专利名称：一种生物固氮检测的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物固氮检测的方法，尤其是一种应用于固氮科学的研究，固氮菌的鉴别、固氮菌剂及微生物固氮肥料质量测定的方法。
固氮科学的研究是世界上的热门课题，从文献报导可知，这项研究依然被美国、日本等发达国家列为21世纪科研课题的重大主攻方向。在这门科学的研究中需要对固氮微生物、固氮植物进行鉴别，对固氮微生物的DNA重组性能的表达，对固氮菌剂、微生物肥料固氮活性、固氮量的判定分析都需要一种灵敏度高，准确可靠的方法。最早应用的方法为“凯氏定氮法”，这种方法有其准确性及可靠性高的特点，但灵敏度太低，有些固氮量微弱的测定无法应用。随之发展起来的是“15N示踪法”，这种方法相对“凯氏定氮法”提高了1，000倍，但这种方法需要含15N的盐类或其他化学品，价格昂贵，而且需要使用大型仪器“同位素质谱仪”，很难广为应用。近年来又发明了一种“乙炔还原法”，这种方法又相对“15N示踪法”灵敏度提高了1，000倍，也就是相对“凯氏定氮法”提高了106倍。因此科学家们分离出了近70多个属400多种的固氮微生物。这种方法虽有灵敏度高的特性，但它是一种依据固氮酶能还原三键化合物的理论基础来设立的。也就是说固氮酶能还原N≡N也能还原CH≡CH。由于这种方法不是直接测定氮而是测定的乙炔生成乙烯的量，就相当于还原一个N2生成2NH3。在实际应用上科学家们众说不一，所以仅能用来定性分析无法定量。
本发明的目的是提供一种即可确定固氮活性，又可准确测定出固氮量，成本低、简便易行的生物固氮检测的方法。
本发明具体的解决方案为一种生物固氮检测的方法，其特征在于将固氮被测试样品置入适量容积的培养瓶内，并加入适量的十碳以下水化合物和无菌水，用胶塞封闭，然后在适当温度条件下，培养一定时间，取出培养瓶内混合气用气相色谱仪测定。
例1固氮被测试样品为田力宝微生物化肥，十碳以下的碳水化合物为蔗糖。
例2固氮被测试样品为根际活性联合固氮菌，十碳以下的碳水化合物为葡萄糖。
例3固氮被测试样品为根瘤固氮菌及其用它们制成的菌剂和肥料，十碳以下的碳水化合物为葡萄糖。
例4固氮被测试样品为自生固氮菌及其用它们所制成的菌剂和肥料，十碳以下的碳水化合物为葡萄糖。
本发明的优点和积极效果如下1.灵敏度高，准确可靠，可用于多种固氮量级的测定。
2.简便易行，成本低，直观性强。
3.应用于固氮活性及固氮量的检测，除能准确定性外，还可准确测定出固氮量。
下面给出本发明具体的实施例。
取将要测试的适量样品(固氮微生物纯种，固氮微生物悬液、固氮菌剂或固氮微生物制品)，置于适当容积的培养瓶内，加入相应的培养基适量，用橡皮胶塞或其他可封闭的物质进行封闭，然后抽真空后，注入含O220%、N280%的标准混合气体(或不抽真空直接用天然空气)，使瓶内为1个大气压力。将备制好的培养瓶置于相应的温度(一般10～40℃)条件下培养，根据不同的固氮微生物或制品的要求培养一定时间后，用标准取样器取样检测N2百分量的变化，从而求出N2的减少量，根据N2的减少量，推算出每克固氮微生物及其制品的固氮量。
实施例一1.取适量田力宝微生物肥料，用研钵研成大于60目的粉剂。
2.将1中的粉剂取相同量置于容量为100毫升的培养瓶中，每瓶0.5～1.0克，然后加入0.25～1.0克葡萄糖或蔗糖，并注入无菌水2～10毫升，然后用反口胶塞塞好。
3.将2中的培养瓶抽成真空，然后注入含O220%、N280%的混合气体，使其为1个大气压力，大约要注入90～98毫升左右的上述混合气体。立即用标准取样器取出瓶内混合气用气相色谱仪测定，计算出瓶内含氮(N2)为V1摩尔，置于28℃±1℃条件下经2～10天培养后，再从瓶内取混合气进行测定，计算出瓶内含N2为V2摩尔。
4.用同样方法作空白对照，测出培养前的瓶内N2的摩尔量为M1，培养1～6天后瓶内N2的摩尔量为M2，(一般M1与M2之间变化十分微弱，在1～2%范围内)。
5.计算出N2的减少量，并且扣除空白的自然减少量后的实际固定量为Vm。
Vm＝[V1-V2-(m1-m2)]/0.5～1.0通过计算一般每克田力宝可固定100毫克以上的氮，若换算成每消耗1克糖可固氮量达560毫克以上。
实施例二1.取适量根际活性联合固氮菌0.1～1克，置于灭菌体积为5～20毫升的培养瓶中，加入葡萄糖0.1～1克，然后加入无菌水2～10毫升，然后用胶塞塞好。
2.然后抽真空后注入含O220%含N280%的混合气体或者不抽真空用自然空气，使瓶内压力为1个大气压。立即用取样器取瓶内混合气10～100微升注入气相色谱检出瓶N2的体积为V1摩尔。置于15～40℃条件下培养6～24小时后，再取10～100微升瓶内混合气进行测定，瓶内含N2为V2摩尔。
3.用同样方法作空白对照，测出培养前瓶内N2的摩尔量为M1，培养6～24小时后瓶内N2的摩尔量为M2。
4.计算出N2的减少量，并且扣除了空白的自然减少量后的实际固定量为Vm。
Vm＝[V1-V2-(m1-m2)]/0.1～1克上述方法也适用于根瘤固氮菌、自生固氮菌及用它们所制成的菌剂和肥料。
权利要求
1.一种生物固氮检测的方法，其特征在于将固氮被测试样品置入适量容积的培养瓶内，并加入适量的十碳以下碳水化合物和无菌水，用胶塞封闭，然后在适当温度条件下，培养一定时间，取出培养瓶内混合气用气相色谱仪测定。
2.根据权利要求1所述的一种生物固氮检测方法，其特征在于固氮被测试样品为田力宝微生物肥料，十碳以下的碳水化合物为蔗糖。
3.根据权利要求1所述的一种生物固氮检测方法，其特征在于固氮被测试样品为根际活性联合固氮菌，十碳以下的碳水化合物为葡萄糖。
4.根据权利要求1所述的一种生物固氮检测方法，其特征在于固氮被测试样品为根瘤固氮菌及其用它们制成的菌剂和肥料，十碳以下的碳水化合物为葡萄糖。
5.根据权利要求1所述的一种生物固氮检测的方法，其特征在于固氮被测试样品为自生固氮菌及其用它们所制成的菌剂和肥料，十碳以下的碳水化合物为葡萄糖。
全文摘要
本发明涉及一种生物固氮检测的方法，其特征在于将固氮被测试样品置入适量容积的培养瓶内，并加入适量的十碳以下碳水化合物和无菌水，用胶塞封闭，然后在适当温度条件下，培养一定时间，取出培养瓶内混合气用气相色谱仪测定。本发明具有准确可靠，简便易行，成本低等优点。广泛应用于固氮活性及固氮量的检测，除能准确定性外，还可准确测定出固氮量。
文档编号G01N30/04GK1109595SQ94103368
公开日1995年10月4日 申请日期1994年3月31日 优先权日1994年3月31日
发明者张令玉 申请人:张令玉