肠杆菌或者拟南芥中进行转化的话，在转化体内积累月桂酸(Journal of Bacteriology, Vol. 176, No. 23, p. 7320-7327，1994、特表平7-501924号公报)。另外，报道有在序列号I所表示的野生型硫酯酶的氨基酸序列中分别将第197位氨基酸从蛋氨酸取代为精氨酸，将第199位氨基酸从精氨酸取代为组氨酸，以及将第231位氨基酸从苏氨酸取代为赖氨酸而得到的酶变异体中， 特别高的基质特异性从碳原子数为12 (C12 :0)的脂肪酸向碳原子数为14 (C14 :0)的脂肪酸变化(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92，pp. 10639-10643，1995)。进一步，在该文献中，记载了在仅将第231位氨基酸单独从苏氨酸取代为赖氨酸而得到的酶变异体中，在该基质识别上没有变化。但是，改变了野生型硫酯酶的氨基酸序列的硫酯酶变异体与野生型硫酯酶相比，提高在生物体内的脂肪酸以及含有该脂肪酸的脂质的生产率，对于此没有任何的报告，这是这次本发明者们新得到的发现。作为本发明中使用的得到硫酯酶变异体的方法没有特别限定，可以通过通常的遗传工程学的方法得到。例如，获取野生型硫酯酶的氨基酸序列信息或者碱基序列信息，基于这些信息通过部位特定变异导入法等对所希望的位置的氨基酸序列或者碱基序列进行取代(变异)。野生型硫酯酶的氨基酸序列(序列号I)以及编码此氨基酸序列的碱基序列(例如序列号2)可以由GenBank等数据库中得到(例如,在GenBank中，蛋白质序列AAA34215. I,mRNA序列M94159. I)。基于得到的序列，可以通过人工合成取得编码野生型硫酯酶的基因。基因的人工合成可以利用Irwitrogen公司等的服务。另外，也可以通过从加州月桂克隆编码的野生型硫酯酶的基因而获得，例如，可以通过Molecular Cloning-A LABORATORYMANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David ff. Russell, Cold Spring HarborLaboratory Press (2001)]记载的方法等进行。作为部位特异变异的导入方法，可以列举后述实施例中使用的利用重叠延伸拼接(Splicing overlap extension) (SOE) PCR 反应(Horton et al. , Gene 77, 61-68, 1989)的方法、ODA 法(Hashimoto-Gotoh et al. , Gene, 152, 271-276，1995)、Kunkel 法(Kunkel,T. A.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985，82，488)等。另外，也可以利用定点突变系统(Site-Directed Mutagenesis System) Mutan-Super Express Kmi式剂盒(TAKARA ΒΙΟINC.)、转化子 TM 定点突变(Transformer TM Site-Directed Mutagenesis)试剂盒(Clonetech公司)、K0D-Plus_Mutagenesis试剂盒(东洋纺社)等市售的试剂盒。其中，在本发明中优选通过SOE-PCR法进行。
作为调制编码本发明中所用的硫酯酶变异体的基因的具体方法，首先用限制性内切酶处理人工合成的野生型硫酯酶基因的碱基序列(例如，序列号2所表示的碱基序列)，并引入载体(vector)中。接着，将得到的载体DNA作为模板，例如，分别使用含有编码在序列号I所表示的氨基酸序列中第231位氨基酸从苏氨酸取代为赖氨酸而成的氨基酸序列的碱基序列的寡核苷酸(例如，具有序列号7或8所表示的碱基序列的寡核苷酸)作为一个引物，使用含有硫酯酶基因的两个末端附近的碱基序列的寡核苷酸(例如，具有序列号5或6所表示的碱基序列的寡核苷酸)作为另一个引物，用PCR法扩增2种DNA片段。将得到的2种DNA片段作为模板，再次使用含有硫酯酶基因的两个末端附近的碱基序列的寡核苷酸引物(例如，具有序列号5或6所表示的碱基序列的寡核苷酸)，通过重叠延伸拼接(SOE) PCR可以得到具有序列号3所表示的氨基酸序列所对应的碱基序列(例如，序列号4)的DNA片段。在此，作为PCR的反应条件的优选例子，可以举在94° C下进行将双链DNA转变为单链的热变性反应30秒钟，再在55° C下进行将引物对杂交于单链DNA上的退火反应约30秒钟， 再在72° C下进行使DNA聚合酶作用的伸长反应约70秒钟，并将此作为一个循环，进行30次循环。2.转化体本发明能够提供如下转化体，该转化体是向宿主中导入编码上述(a广(C)中的任意种的硫酯酶变异体的基因而得到的转化体，并且脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的生产能力得到提高。具有编码硫酯酶变异体的基因的本发明的转化体，与具有野生型硫酯酶基因的转化体相比，脂肪酸和含有该脂肪酸的脂质的生产能力显著提高。另外，在本发明中，关于野生型硫酯酶以及硫酯酶变异体的脂肪酸和含有该脂肪酸的脂质的生产能力，可以通过实施例中使用的方法进行测定。本发明的转化体可以通过将编码硫酯酶变异体的基因通过常用的基因工程学的方法导入宿主中得到。具体而言，可以通过调制能使编码硫酯酶变异体的基因在宿主细胞中表达的载体，并将其导入宿主细胞中使宿主细胞进行转化而制作。接下来通过在适宜条件下培养得到的转化体，可以在转化体内制造脂肪酸和含有脂肪酸的油脂。编码硫酯酶变异体的基因的碱基序列可以从上述(a) (c)的硫酯酶变异体的氨基酸，通过通常的方法得到。具体来说，作为编码硫酯酶变异体的基因的碱基序列，可以举下述的(d) (f)的碱基序列，但是不限定于此。(d)序列号2所表示的碱基序列中编码第69f693位的苏氨酸的碱基被取代为编码赖氨酸的碱基而成的碱基序列(例如，序列号4所表示的碱基序列)。(e)在(d)的碱基序列中除第691飞93位以外的I个至数个碱基被缺失、取代、插入、和/或添加而成的喊基序列，通过由该喊基序列构成的DNA所编码的蛋白质具有硫酷酶活性。另外，对于被缺失、取代、插入和/或添加的碱基的位置以及个数，可以参照上述(b)的硫酯酶变异体的氨基酸序列的保留区域，以保持硫酯酶活性的方式进行适当设计。(f)至少含有在(d)或者(e)的碱基序列中与序列号2所示的碱基序列的从第250位至第1149位相当的碱基序列的碱基序列。作为转化体的宿主没有特别限定，可以使用微生物、植物体、动物体。即使是本来不具有识别碳原子数为12的脂肪酸作为基质的硫酯酶的生物也可以作为宿主使用。在本发明中，从制造效率和得到的脂肪酸以及脂质的利用性的观点出发，优选使用微生物和植物体作为宿主。作为微生物，可以使用属于埃希氏菌(Escherichia)属的微生物和属于芽孢杆菌(Bacillus)属的微生物等原核生物，或者酵母和丝状菌等真核微生物，其中，优选大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtil is)、圆红冬抱酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、被抱霉菌(Mortierella巫_)，特另Il优选大肠杆菌。作为植物体，优选拟南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜籽、椰子、踪榈(palm)、萼距花(Cuphea)、麻疯树(Jatropha),特别优选拟南芥。作为所使用的载体，只要是可以向宿主中导入编码硫酯酶变异体的基因，在宿主细胞内可以表达该基因的载体都可以。例如，可以使用如下载体，该载体是具有与所导入的宿主的种类对应的启动子和终止子等的表达调节区域的表达载体，并且具有复制起始点和选择标记等。另外，也可以是在质粒等的染色体外自行增殖 复制的载体，也可以是引入至染色体内的载体。
作为具体的载体，在将微生物作为宿主的情况下，例如可以列举pBluescript IISK(-) (Stratagene 公司制造)、pUCl 19 (宝酒造公司制造)、pET 类载体(TAKARA BIO INC.制造)、pGEX类载体(GE Healthcare公司制造)、pCold类载体(TAKARA BIO INC.制造)、PHY300PLK (TAKARABIO INC.制造)、pUBllO (Mckenzie, T. et al.，(1986)，Plasmidl5(2) ;ρ· 93-103)、pBR322 (TAKARA BIO INC.制造)、pRS403 (STRATAGENE JAPAN Κ. K.制造)、PMW218/219 (NIPPON GENE CO. , LTD.制造)等。在将植物细胞作为宿主的情况下，例如，pRI类载体(TAKARABIO INC.制造)、pBI类载体(Clontech公司制造)、IN3类载体(INPLANTA INNOVATIONS INC.制造)等。特别在使用大肠杆菌作为宿主的情况下，优选使用 pBluescript II SK(-) (Stratagene 公司制造)、pMW218/219 (NIPPON GENE CO. , LTD.制造)，在使用拟南芥作为宿主的情况下，优选使用pRI类载体(TAKARA BIO INC.制造)、pBI类载体(Clontech公司制造)。启动子和终止子等的表达调节区域和选择标记的种类也没有特别限定，可以根据通常使用的导入启动子和标记等的宿主的种类进行适当选择使用。具体来说，作为启动子，可以举Iac启动子、trp启动子、tac启动子、trc启动子、T7启动子、SpoVG启动子、花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus) 35SRNA启动子、肌动蛋白(actin)和泛素(ubiquitin)等看家基因(housekeeping gene)的启动子、来自油菜籽的Napin基因启动子、来自植物的Rubisco启动子等。另外，作为选择标记，可以列举抗生素抗性基因(氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、大观霉素抗性基因、四环素抗性基因、杀稻瘟素S抗性基因、双丙氨磷抗性基因、以及潮霉素抗性基因)等抗药基因。进一步，也可以使用关系到营养要求性的基因的缺损等作为选择标记基因。可以通过将编码硫酯酶变异体的基因通过限制内切酶处理或者连接反应等通常的方法引入这样的载体中来构筑转化体用载体。作为转化方法，只要是能向宿主中导入目标基因的方法，就没有特别限定。可以使用例如用I丐离子的方法、一般的感受态细胞(competent cells)转化方法(J.Bacterial. 93,1925 (1967))、原生质体转化法(Mol. Gen. Genet. 168，111 (1979))、电穿孔法(FEMSMicrobiol. Lett. 55，135 (1990))或者 LP 转化方法(T. Akamatsu 和 J.Sekiguchi, Archives ofMicrobiology, 1987, 146，ρ· 353-357;Τ· Akamatsu和 H. Taguchi, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2001, 65, 4, p. 823-829)等。
另外，导入目标基因片段的转化体的选择可以利用选择标记等进行。例如，来自载体的抗药基因在转化时与目标DNA片段同时导入到宿主细胞中的结果，转化体获得抗药性作为指标进行。另外，也可以通过将基因组作为模板的PCR法等，确认目标DNA片段的导入。3.脂肪酸以及含有该脂肪酸的脂质的制造方法本发明的脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的制造方法可以使用上述的硫酯酶变异体。具体来说，可以列举使用含有编码硫酯酶变异体的基因的转化体的方法。另外，也可以使用精制的Acyl-ACP和硫酯酶通过在体外进行从Acyl-ACP上分离脂肪酸的方法(Yuanet al.，PNAS, 1995，(92)，p. 10639-10643)等的方法来制造脂肪酸和脂质。在本发明的制造方法中，优选使用具有编码硫酯酶变异体的基因的转化体，在该变异体内产生脂肪酸和含有该脂肪酸的脂质，并进行收集的方法。具体来说，优选在得到导入上述的编码硫酯酶变异体的基因的转化体(重组体)之后，在适当的条件下培养·繁殖该转化体，并从培养物和转化体中收集脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质。转化体的培养·繁殖条件可以根据基因被导入的宿主的种类进行选择，可以采用适当优选的条件。作为一个例子，可以举在使用大肠杆菌作为宿主的转化体的情况下，在LB培养基中在3(T37° C下进行O. 5 1天培养。或者，在使用拟南芥作为宿主的转化体的情况下，在温度条件为2(Γ25° C、连续照射白色光或者以明期为16小时且暗期为8小时等的光条件下进行Γ2个月培育。另外，从脂肪酸和脂质的生产效率的观点出发，也可以在培养基中添加例如作为硫酯酶的基质或者与脂肪酸生物合成体系相关的前体物质的甘油、醋酸、丙二酸等。在培养·繁殖转化体并产生脂肪酸和脂质之后，通过从培养物和转化体中将脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质进行分离、精制等，从而回收。作为分离、回收在转化体中产生的脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的方法不特别限定，可以通过在分离通常生物体内的脂质成分等时候所用的方法进行。例如，可以通过过滤、离心分离、细胞的破碎、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、氯仿/甲醇提取法、己烷提取法、乙醇提取法等从培养物和转化体中分离、回收脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质成分。另外，在更大规模的情况下，可以通过从培养物和转化体中压榨或者提取油分进行回收之后，进行脱胶、脱酸、脱色、脱蜡、脱臭等一般的精制而得到脂质。在分离了含有该脂肪酸的脂质成分之后，可以通过水解分离了的脂质来得到脂肪酸。作为从脂质成分中分离脂肪酸的方法，具体来说可以列举在碱溶液中以70° C左右的高温进行处理的方法、进行脂肪酶处理的方法、使用高压热水进行分解的方法等。 这样可以使用硫酯酶变异体来制造脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质。特别地，本发明的制造方法优选用于碳原子数为12以上的长链脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的制造，进一步优选用于碳原子数为12 18的脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的制造，更加优选用于碳原子数为12 14的脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的制造，特别优选用于制造月桂酸或者含有该月桂酸的脂质的制造。通过本发明的制造方法、转化体得到的脂肪酸和脂质，除了用于食用之外，还可以作为乳化剂配合于化妆品等中，作为肥皂和洗剂等的洗涤剂、纤维处理剂、毛发护发素、或者杀菌剂和防腐剂来利用。实施例
以下，基于实施例对本发明进行进一步详细地说明，但本发明不限定于此。实施例I将硫酯酶变异体[BTE (T231K)]基因导入大肠杆菌中的转化体的构筑以及转化体中脂肪酸和脂质的制造I.野生型硫酯酶(BTE)基因的表达质粒的构筑将由序列号2所表示的碱基序列所构成的编码野生型硫酯酶的基因作为模板，通过使用下述表I所示的序列号5和序列号6的引物对的PCR反应，得到野生型硫酯酶基因的DNA片段。另外，具有序列号2的碱基序列的基因利用Invitrogen (株)提供的定制合成服务获得。用限制性内切酶I消化由PCR反应获得的野生型硫酯酶基因片段。另外，用Xba I 消化质粒载体 pBluescriptll SK(-) (Stratagene 公司，San Diego, California),之后进行脱磷酸化处理。通过将这两个限制性内切酶消化物由连接反应进行连接，从而在pBluescriptll SK(-)的^ I位点上插入野生型硫酯酶基因片段(序列号2所表示的碱基序列中，第249位 第1149位碱基序列)，以与来自载体的LacZ蛋白质的N末端侧的第27位的氨基酸融合的形态来构筑野生型硫酯酶表达的质粒。所得到的质粒通过DNA测序法确认插入了编码野生型硫酯酶的基因。2.硫酯酶变异体(BTE (T231K))基因表达质粒的构筑将上述I.中构筑的野生型硫酯酶表达质粒作为模板，通过使用下述表I所示的序列号5和序列号8的引物对、以及序列号6以及序列号7的引物对的PCR反应来扩增2种基因片段。将这两种片段作为模板，再次使用序列号5以及序列号6的引物对进行重叠延伸拼接法(SOE)PCR反应(Horton et al.，Gene，77，61 — 68，1989)，获得作为序列号2所表示的野生型硫酯酶的第691飞93位的碱基序列的ACA (Thr)被取代为AAG (Lys)而成的硫酯酶变异体基因的DNA片段。将得到的硫酯酶变异体基因的DNA片段用限制性内切酶迪旦
I消化。另外，用Xba I消化质粒载体pBluescriptll SK(-) (Stratagene公司),之后进行脱磷酸化处理。通过将这两种消化物用连接反应进行连接，从而在pBluescriptll SK(-)的Sm I位点上插入硫酯酶变异体基因片段(在序列号4所表示的碱基序列中，第249位"1149位的碱基序列)，以与来自载体的LacZ蛋白质的N末端侧第27位的氨基酸融合的形式来构筑硫酯酶变异体表达的质粒。得到的质粒通过DNA测序法，确认插入了编码硫酯酶变异体的基因。[表 I]
权利要求
1.一种脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的制造方法，其中， 所述制造方法使用下述(a) (C)中的任意种的硫酯酶变异体， Ca)具有在序列号I所示的氨基酸序列中第231位氨基酸从苏氨酸取代为赖氨酸而成的氨基酸序列的硫酯酶变异体、 (b)具有在(a)的氨基酸序列中除第231位以外的I个至数个氨基酸被缺失、取代、插入、和/或添加而成的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶变异体、 (C)至少具有在(a)或(b)的氨基酸序列中与序列号I所示的氨基酸序列的从第84位至第382位相当的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶变异体。
2.如权利要求I所述的脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的制造方法，其中， 所述制造方法包括 向宿主中导入编码上述(a广(C)中的任意种的硫酯酶变异体的基因，从而得到脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的生广能力提闻的转化体的エ序；和从得到的转化体中提取含有脂肪酸的脂质的エ序。
3.如权利要求I或2所述的脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的制造方法，其中， 所述脂肪酸为碳原子数为12以上的长链脂肪酸。
4.如权利要求Γ3中任一项所述的脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的制造方法，其中， 所述脂肪酸为月桂酸。
5.如权利要求2 4中任一项所述的脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的制造方法，其中， 所述宿主为植物或者微生物。
6.如权利要求2飞中任一项所述的脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的制造方法，其中， 所述宿主为拟南芥或者大肠杆菌。
7.一种提高含有脂肪酸的脂质的生产能力的方法，其中， 所述方法包括向宿主中导入编码下述(a广(C)中的任意种的硫酯酶变异体的基因，从而得到脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的生产能力提高的转化体的エ序， Ca)具有在序列号I所示的氨基酸序列中第231位氨基酸从苏氨酸取代为赖氨酸而成的氨基酸序列的硫酯酶变异体、 (b)具有在(a)的氨基酸序列中除第231位以外的I个至数个氨基酸被缺失、取代、插入、和/或添加而成的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶变异体、 (C)至少具有在(a)或(b)的氨基酸序列中与序列号I所示的氨基酸序列的从第84位至第382位相当的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶变异体。
8.一种转化体，其中， 所述转化体是向宿主中导入编码下述(a) (c)中的任意种的硫酯酶变异体的基因而得到的，并且提高脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的生产能力， Ca)具有在序列号I所示的氨基酸序列中第231位氨基酸从苏氨酸取代为赖氨酸而成的氨基酸序列的硫酯酶变异体、 (b)具有在(a)的氨基酸序列中除第231位以外的I个至数个氨基酸被缺失、取代、插入、和/或添加而成的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶变异体、 (C)至少具有在(a)或(b)的氨基酸序列中与序列号I所示的氨基酸序列的从第84位至第382位相当的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶变异体。
9.如权利要求8所述的转化体，其中， 所述宿主为植物或者微生物。
10.如权利要求8或9所述的转化体，其中， 所述宿主为拟南芥或者大肠杆菌。
全文摘要
本发明涉及一种使用硫酯酶变异体的脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的制造方法，其中所述硫酯酶变异体具有在序列号1所示的氨基酸序列中第231位氨基酸从苏氨酸取代为赖氨酸而成的氨基酸序列，并且，本发明还提供一种具有编码该硫酯酶变异体的基因，并且能够提高脂肪酸或者含有该脂肪酸的脂质的生产能力的转化体。
文档编号C12N15/09GK102686737SQ201080058720
公开日2012年9月19日 申请日期2010年12月3日 优先权日2009年12月25日
发明者东条卓人, 远藤圭二 申请人:花王株式会社