一种高产饲用复合酶的黑曲霉及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产饲用复合酶的黑曲霉及其应用，属于微生物发酵【技术领域】。黑曲霉菌株具体为黑曲霉DM-18，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC?M2013541。经培养基优化，发酵72-96小时后获得的粗酶液中含有多种酶，其中，蛋白酶活力为6500U/ml、甘露聚糖酶活力为1500U/ml、α-半乳糖酶活力为1200U/ml、果胶酶活力为1000U/ml。且该复合酶中的各种酶活最适pH值在2-7之间，适合动物胃肠道的消化和吸收环境，这种饲用复合酶可以广泛应用在畜禽饲料中，能够降低抗营养因子，提高消化率，具有良好的经济效益，同时也有利于保护生态环境，推动畜牧业的健康发展。
【专利说明】一种高产饲用复合酶的黑曲霉及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵【技术领域】，具体是一种高产饲用复合酶的黑曲霉及其应用。
【背景技术】 [0002]国内外的大量研究表明，在饲料中添加酶制剂可促进动物对营养物质的消化吸收，提高饲料利用率，增强动物防病抗病能力，其主要功能有以下几个方面:(1)补充动物内源酶的不足，提高饲料的消化率和利用率。酶制剂促进了消化道对碳水化合物和其它营养物质的消化和吸收，提高了饲料的转化效率，有利于动物的生长。(2)消除饲料中的抗营养因子，降低动物消化道食糜的黏度，改善消化机能，有利于营养物质吸收。(3)改善肠道菌群分布，提高动物健康状况。酶制剂降解非淀粉多糖后产生的甘露寡聚糖能促进双歧杆菌、酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌等有益菌群增殖，进而限制沙门氏菌、弯曲杆菌和梭酸芽孢杆菌等致病细菌生长。(4)参与动物内分泌调节，提高畜禽体内激素代谢水平，通过影响机体的激素代谢促进家禽生长。(5)减轻畜牧生产对环境的污染。几乎在所有的植物饲料中，绝大部分磷酸盐以植酸形式存在(肌醇六磷酸)。由于单胃动物消化道中植酸酶的活力很低，大部分植酸磷被排出体外，这样不仅浪费磷源，且造成环境污染。添加植酸酶，可替代饲料配方中50%~70%的磷酸氢钙，向环境排泄的磷相应减少30%以上，在环境保护中发挥巨大作用。(6)促进细胞包围的淀粉、蛋白质、脂肪的释放，通过水解细胞壁，使营养物质被充分吸收。
[0003]在禽畜产品养殖中应用饲用酶制剂既能提高饲料的消化率和利用率，提高畜禽及鱼类的生产性能，又能减少畜禽排泄物中的氮、磷的排泄量，保护水体和土壤免受污染，因而饲用酶制剂作为一类高效、无毒副作用和环保型的“绿色”饲料添加剂在21世纪将有着十分广阔的应用前景。
[0004]饲用酶制剂的商业化应用在国外也只有不到二十年的历史。英国在1988年以前，酶制剂在鸡饲料的添加率几乎等于零，而到了 1993年，鸡饲料酶制剂的添加率已达到95%以上。饲用酶制剂在我国的应用始于1992年，2005年我国饲用酶制剂的年销售量已达到I万吨以上。饲用酶制剂作为一类高效、无毒、无副作用和环保型的“绿色”饲料添加剂在21世纪将有十分广阔的应用前景。我国配合饲料2009年产量达1.4亿吨，其中按50 %左右加酶0.1 %计，则用酶约7万吨。据国内市场预测分析，2010年饲用复合酶制剂的市场容量预计达到7.5万吨，而国内饲用酶制剂的产能不足2万吨，因此，饲用酶制剂在我国还有很大的市场空间和潜力。目前我国饲用酶制剂的市场已经初步形成，并逐步发展，各类酶制剂在国内有良好的发展势头和前景。
[0005]我国各地主要粮食作物差异较大，酶制剂对潜在饲料资源的利用和新饲料资源的开发有较大的作用。由此人们迫切需要发展酶制剂等环保节能型绿色饲料添加剂。我国政府也正积极通过禁止在饲料中使用抗生素、激素等方式来保障饲料和食品的安全，维护生态平衡。预计未来10年内，随着科技水平不断提高，生产成本的下降，饲用酶的产销量必然大幅度提高。饲用酶制剂在生产中的普遍应用虽然还面临着许多问题，但随着生物技术特别是基因工程技术和生产技术的提高，都将逐一解决。随着人们生活水平的提高及环境意识的增强，饲用酶制剂以其不产生残留、无抗药性、不污染环境等优势将会进一步被推广应用。
[0006]目前，饲用复合酶的生产主要有以下三种方法:1.完全复配法:既生产和购买各种单一酶制剂，按配方复配，再加分散剂、稀释剂等加工而成。主要缺点是成本高，使用时不易将酶活较高而剂量很少的酶制剂同大量饲料混合均匀，因而严重影响了使用的效果，这在无形中又增加了使用成本，使不少经营者望而却步，给推广和应用带来了障碍。2.多菌株混合发酵，自然互补酶系法:采用几个菌种混合发酵，互补产酶法获得与复配法较为接近的复合酶产品，之后只需稍加调整即为产品，但多菌种发酵的技术难度非常大，因为不同的菌种的各自生理特性，混合培养难免相互影响，要使它们在相同培养基上生长并合成不同的酶有一定困难。3.单菌种发酵，补加酶法:通过菌种筛选获得优良菌株，该菌株可以高产多种酶，且这些酶组成合理，能满足简单的饲料配方要求，用这样的菌株发酵后获得复合酶，再按不同的动物的不同年龄的生长需要加以补加和调整即可。
[0007]综上所述，采用单一菌种发酵生产饲用复合酶是最简单、饲用效果最好、成本最低的一种生产方法，中国专利CN101608175B公开了一种复合酶制剂及其制备方法和应用，以黑曲霉为出发菌株，经液体深层发酵制备的复合酶含有以下酶种及活性:液体酸性β_甘露聚糖酶，1300u/ml,液体a-半乳糖苷酶,300u/ml,适用于饲料和石油工业。中国专利CN101591619B公开了一种黑曲霉菌株及其应用，该菌株可以同时高产木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶等，可生产动物饲喂用复合酶，各种酶活最适PH值为4-6。
[0008]由此看来选育优良菌株和改善发酵方法是单一菌种发酵生产优质饲用复合酶的关键。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种高产饲用复合酶的黑曲霉菌株及其应用。
[0010]本发明的高产饲用复合`酶的黑曲霉菌株具体为黑曲霉(Aspergillus niger)DM-18，是从湖南省津市市洋由乡腐殖土、稻草混合土样分离得到的黑曲霉(Aspergillusniger) HYX0022经紫外诱变、紫外亚硝酸诱变、紫外线亚硝基胍复合诱变，然后对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到产饲用复合酶的黑曲霉DM-18。
[0011]上述菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:中国.武汉.武汉大学，邮编:430072)，保藏号为CCTCC NO:M2013541，分类命名为黑曲霉 DM_18Aspergillus niger DM-18。
[0012]本发明高产饲用复合酶的黑曲霉DM-18 (CCTCC NO:M2013541)具有以下微生物学特征:
[0013]1、形态学特征:
[0014]黑曲霉DM-18，生物学形态为包括分生孢子、孢梗、顶囊、产孢结构等几部分。分生孢子头球形至福射形，直径150-450 μ m,分生孢子梗发生于基质。孢梗莖1000-3000(长度)X 12-20 (直径)μ m，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近似球形，直径35-50 μ m,表面全面可育；产孢结构双层，梗基15-20(长度)X3-4.0(直径)μπι，孢梗6-8(长度)X 2-4 (直径)μ m，分生孢子球形或近球形，较小，直径3.5-5.0 μ m，褐色，壁粗糙。
[0015]2、培养学特征:
[0016]黑曲霉DM-18在麦芽汁琼脂培养基上生长迅速，28°C 4天直径65mm ;质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，有少量渗出液；菌落反面略带黄色。
[0017]3、生理生化特征:
[0018]黑曲霉DM-18可在马铃薯、玉米粉、可溶性淀粉，糖蜜等上生长，最适PH值4.6，最适生长温度28-34°C，最适产酶温度28-30°C。
[0019]黑曲霉DM-18的筛选技术路线为:原始菌株分离、筛选与鉴定一出发菌株一斜面培养一孢子悬液的制备一诱变处理一平板分离一初筛一复筛一再复筛一扩大实验(发酵性能测定)。
[0020]按诱变筛选方案，对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选，得到一株高产酶性能菌株黑曲霉DM-18，经培养基优化，发酵72-96小时后获得的粗酶液中含有多种酶，其中，蛋白酶活力为6500U/ml、甘露聚糖酶活力为1500U/ml、α -半乳糖酶活力为1200U/ml、果胶酶活力为1000U/ml。
[0021 ] 对上述发酵液粗酶液进行酶的热稳定性试验和pH稳定性试验，试验结果表明:在30-75°C，pH值2-7时各酶均有较高的酶活力，达到80%以上。
[0022]本发明所提供的高产饲用复合酶的黑曲霉DM-18的应用为黑曲霉DM-18在复合酶制备中的应用，特别是在制备饲用复合酶中的应用，所述复合酶中包括甘露聚糖酶、α -半乳糖酶、果胶酶和蛋白酶。
[0023]有益效果:`
[0024]1.本发明高产饲用复合酶的黑曲霉DM-18菌株可以同时高产甘露聚糖酶、α-半乳糖酶、果胶酶和蛋白酶，从而形成一种针对饲料原料的多酶复合体系，即可生产饲用复合酶，且该复合酶中的各种酶活最适PH值在2-7之间，适合动物胃肠道的消化和吸收环境，这种饲用复合酶可以广泛应用在畜禽饲料中，能够降低抗营养因子，提高消化率，具有良好的经济效益，同时也有利于保护生态环境，推动畜牧业的健康发展。
[0025]2.本发明高产饲用复合酶的黑曲霉DM-18菌株所产复合酶热稳定性和pH稳定性强,更加适合饲料工业加工工艺需求,加工后的饲料酶活损失低。
[0026]3.本发明采用液体发酵，产品质量更稳定，饲用复合酶杂质少，纯度高。
【具体实施方式】
[0027]下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0028]实施例1高产饲用复合酶的黑曲霉DM-18原始菌种的分离、纯化与鉴定
[0029](I)菌种分离:从湖南省津市市洋由乡采集IOg腐殖土、稻草混合土样加到含有IOOmL冷却无菌水带玻璃珠的小三角瓶中，摇床200r/min，震荡混匀30min，然后放在80°C水浴锅中，水浴lOmin，不断摇动三角瓶混匀土样，静置5min吸取上清液100 μ L，依次梯度稀释到10—1~10_9浓度，选取10_3，10Λ 10_5，10_6浓度分别吸取0.2ml稀释液涂布于PDA平板上，28°C恒温培养4-5d后菌落长满整个平板。
[0030](2)菌种纯化:根据初分菌落的形态特征，用接种针挑取各菌落的少量菌丝体，接种在事先准备好的PDA平板上，菌丝体生长7d后，根据长出的各菌落特点进行筛选和纯化，如此反复，直至菌落的生长状态和形态特征表现一致时视为单一菌种的菌落。菌种保存:纯化后的原始菌种保存在含液体石蜡的PDA斜面试管中。
[0031](3)菌种鉴定: [0032]a)对分离、纯化后的黑曲霉菌进行形态学鉴定:通过菌落及菌体形态的观察，可以观察到菌种在PDA培养基上生长2d可以形成单菌落。菌株生长良好，菌落表面突起，呈现圆形，边缘粗糙，菌落四周有明显的透明圈。菌落初白色，后变黑。分枝菌丝均具隔膜，菌丝每个细胞中常含多核。分生孢子梗单生、簇生或集结成孢梗束，其内合生或离生产孢细胞，产孢细胞产生形形色色的分生孢子。在无菌条件下，用接种针挑取适量菌种于澄清的摇瓶发酵培养基中，28°C液体发酵培养96h之后菌株在培养基中迅速而均匀的生长,达到最大的混浊度。菌体逐渐沉淀到培养基的底部，菌体呈灰黑色。此菌株生殖过程中缺少或未发现有性生殖阶段，是无性生殖，属于半知菌门。根据《真菌鉴定手册》方法，采用载玻片培养法培养真菌，光学显微镜下观察菌丝体大小、形态、表面特征及是否有横隔、孢子大小、形状、类型等对照确定该菌株为半知菌亚门(Deuteromyeotina),丝孢菌纲(Hyphomyeetes),丝抱目(Hyphomyeetales),从梗抱科(Moniliales),曲霉属(Aspergiuus),黑曲霉种(Aspergillus niger)。
[0033]b)对分离、纯化后的黑曲霉菌进行分子生物学鉴定:将保藏的菌株于PDA平板上进行活化培养5d~7d，用灭菌的接菌针将菌丝体刮入已灭菌的研钵中，用液氮研磨成细粉后，按照真菌基因组提取试剂盒(TaKaRa公司)步骤提取基因组DNA, -20°C保存备用。所提基因组DNA为模板进行PCR扩增，用真菌ITS序列通用引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和 ITS5 (5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)。PCR反应体系(50 μ L):4μ L dNTP, ITS51 μ L, ITS41 μ L，Taq 酶 I μ L, Buffer5 μ L,模板 5 μ L,ddH2033 μ L0 PCR 扩增条件为 95°C预变性 4min ;92°C 下变性 Imin ;52°C退火 Imin ;72°C 延伸2min ;循环30次；最后72°C下延伸5min，0.8%琼脂糖电泳PCR产物。采用TaKaRa琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化PCR产物，并将目的片段的序列测定由TaKaRa公司进行。将测得的ITS基因序列在NCBI上进行同源性检索，结果表明，所测序列与黑曲霉同源性为100%。
[0034]综合步骤a)形态特征和步骤b) ITS基因序列同源性两方面分析，该菌株鉴定为黑曲霉，菌株试验号为HYX0022。
[0035]所述PDA培养基的制备方法为:马铃薯(200g)洗净去皮，切成小块，煮沸30min，纱布过滤，定容至1000mL,加入1%葡萄糖(IOg)，1.5%琼脂(1.5g)，pH7.5,121.5°C,灭菌30mino
[0036]所述发酵培养基组成为:玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麸皮10_15g，硫酸铵l_3g，磷酸氢二钾l_2g，磷酸二氢钾l_2g，纯净水lOOOmL，pH值5-7，121°C灭菌20min ；
[0037]实施例2高产饲用复合酶的菌株的筛选方法，包括以下步骤
[0038]I)斜面培养:将实施例1分离、纯化后的黑曲霉原始菌种HYX0022划线接种斜面培养基，28-33 °C培养3~4d，直至菌丝体成熟、产孢。
[0039]所述斜面培养基组成如下:马铃薯(煮汁)200g,葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL, pH 值 5.8，121°C灭菌 20min ；
[0040]2)孢子悬液制备:待黑曲霉产孢时，向试管斜面加入5mL无菌水，把孢子刮下，倒入已灭菌的三角瓶并加入孢子质量0.5-2%的吐温-80，将三角瓶放入摇床振荡1.5h，使孢子活化；然后在3500r/min离心15min，用PH7.2磷酸缓冲洗涤一次，再用缓冲液5mL洗转入小三角瓶内，加入5-10粒直径3-5mm的无菌玻璃珠，振荡lOmin，使孢子分散；将分散的孢子液用四层灭菌的擦镜纸过滤，制成单孢子悬液；经镜检。若发现其中存在孢子囊或菌丝，则加入悬液质量0.1-3%的蜗牛酶和几丁质酶的混合物，充分振荡，使孢子囊溶解，再用四层灭菌的擦镜纸过滤。再镜检，直至未发现孢子囊或菌丝，制成原浓度单孢子悬液；
[0041]所述蜗牛酶与几丁质酶的质量比为1:1-2;
[0042]3)复合诱变
[0043]紫外诱变:将紫外灯打开预热20min，调整孢子悬液IO6~IO7个/ml，取5ml置于无菌的培养皿中。再将上述培养皿先后置于磁力搅拌器上，打开皿盖，在距离30cm、功率为20w的紫外灯下照射lOmin，稀释涂布平板培养基；
[0044]60Co Y射线辐射诱变:选出经紫外线诱变后酶活大幅提高菌株，涂布培养后，封住皿口，照射剂量30千拉德；
[0045]紫外亚硝酸诱变:吸取经紫外线照射处理的菌悬液1ml，加入pH4.5醋酸缓冲液2ml及0.lmol/L亚硝酸钠溶液1ml。紫外照射剂量:120S，亚硝酶处理时间:30S、60S、90S、120S。稀释涂布平板培养基。
[0046]紫外线亚硝基胍复合诱变:吸取经紫外线照射处理的菌悬液1ml，加入亚硝基胍溶液Iml继续处理。紫外照射剂量:120S，亚硝基胍处理时间:30S、60S、90S、120S。稀释涂
布平板培养基。
[0047]所述平板培养基组成如下:马铃薯(煮汁)200g,葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL, pH 值 5.8，121°C灭菌 20min ；
[0048]4)平板分离、初筛
[0049]将复合诱变后涂布均匀的平板置30°C培养72-96h，在长出菌落的平板上初筛出水解圈与菌落直径比值较大者挑至斜面保存，纯化后获得三株菌HYX0022-1，HYX0022-2, HYX0022-3 ；
[0050]5)复筛
[0051]将获得的三株菌HYX0022-1，HYX0022-2, HYX0022-3斜面菌种分别接种于斜面培养基，28-33°C培养72-96h进行菌种活化，如此活化2_4次；将活化后的斜面菌种以无菌水洗下孢子接种于含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中进行摇瓶发酵，接种量10% (V/V)，30°C、100r/min培养72_96h，筛选出发酵旺盛的种子液；
[0052]所述种子培养基组成为:马铃薯(煮汁)200g，葡萄糖20g，蒸馏水lOOOmL，pH值5.5，121°C 灭菌 20min ；
[0053]6)再复筛
[0054]将挑选出的发酵旺盛的HYX0022-1，HYX0022-2, HYX0022-3初筛种子液分别以10% (V/V)接种量接种于含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中进行摇瓶发酵，30°C、lOOr/min培养72_96h，筛选出发酵旺盛的种子液；
[0055]7)扩大试验(发酵性能测定)
[0056]①一级种子培养:将挑选出的发酵旺盛的HYX0022-1，HYX0022-2, HYX0022-3复筛种子液分别以8% (V/V)接种量接种于含有IOOmL种子培养基的500mL三角瓶中进行摇瓶发酵，30°C、100r/min培养72_96h，筛选出发酵旺盛的种子液；
[0057]②二级种子培养:将一级种子以8%(V/V)接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，种子培养基装量1000毫升，28-30°C、80-120rpm摇床培养72_96h ；
[0058]③种子罐培养:将二级种子以8%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，控制pH值为5-7，培养温度28-30°C，搅拌速度200-400rpm，通风量(V/V)1:0.8-1.2，培养时间 36-48h，溶解氧 10-20% ；
[0059]所述发酵培养基组成为:玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麸皮10_15g，硫酸铵l_3g，磷酸氢二钾l_2g，磷酸二氢钾l_2g，纯净水lOOOmL，pH值5-7，121°C灭菌20min ；
[0060]将HYX0022-1，HYX0022-2, HYX0022-3种子罐发酵液离心，取发酵上清液(粗酶液)进行酶活力检测，经测定，粗酶液中含有蛋白酶、甘露聚糖酶、α -半乳糖酶和果胶酶多种酶活力，将产上述酶活力最高、产酶能力最稳定的菌株ΗΥΧ0022-1确定为最稳定的高产菌株，其中，蛋白酶活力6300U/ml、 甘露聚糖酶活力1350U/ml、α -半乳糖酶活力1100U/ml、果胶酶活力900U/ml。
[0061]将高产菌株HYX0022-1命名为黑曲霉(Aspergillus niger) DM-18，该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院，邮编:430072)，保藏号为CCTCC NO:M2013541。
[0062]蛋白酶酶活力单位定义:在4(TC、pH5.5.条件下，Imin水解酪蛋白产生I μ mol酪氨酸的酶量为I个酶活力单位，以U/ml表示。
[0063]甘露聚糖酶活力单位定义:在40°C、pH5.5条件下，Imin从浓度为5mg/ml的刺槐豆胶溶液中水解释放相当于I μ mol甘露糖的还原糖所需要的酶量为I个酶活力单位，以U/ml表不。
[0064]α -半乳糖酶活力单位定义:在400C、ρΗ5.5条件下，Imin分解对硝基酚_ a -D-吡喃半乳糖生成I μ mol对硝基酚所需的酶量为I个α -半乳糖苷酶酶活单位，以U/ml表示。
[0065]果胶酶活力单位定义:在40°C、pH5.5条件下，Imin从浓度为10mg/ml的果胶溶液中水解释放相当于I μ mol的还原糖所需要的酶量为I个酶活力单位，以u/ml表示。
[0066]实施例3高产饲用复合酶筛选出发菌株的培养基优化
[0067](一 )菌株
[0068]出发菌株选择的是筛选结果最佳的DM-18菌株，发酵96小时后经检测，发酵液粗酶液含有多种酶，其中，蛋白酶活力6300U/ml、甘露聚糖酶活力1350U/ml、α -半乳糖酶活力1100U/ml、果胶酶活力900U/ml。
[0069]( 二)培养基优化
[0070]对筛选菌株过程中的斜面培养基、平板培养基、种子培养基和发酵培养基进行培养基优化，以优化前相同的发酵条件发酵96小时，经检测，发酵液粗酶液含有多种酶，其中，蛋白酶活力600U/ml、甘露聚糖酶活力1500U/ml、α -半乳糖酶活力1200U/ml、果胶酶
[0071]所述斜面优化培养基组成如下:干酪素4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g,硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g,琼脂20g,中草药粉剂5-20g,蒸懼水lOOOmL, pH值5.8,121°C 灭菌 20min ；
[0072]所述平板优化培养基组成如下:干酪素4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾
0.8g,硫酸亚铁0.02g,葡萄糖20g,琼脂20g,中草药粉剂10-25g,蒸懼水lOOOmL, pH值5.8,121°C 灭菌 20min ； [0073]所述种子优化培养基组成为:磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.Sg,硫酸亚铁
0.02g，葡萄糖20g，中草药粉剂15-25g,海藻糖10_30g,蒸懼水lOOOmL, pH值5.5,121°C灭菌 20min ；
[0074]所述发酵优化培养基组成为:玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麸皮10_15g，鱼粉10-15g，氯化钙6-10g，氯化铵l_3g，磷酸氢二钠l_2g，中草药粉剂15_20g，海藻糖10_30g，纯净水 lOOOmL, pH 值 5-7，121°C 灭菌 20min ；
[0075]所述中草药粉剂的制备方法如下:
[0076]称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10_15份；黄芩10_15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70°C~90°C保持2~4h，添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60°C~78°C保持3~4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
[0077]所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1-1.5。
[0078]实施例4饲用复合酶的热稳定性分析
[0079]对饲用复合酶的热稳定性进行了分析，将实施例3粗酶液分别置于30°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C下，每隔10分钟取样测定饲用复合酶中各组成酶的酶活。30°C、40°C、45°C、50°C下，60分钟各组成酶酶活没有下降。55°C、60°C与65下，30分钟各组成酶酶活降到原有酶活的95%，60分钟各组成酶酶活降到85%。70°C下，30分钟各组成酶酶活降到原有酶活的90%，60分钟各组成酶酶活降到85%。75°C下，30分钟各组成酶酶活降到原有酶活的85%，60分钟各组成酶酶活降到原有酶活的80%，同样条件下达到同样酶活耐受温度比出发菌平均提高了 5-10°C。
[0080]实施例5饲用复合酶的pH稳定性分析
[0081]对饲用复合酶酶的pH稳定性进行了分析，将实施例3粗酶液分别置于pH值2.0、2.5,3.5,4.5,5.5,6.0,6.5,7.0下，每隔10分钟取样测定饲用复合酶中各组成酶的酶活。粗酶液pH值5.5、6.0、6.5、7.0下，60分钟各组成酶酶活没有下降。pH值4.5、3.5下，30分钟各组成酶酶活降到原有酶活的95%，60分钟各组成酶酶活降到原有酶活的85%。pH值2.5下，30分钟各组成酶酶活降到原有酶活的90%，60分钟降到原有酶活的85%。pH值
2.0下，30分钟各组成酶酶活降到原有酶活的85%，60分钟降到原有酶活的80%，同样条件下达到同样酶活耐PH值比出发菌和优化培养基前的筛选菌株较宽泛。
【权利要求】
1.一种高产饲用复合酶的黑曲霉(Aspergillus niger)DM_18,该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2013541。
2.如权利要求1所述高产饲用复合酶的黑曲霉DM-18在复合酶制备中的应用，所述复合酶包括甘露聚糖酶、α-半乳糖酶、果胶酶和蛋白酶。
3.如权利要求2所述高产饲用复合酶的黑曲霉DM-18在复合酶制备中的应用，其特征在于，在制备复合酶时斜面优化培养基组成如下:干酪素4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g,葡萄糖20g，琼脂20g，中草药粉剂5-20g，蒸馏水1000mL，pH值 5.8。
4.如权利要求2所述高产饲用复合酶的黑曲霉DM-18在复合酶制备中的应用，其特征在于，在制备复合酶时平板优化培养基组成如下:干酪素4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g,葡萄糖20g，琼脂20g，中草药粉剂10_25g，蒸馏水1000mL,pH 值 5.8，121°C 灭菌 20min。
5.如权利要求2所述高产饲用复合酶的黑曲霉DM-18在复合酶制备中的应用，其特征在于，所述种子优化培养基组成为:磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.Sg,硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，中草药粉剂15-25g,海藻糖10_30g,蒸懼水1000mL, pH值5.5,121 °C灭菌 20min。
6.如权利要求2所述高产饲用复合酶的黑曲霉DM-18在复合酶制备中的应用，其特征在于，所述发酵优化培养基组成为:玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麸皮10-15g，鱼粉10_15g，氯化钙6-10g，氯化铵l_3g，磷酸氢二钠l-2g，中草药粉剂15-20g，海藻糖10_30g，纯净水1000mL, pH 值 5-7,121°C灭菌 20min。`
7.如权利要求3-6任一所述高产饲用复合酶的黑曲霉DM-18在复合酶制备中的应用，其特征在于，所述中草药粉剂的制备方法如下:` 称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10-15份；黄芩10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70°C~90°C保持2~4h，添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60V~78°C保持3~4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
8.如权利要求7所述高产饲用复合酶的黑曲霉DM-18在复合酶制备中的应用，其特征在于，所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1-1.5。
【文档编号】C12N9/62GK103740601SQ201310717009
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】李洪兵, 张锦杰, 朱永明, 孙明芳, 陈香 申请人:湖南鸿鹰生物科技有限公司