专利名称：：利用菌糠制备饲用酶的方法
技术领域：
：本发明涉及一种用菌糠制备饲用酶的方法。
背景技术：
：菌糠是指以一定的培养基质栽培食用菌后的废弃培养基。其主要培养基质有棉籽壳、锯木屑、稻草、玉米芯、甘蔗渣及多种农作物秸秆、工业废料(酒糟、醋糟、造纸厂废液等)。上述原料因其有效营养物质尤其是粗蛋白质含量极低导致其可饲性能差。但是以这些原料为培养基栽培食用菌后，通过食用菌菌体的生物固氮作用、酶解作用等一系列生物转化过程，粗蛋白质、粗脂肪含量均比不经过食用菌发酵前提高二倍以上，纤维素、半纤维素、木质素和抗营养因子如棉酚等均已被不同程度的降解，同时还产生了多种糖类、有机酸类和生物活性物质，可作为产酶菌的培养基。饲用酶是一种以酶为主要因子的饲料添加剂，主要包括非淀粉多糖酶、淀粉酶、蛋白酶、植酸酶、脂肪酶等。其生产主要是利用微生物的发酵。工业上通常采用微生物发酵法来大规模生产饲用酶制剂。生产工艺包括菌种扩大培养一接种于灭菌原料_发酵-提取、浓缩、载体吸附_干燥_粉碎_制成粗(浓)酶制剂_分装。发酵主要包括液体发酵和固体发酵。固体发酵是以麸皮、米糠等为原料，再加入适量的无机盐和水分作为培养基进行的一种培养。固体发酵设备简单，便于推广，并特别适于霉菌类的培养，但也有一些缺点，如物料利用不完全、劳动量大、易染菌，而且不适于胞内酶的生产。目前国内多数是利用这类发酵方法进行酶制剂的生产。菌糠可以用来生产饲用酶，广泛推广运用的品种有纤维素酶、木聚糖酶。张玉明，陆恒在.《饲料研究》，1999，(5):2223公开了从菌糠中直接提取饲用酶的方法。用菌糠生产饲用酶的方法是将菌糠中的饲用酶浸提、浓缩、干燥。
发明内容本发明目的是提供一种新的利用菌糠发酵制备饲用酶的方法，以提高菌糠饲用酶的活性和应用价值。本发明的技术方案是以菌糠为培养基，选择绿色木霉对其进行再次发酵，发酵后将菌糠浸提，分离粗酶液，经浓缩、干燥制备干酶粉制剂得到成品。通常，用一种微生物发酵，不但发酵的菌种，发酵条件对发酵的效果有影响，而且，发酵的培养基也是至关重要的。即使是用同一种发酵菌和相同的发酵条件，在不同的培养基中，不一定有必然相同的结果。本申请发明人通过研究发现，对废弃的菌糠培养基进行进一步的二次发酵，可以获得比用原菌糠制备饲用酶的方法更高的酶活。本发明选择现有技术中制备饲用酶的绿色木霉作为发酵的菌种。本发明还发现，不同的菌糠本身所含酶活力大小和营养物质多少不同，对本发明第二次发酵提供的饲用酶的产率有影响。本发明提出优选符合下列条件的菌糠作为原料。菌糠的CMC酶活应不小于3(IU/g)，木聚糖酶活不小于2(IU/g)，蛋白质含量应该不小于4%的菌糠。根据本发明的实施例，本发明提供的制备方法中，发酵的条件是新鲜菌糠去除食用菌后打碎，补充加入氮源和碳源，按照ν/W接种3%-6%绿色木霉种子液，在湿度为50%-70%，温度为26°C-35°C条件下，发酵3_4天。现有技术中已经公开了从菌糠中提取饲用酶的方法。根据本发明的实施例，优选在4°C用蒸馏水浸提12h，所得的粗酶液的相对酶活最高，也就是说酶的提取率最高。根据本发明的实施例，所说的浓缩，可以用乙醇沉淀法、硫酸铵沉淀法或者用中空纤维膜超滤法。优选用中空纤维膜超滤法浓缩饲用酶，大大提高了饲用酶的提取率。根据本发明提供的利用菌糠制备饲用酶的方法，较现有的直接从菌糠中分离提取的方法有显著的不同，大大提高了饲用菌的提取率。具体实施例方式实施例1各种菌糠提取粗酶液后，测定样品中酶活力的大小。1材料与方法1.1实验材料1.1.1菌糠香菇菌糠、凤尾菇菌糠、姬菇菌糠、袖珍菇菌糠、金针菇菌糠，从春华食用菌有限公司获得。1.2实验方法1.2.1菌糠中酶活力的测定分别测定香菇菌糠、凤尾菇菌糠、姬菇菌糠、袖珍菇菌糠、金针菇菌糠中的纤维素酶、木聚糖酶、α-半乳糖苷酶、果胶酶、蛋白酶、植酸酶的活力。1.2.2酶活力的测定纤维素酶活力测定(DNS法)，木聚糖酶活力的测定(DNS法)，α-半乳糖苷酶活力的测定(DNS法)，果胶酶活力的测定(DNS法)。2结果2.1不同菌糠中酶活力的测定结果见表1。表1不同菌糠中酶活力的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>不同菌糠中酶活力的比较见表1，纤维素酶活力以香菇菌糠中的为最高，其次是金针菇菌糠中的，其它菌糠中的都比较低；木聚糖酶活力以金针菇菌糠中的为最高，其次是香菇菌糠中的，其它菌糠中的都比较低；α-半乳糖苷酶和果胶酶的活力总体上都比较低。经比较和分析，香菇菌糠和金针菇菌糠的酶活较高；从纤维素酶活力来看，香菇菌糠的酶活最高，因此选择香菇菌糠进行后面的试验。实施例2添加微生物菌种绿色木霉Trichodermaviride(CGMCC3.3711)发酵对饲用酶活力的影响1.材料与方法1.1实验材料1.1.1菌糠从春华食用菌有限公司获得。1.1.2添加微生物菌绿色木霉对所选菌糠进行发酵。新鲜菌糠去除食用菌后打碎，加入灭菌后的0.1%-0.2%的硫酸铵和-2%的麦麸作为补充氮源和碳源，按照V/W接种3%-6%的绿色木霉种子液，装入浅盘(3-5厘米高)，在湿度为50%-70%，温度为260C-35°C条件下，发酵3-4天。1.2实验方法1.2.1菌糠接种微生物菌发酵后，提取粗酶液测定木聚糖酶活和纤维素酶活(CMC酶活)1.2.2蛋白测定凯氏定氮法测定粗蛋白1.2.3纤维素酶活和木聚糖酶活测定采用DNS法测定2、结果2.1添加微生物菌株对香菇菌糠(菌糠1)、杏鲍菇菌糠(菌糠2)进行发酵，测定其蛋白含量、CMC酶活和木聚糖酶活。发酵后菌糠中蛋白含量、酶活均有所提高，其中菌糠1的蛋白含量提高了66.90%、CMC酶活提高了88.1%，木聚糖酶活提高了62.84%。菌糠2的蛋白含量提高了51.35%、CMC酶活提高了57.83%，木聚糖酶活提高了56.12%。见表2表2绿色木霉对菌糠发酵前后测定CMC酶活和木聚糖酶活③将透析袋放入其中，煮沸lOmin。④用蒸馏水彻底洗涤。⑤在蒸馏水中煮IOmin。⑥冷却后4°C存放，在贮存过程中透析袋应完全浸于水中。⑦使用前用蒸馏水清洗透析袋内外，操作时用镊子或戴手套。⑧使用时，一端用细绳扎紧，由另一端灌水，用手指稍加压，检查不漏方可装入待透析液，通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。1.2.2.2.3酶液的透析向IL粗酶液中加入固体硫酸铵至80%饱和度，4°C放置过夜，4000r/min离心20min，收集沉淀，用少量蒸馏水溶解，装入透析袋中，置于4°C冰箱中，用pH4.8,0.05mol/L柠檬酸缓冲液充分透析，每隔3h更换一次透析液，透析12h，得到除盐的酶液，分别测定酶液中的CMC酶活和木聚糖酶酶活。1.2.3中空纤维膜过滤法取粗酶液5000ml，选用中空纤维超滤小型试验装置，在0.IMPa下，首先经截留分子量分别为100000的膜过滤，收集流出液，再经过截留分子量分别为3000的膜过滤浓缩至100ml，取样测定CMC酶活和木聚糖酶酶活。1.2.4酶液的干燥将酶液加入载体，放入真空干燥箱中，40°C恒温干燥，干燥物磨粉后即得到干酶制齐U，分别测定其中的CMC酶活和木聚糖酶酶活。2结果与分析2.1粗酶提取方法的筛选结果酶是生物活性物质，其提取受多种因素如温度、时间、溶剂种类等的影响。为了获得最大限度的提取酶活，尽可能减少各种因素引起的酶活损失，故应选择最合适的条件。把最高酶活定为100%，测定结果见表3。结果表明，在室温(10°C)下用蒸馏水浸提12h，所得的粗酶液的相对酶活最高，也就是说酶的提取率最高，因此该提取方法为最佳提取方法。表3提取条件对纤维素酶提取率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.2三种方法浓缩粗酶液的比较表4浓缩方法对纤维素酶提取率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>三种方法浓缩粗酶液的结果见表4，从表4可以看出，粗酶液经硫酸铵沉淀后，上清液和沉淀物的CMC酶活均明显高于乙醇沉淀法对应的酶活，说明硫酸铵沉淀法优于乙醇沉淀法。中空纤维膜超滤法所得上清液的酶活最低，而沉淀的酶活最高，表明此法最优。可能由于乙醇对酶的活性有影响而影响酶活力大小，硫酸铵沉淀后必须将沉淀透析去盐，工艺复杂。膜过滤法方法简单、效果好、一步到位。2.3对沉淀物透析的结果粗酶液经硫酸铵沉淀，离心，收集的沉淀物中含有大量的硫酸铵，因此必须将硫酸铵除去。按照1.2.2.2的方法，得到除盐的酶液，其中的CMC酶活和木聚糖酶酶活见表5。结果表明，纤维素酶酶活达186.35IU/g，木聚糖酶酶活达317.42IU/g。表5透析后酶液中酶活的测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.4酶液的干燥按照1.2.4的方法，制得了干酶制剂，其中的CMC酶活和木聚糖酶酶活见表6。结果表明，干酶制剂中纤维素酶总酶活达8021IU，木聚糖酶总酶活达14483IU0表6干酶制剂中酶活的测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求利用菌糠制备饲用酶的方法，其特征在于以菌糠为培养基，选择绿色木霉对其进行发酵，发酵后将菌糠浸提、分离粗酶液，经浓缩、干燥制备干酶粉制剂得到成品。2.根据权利要求1所述的利用菌糠制备饲用酶的方法，其特征在于所说的菌糠为CMC酶活应不小于3(IU/g)、木聚糖酶活不小于2(IU/g)、蛋白质含量应该不小于4%的菌糠。3.根据权利要求2所述的利用菌糠制备饲用酶的方法，其特征在于所说的菌糠是香菇菌糠。4.根据权利要求1至3之一所述的利用菌糠制备饲用酶的方法，其特征在于发酵的条件是新鲜菌糠去除食用菌后打碎，补充加入氮源和碳源，按照V/W接种3%-6%的绿色木霉种子液，在湿度为50%-70%，温度为26°C_35°C条件下，发酵3_4天。5.根据权利要求1至3之一所述的利用菌糠制备饲用酶的方法，其特征在于将菌糠浸提粗酶的条件是在2-6°C用蒸馏水浸提12h。6.根据权利要求1至3之一所述的利用菌糠制备饲用酶的方法，其特征在于用中空纤维膜超滤法浓缩粗酶液。全文摘要本发明涉及一种用菌糠制备饲用酶的方法。本发明的技术方案是以菌糠为培养基，选择绿色木霉对其进行再次发酵，发酵后将菌糠浸提，分离粗酶液，经浓缩、干燥制备干酶粉制剂得到成品。根据本发明提供的利用菌糠制备饲用酶的方法，较现有的直接从菌糠中分离提取的方法有显著的不同，大大提高了饲用菌的提取率。文档编号C12R1/885GK101812431SQ200910042699公开日2010年8月25日申请日期2009年2月23日优先权日2009年2月23日发明者刘莹莹,周望平,王红兵,肖兵南,邱美珍,邹德松申请人:湖南省畜牧兽医研究所