一种联产Surfactin和Plipastatin的枯草芽孢杆菌菌株及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和微生物发酵领域，涉及一种联产Surfactin和 Plipastatin的枯草芽孢杆菌菌株，具体涉及该枯草芽孢杆菌及其在构建过程中获得的重 组质粒pDL-PSQ、该枯草芽孢杆菌的构建方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 芽孢杆菌是自然界中分布非常广泛的一类革兰氏阳性细菌，其中枯草芽孢杆菌和 淀粉液化芽孢杆菌作为土壤和植物微生态优势菌群，可以产生多种植物病害防治方面有广 泛应用价值的脂肽类抗菌物质如:Surfactin，是由一条含有13-14个碳原子的β-羟基脂肪 酸链和7个氨基酸缩肽组成的环状脂肽，作为一种很强的生物表面活性剂，还具有抗细菌、 抗肿瘤、抗病毒和防止纤维蛋白凝块等生物活性。Fengycin或Plipastatin是由14-18个碳 原子组成的β-羟基脂肪酸和成环十肽两部分组成;对丝状真菌具有很好的抑制活性。
[0003] Surf act in和Plipastatin均是由芽孢杆菌中的非核糖体肽合成酶系催化产生的 次级代谢产物，在合成过程中，4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（由sfp基因编码)是必不可 少的功能酶，如若缺失，将不能生产Surfactin和Plipastatin。同时，degQ基因是一种多效 性的调控基因，有研究表明，该基因对Plipastatin的合成具有上调控作用。B. subtil is pB2基因组中含有完整的Surf act in合成酶srf A操纵子和Plipastatin合成酶pps操纵子， 但由于sfp基因和degQ基因碱基突变失活，导致B. subtil is pB2不能生产Surfactin和 Plipastatin。
[0004] 由于产环脂肽类化合物的野生型芽孢杆菌都难以被转化，限制了非核糖体肽合成 酶系的进一步研究，B.subtilis pB2作为模式菌枯草芽孢杆菌，其转化方法已成熟，如若利 用同源重组的方法，将有功能活性的sfp基因和degQ基因导入B.subtilis pB2基因组中，使 其恢复生产Surf act in和Plipastatin的能力，贝lj会对后续Plipastatin合成酶的结构与功 能的深入研究提供先决条件，同时开发具有新的微生物来源的脂肽类化合物的潜力。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种运用同源重组的方法，将有功能活 性的sfp基因和degQ基因一起整合到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is )pB2基因组的解淀 粉酶基因 amyE位点上，筛选获得了一株联产Surfactin和Plipastatin的重组菌株 B.subtilis pB2_L〇
[0006] 本发明目的通过如下手段获得：
[0007] 1.本发明提供一种枯草芽孢杆菌菌株，该菌株联产Surfactin和Plipastatin，命 名为PB2-L，在2015年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏号为CGMCC No. 11723,分类名为:枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis;保藏地址为:北京市 朝阳区北辰西路1号院3号。
[0008] 2.本发明还提供一种重组质粒pDL-PSQ，该重组质粒序列如SEQ ID N0.1所示，包 括sfp基因和degQ基因。
[0009] 3.上述2提供的重组质粒pDL-PSQ，该重组质粒以P43基因为启动子，amyE为同源 臂。
[0010] 4.本发明还提供一种联产Surf act in和Plipastat in的枯草芽孢杆菌工程菌的构 建方法，该方法包括如下步骤：
[0011] (1)设计引物对P43-F和P43-R、sfp-F和sfp-R、degQ_F和degQ-R:以B · subtil is fmbj的基因组DNA为模板，PCR扩增sfp基因和degQ基因；以B.subtilis pB2基因组DNA为模 板，PCR扩增启动子P43基因；
[0012] (2)设计引物对PS-F和PS-R，通过重叠延伸PCR扩增，获得融合片段P43-sfp;
[0013] ⑶用限制性内切酶进行酶切，并通过连接反应将degQ基因片段插入质粒PDL的酶 切位点之间得到质粒pDL-degQ;
[0014] (4)用限制性内切酶进行酶切，并通过连接反应将融合片段P43-Sfp插入质粒PDL- degQ，最后获得重组整合质粒pDL-PSQ;
[0015] (5)将重组整合质粒pDL-PSQ转入B.subtilis pB2菌株中，通过同源臂位点交换， 将目的基因 P43-sfp-degQ整合到了基因组中，抗性筛选，获得阳性转化子，即为联产 Surf act in和Plipastat in的枯草芽抱杆菌工程菌，命名为B. subtil is pB2_L。
[0016] 5 .上述4提供的构建方法，其中，步骤（1)通过PCR扩增，在启动子P43基因中引入 EcoRI酶切位点，在sfp基因中引入BamM酶切位点，在degQ基因中引入BamHI和Sac頂每切位 点。
[00Π ] 6 ·上述4提供的构建方法，其中，步骤(1)所述引物对序列如下：
[0018] P43-FdnSEQIDN0.2K*;P43UnSEQIDN0.3m* ;
[0019] sfp-F:如SEQ ID NO.4所示；sfp-R:如SEQ ID NO.5所示；
[0020] degQ-FjnSEQIDN0.6m*;degQUnSEQIDN0.7m*。
[0021] 7.上述4提供的构建方法，其中，步骤(2)所述引物对序列如下：
[0022] PS-FdnSEQIDN0.8K*;PSUnSEQIDN0.9m*。
[0023] 8.根据上述4-7任一项提供的方法获得的联产Surfactin和Plipastatin的枯草芽 孢杆菌。
[0024] 9.上述8提供的枯草芽孢杆工程菌在革兰氏阳性细菌、丝状真菌抑制方面的应用。
[0025] 10.上述8提供的枯草芽孢杆工程菌在桃软腐病菌防治方面的应用。
[0026] 有益效果：
[0027] 本发明利用同源重组的方法，将一株不产抗菌物质Surfactin和Plipastat in的 B . subtilis pB2，在amyE位点导入了 一段融合基因 P43-sfp-degQ，获得了一株联产 Surfactin和Plipastat in的重组菌株B. subtil is pB2_L，该菌株对革兰氏阳性细菌、丝状 真菌具有一定的抑菌活性。
[0028]本发明采用的枯草芽孢杆菌是被我国农业部列为可在农业领域及其食品领域得 到广泛的应用安全菌株。产生的抗菌脂肽Surfactin和Plipastat in属于微生物天然抗菌 肽，对人类健康和食品安全性高，不会导致对环境的污染，可用于生物防治，食品加工和农 产品贮藏保鲜等。
[0029] 本发明建立了一套枯草芽孢杆菌化学转化和同源重组方法，对后续研究 Plipastatin合成酶系结构与功能基础理论具有重要意义。
【附图说明】
[0030] 图1功能基因 sfp和degQ核苷酸序列在NCBI数据库上比对分析
[0031] A图：功能基因 sfp与Bacillus.amyloliquefaciens subsp.plantarum UCMB5063 进行比对；
[0032] B图：功能基因 degQ与Bacillus.amyloliquefaciens subsp.plantarum UCMB5063 进行比对。
[0033]图2重组整合质粒pDL-PSQ与同源重组原理示意图 [0034] 图A:重组整合质粒pDL-PSQ示意图；
[0035] 图B:同源重组原理示意图。
[0036] 图3重组菌株目的基因 P43-sfp-degQ的扩增（注:Μ为DNA Marker;泳道1、2、3、4为 挑取的转化子DNA为模板，目的基因 P43-sfp-degQ的扩增）
[0037] 图4重组菌B.subtilis pB2_L产Surfactin和Plipastatin的ESI-MS图
[0038] A图：重组菌B·subtilispB2-L产Surfactin的ESI-MS图；
[0039] B图：重组菌B.subtilis pB2-L产Plipastatin的ESI-MS图。
[0040] 图5重组菌B.subtilis pB2-L产抗菌物质的溶血活性图和抑菌图
[0041 ] 图A:重组菌B.subtilis pB2_L产抗菌物质的溶血活性图
[0042] 图B:重组菌B.subtilis pB2_L产抗菌物质的抑菌图
【具体实施方式】
[0043]下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件，实施例中涉及的菌株均属于 现有技术，本领域的技术人员可以很容易地从公开是商业渠道获得。
[0044] 实施例1 [0045] 1.材料与方法
[0046] 1.1菌株和质粒
[0047] 枯草芽抱杆菌B. subtilis fmbJ(CGMCC N0.0943)、大肠杆菌Escherichia coli DH5a克隆宿主(购买自诺唯赞生物公司）、B. subtilis pB2以及枯草芽孢杆菌整合质粒pDL (Yuan and Wong,Regulation of groE expression in Bacillus subtilis：the involvement of the sigma A-like promoter and the roles of the inverted repeat sequence(CIRCE)，1995)均由南京农业大学酶工程实验室保存;Escherichia coli T-A克 隆载体pMD 19-T(购自TaKaRa公司）。指示菌株：桃软腐病菌Rhizopus stolonifer(AS 3.2336)，藤黄微球菌(CMCC 28001)，购于中科院微生物研究所菌种保藏中心。
[0048] 1 · 2培养基
[0049] LB培养基:蛋白胨 10.0g，酵母膏5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水 1000mL，pH 7.0~7.2;
[0050] 10XT baase: (NH4)2S〇4 20.0g，K2HP〇4 140.0g，KH2P〇4 60.0g，Na3C6H5〇7 · 2H20 10.0g，MgS〇4 · 7H20 2.0g，加水至lOOOmL;
[0051] 种子培养基：牛肉浸膏5.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水 1000mL，pH7.0~7.2;
[0052] 改良Landy培养基：葡萄糖40.0g · L-SL-谷氨酸2.0g · L-^(NHASOa 2.3g · L-1， K2HPO4 l.Og · L_1,MgS〇4 0.5g*L_1,KCl 0.5g · L_1 ,CuS04 1.6mg · L_1 ,Fe2(S04)3 1.2mg* L-^MnSfM 0.4mg.L-SlOOmM 3-N-玛啡啉丙磺酸(M0PS)，pH 7.0~7.2;
[0053] PDA培养基：马铃薯洗净去皮，切成lcm3小丁，称取200-300g，煮沸半小时，八层纱 布过滤取汁，加入20.0 g葡萄糖，蒸馏水定容至lOOOmL，再加入15-20g琼脂，115°C，30min高 压蒸汽灭菌，pH自然；
[0054] GM 1:10 XT baase 100mL，100g · L-1 葡萄糖50mL，50g · L-1 酵母膏20mL，10g · L-1 酸水解酪蛋白20mL，2.5g · L-1色氨酸20mL，加水至lOOOmL;
[0055] GM II: 10 X T baase 100mL，lOOg · L-1 葡萄糖50mL，50g · L-1 酵母膏0.4mL，lOg · L -1 酸水解酪蛋白· 5mL，0.5mol · L-WgCh 5mL，0.05mol · L-taCh 10mL，加水至lOOOmL;
[0056] GM I、GM