自油底物制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及在油底物上制备聚羟基脂肪酸酯（PHA)的方法，所述油底物包括植物 油和/或食用油和/或废食用油，优选为煎炸油，在所述油底物上使细菌菌株钩虫贪铜菌 H16(Cupriavidus necator H16)生长，将油转化成PHA，且同时产生细胞外的脂肪分解酶， 在完成PHA的制备和分离之前，在发酵过程中自培养基中至少部分地分离所述细胞外的脂 肪分解酶。
【背景技术】
[0002] 制造生物材料的一种最有效的方法是利用发生在微生物中的自然过程。一些细菌 从存在于环境中的物质创造储备（reserve)聚合物PHA，它们将所述物质用作食物。细菌为 将来存储这种聚合物，然后，在饥饿时期，它们可以将其作为内部食物使用。
[0003] 聚羟基脂肪酸酯（PHAs)是由一些细菌菌株作为能量储存或储备而合成的光学活 性聚酯组。PHA的单体是（R)-3-羟基烷酸。由于负责合成PHA-PHA合酶的酶的立体专一 性，所有的单体结构单元处于（R)构型。只有在少数情况下，在聚酯中发现少量（S)单体。 取决于微生物和生长条件，PHA的分子量范围为从200, OOODa至3, 000, OOODa。PHA以颗粒 的形式见于细胞质的细胞中，所述颗粒的大小从0. 2 ym至0. 5 ym各不相同[1]。
[0004] PHA可以构成高达90%的细胞重量。不像其他的生物聚合物，诸如多糖、蛋白质或 DNA，PHA是热塑性的。由于它们的力学和工艺性能，对于它们的适用性，PHA聚合物是非常 令人关注的，其可以是自油所合成产生的塑料的替代品[2]。
[0005] 根据单体结构单元中的原子的数目，我们区分其中每单体具有3至5个碳原的短 链长度的PHA(SCL)和其中每单体具有6至14个碳原子的中链长度的PHA(MCL)。PHA的结 构示于图1中，其中对于短链长度的PHA，其使用R = CH3-C5Hn，对于短链长度的PHA，R = 。6氏3_。141^29。
[0006] 当Lemoigne设法从巨大芽孢杆菌细菌分离聚羟基丁酸酯（PHB)时，这是早在1926 年。在二十世纪50年代后期，在许多革兰氏阴性细菌物种中，确认了 PHB作为能量和碳储 备形式的存在。除了 PHB以外，在1974年还分离了含有3-羟基戊酸酯和3-羟基己酸酯的 共聚物。从那时起，已经确认了能够合成聚羟基脂肪酸酯的许多微生物，包括工业菌株。这 些都是革兰氏阳性和革兰氏阴性菌（自养的、异养的、光养的；好氧的以及厌氧的-参照专 利W02009156950A2)，但它们也包括古细菌的一些菌株。在碳源充足供应且缺乏其他营养物 的条件下，微生物合成PHA作为能量和碳的储备形式。在碳源用尽后，然后利用PHA作为能 源和碳源。PHA同时充当碳源和能量的理想的储备形式，这是由它们的低溶解性和高分子量 赋予的。由于这些性质，它们实质上不参与细胞中的渗透压[1]。
[0007] 1976年，英国公司帝国化学工业公司（ICI)-认识到羟基丁酸酯取代合成的聚合 物-主要是石化聚合物的潜力。虽然PHB的细菌生产是昂贵的，但预计油的飙升的价格会 使PHB的细菌生产是有成本效益的。由于油价的预期的增加从未发生过，聚羟基脂肪酸酯 发现其用途首先是作为特殊的生物可降解的和生物相容性的材料。然而由于价格高，已知 在"Biopol "商标下的聚羟基丁酸酯和P (HB-co-HV)(羟基丁酸酯和羟基戊酸酯的共聚物） 的市场渗透率是相当不足的。1990年，德国公司威娜（Wella)使用Biopol制造的瓶来用于 新的洗发剂。1996年，美国公司孟山都自ICI的子公司ZENECA BioProducts购买生物聚合 物（Biopol)材料。即使在今天，还提交以通过利用转基因植物来生产生Biopol的专利，这 将降低生产成本（例如 US 2003/0017576 A1，US 2004/0101865 A1)。
[0008] PHB生物合成的生物化学方面被广泛研宄。利用大多数细菌，例如真养产碱杆菌 (Alcaligenes eutrophus)(又真氧产喊杆菌（Ralstonia eutropha);现在的钩虫贪铜菌 (Cupriavidus necator))在三步骤反应中合成PHB。首先，在由3-酮硫解酶催化的反应中， 两分子乙酰辅酶A偶联以形成乙酰乙酰辅酶A。在由NADPH依赖性乙酰乙酰辅酶A还原酶 催化的反应中，乙酰乙酰辅酶A随后且立体专一性地被还原成（R)-3-羟基丁酰辅酶A。最 后，通过酶PHB合酶聚合（R) -3-羟基丁酰辅酶A分子而合成PHB [1]。
[0009] PHB生物合成的示意图示于图2。
[0010] 当碳源是足量可得时，且在例如氮、铁、磷、硫、钾或氧受限下，PHB生物合成发生。 在酶水平调控PHB合成。从PHB合成的调控的角度来说，乙酰辅酶A和自由HSCoA的细胞 内浓度是至关重要的。在平衡生长的条件下，乙酰辅酶A在克雷布斯循环中被氧化。在氧 化的过程中，产生了进一步用于生物合成的目的的NADH。在停止培养物（culture)生长后， NADH的浓度增加，同时柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶的活性降低。然后乙酰辅酶A在克雷 布斯循环中不能被氧化，而进入PHB生物合成途径。3-酮硫解酶被自由的HSCoA抑制，所述 自由的HSCoA由在正常生长条件下、在克雷布斯循环中的乙酰-CoA的氧化而生成[4]。
[0011] 细菌的一些菌株产生各种共聚物PHA。共聚物PHB和PHV可以例如通过在包括葡 萄糖和丙酸的底物上生长时的真养产碱杆菌或其它类型的微生物而合成，或直接由3-羟 基戊酸酯（3HV)前体而合成。如果使用丙酸，所述合成类似于PHB的合成，所不同的是乙酰 辅酶A与丙酰辅酶A缩合形成3-酮基戊酰辅酶A (3-ketovaleryl-CoA)，这导致3-羟基戊 酸酯并入到聚合物结构中。如果使用具有奇数个碳原子的酸作为碳源，3-羟基戊酸酯直接 自脂肪酸的0氧化产生。在真养产碱杆菌的情况下，也正是培养基（medium)中的低溶解 氧水平增加了 3-羟基戊酸酯在聚合物结构中的并入[1]。PHB和P(HB-共-HV)的结构的 示意图示于图3。
[0012] 一些微生物（诸如真养产碱杆菌的一些突变体）当在不包括3-羟基戊酸酯的前 体的培养基中生长时，能够合成P(HB-共-HV)。3-羟基丁酸酯和4-羟基丁酸酯的共聚物 可以在真养产碱杆菌中由4-羟基丁酸、1，4-丁二醇、丁内酯、4-氯丁酸酯[1]合成。
[0013] PHA以颗粒的形式在细胞内储存（cbposited)。颗粒的数目和尺寸取决于生长条 件，也在不同的细菌培养物内变化。PHB颗粒的密度范围为约1. 18g. cm_3至1. 24g. cm_3，MCL PHA颗粒的密度约为1.05g. cnT3。该颗粒包含聚醋、蛋白质和脂质。所述颗粒具有聚醋核、