专利名称:一种烟曲霉发酵生产阿魏酸酯酶的方法
技术领域：
本发明属于生物工程和微生物发酵领域，尤其涉及一种烟曲霉发酵生产阿魏酸酯酶的方法。
背景技术：
阿魏酸(Ferulic acid，4_羟基_3_甲氧基肉桂酸)大量存在于植物和食品原料中，研究发现，阿魏酸在抗氧化性、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌消炎、抗突变和防癌等方面均表现出较强的活性。植物细胞壁木质素中，阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等酚酸类物质以酯键方式与半纤维素支链形成致密网状交联结构，从空间上限制了动物或微生物对植物细胞壁的有效降解。除了纤维素酶、β -糖苷酶参与降解纤维素和半纤维素分子外，越来越多研究表明，阿魏酸酯酶、木聚糖酶等可以协同降解致密网状交联结构。
阿魏酸酯酶(Ferulic acid esterase)又称肉桂酸酯酶,它是一种羧酸酯酶,属胞外酶，能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键。用阿魏酸酯酶处理植物性原料，能将有药用价值和保健功能的阿魏酸游离出来，同时，植物性原料通过阿魏酸酯酶的处理细胞壁会变得疏松，后续作为饲料工业的原料更容易被禽畜消化利用。为此，研究高酶活阿魏酸酯酶的获得和制备方法具有重要意义。
研究表明，真菌、细菌和酵母都能分泌阿魏酸酯酶，如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、乳酸菌、热纤梭菌等。各种微生物分泌的阿魏酸酯酶在氨基酸序列、肽链的结构、物化性质和催化特性上都有所不同，其中，由黑曲霉(Aspergillus niger)得到的两种阿魏酸酯酶FAEA和FAEB受到研究者普遍关注。
公开号为CN101200712A的发明专利申请公开了一种固态发酵生产阿魏酸酯酶的方法，以汽爆处理植物秸杆和麸皮为发酵培养基主要原料，以筛选获得的黑曲霉为菌种，通过固态发酵生产方式生产阿魏酸酯酶。目前，工业上对阿魏酸酯酶的需求很大，应用于工业的阿魏酸酯酶也主要由黑曲霉生产，由于黑曲霉的阿魏酸酯酶对高温、酸或碱等条件耐受性不足，一定程度上限制了阿魏酸酯酶在工业上的应用。因此，筛选高产阿魏酸酯酶的微生物菌株并研究相关的发酵培养体系，有利于阿魏酸酯酶更广泛的工业化应用。
发明内容
本发明提供了一种烟曲霉发酵生产阿魏酸酯酶的方法，以玉米粉或麸皮为发酵原料，利用烟曲霉通过微生物发酵法生产阿魏酸酯酶，工艺简单，条件温和，阿魏酸酯酶活性闻。
将经活化的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)CGMCC No. 3. 5835接种于培养液中，并在25 30°C下发酵培养2 6天；
其中，所述的培养液由玉米粉或麸皮与基础液体培养基组成。
发酵液经离心操作，取上清液，即得到含阿魏酸酯酶的酶液。
所述的烟曲霉CGMCC No. 3. 5835购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌株编号为CGMCC No. 3. 5835。该烟曲霉经过鉴定属于半知菌纲(Fungi Imperficti),壳霉目(Sphaeropsidales),杯霉科(Discellaceae),曲霉属(Aspergillus) 0在马铃薯(PDA)固体培养基上，菌株生长较满，形成淡绿色或绿色孢子。
接种时，可以先制备浓度为IX IO6 IX IO8个/mL的烟曲霉CGMCC No. 3. 5835孢子悬浮液，将该孢子悬浮液接种到培养液中，接种量优选为30 150mL/lL培养液。
所述的玉米粉或麸皮的粒径优选为40 60目。优选的，以体积IL计，所述的基础液体培养基包括=KH2PO4 I 4g，Na2HPO4 · 7H20I 6g, NaCl O O. 2g，酵母粉 5 10g, MgSO4 · 7H20 O. I O. 3g, CaCl2 O O. 05g。
所述的培养液中玉米粉或麸皮的质量百分比浓度为I 3%。
在所述的发酵培养条件下，玉米粉能更好地诱导烟曲霉表达和分泌阿魏酸酯酶。
所述发酵培养的温度优选为28°C，时间优选为4 5天。在该发酵培养条件下，烟曲霉发酵玉米粉或麸皮产阿魏酸酯酶活性最高。
所述的培养液可以置于摇床中进行发酵培养，摇床转速优选为120 150rpm，更优选为140rpm，这样更有利于微生物细胞的分散及其与发酵原料之间的充分接触。
本发明方法以烟曲霉为发酵微生物，以玉米粉或麸皮为发酵培养基主要原料，在适宜的培养条件下通过液体发酵方式生产阿魏酸酯酶，取得了较理想的产酶效果。烟曲霉对外界条件耐受性强，生长繁殖快；玉米粉或麸皮等原料来源广泛；同时，该法操作简便，易于控制，生产周期短，条件温和，安全可靠，且产阿魏酸酯酶活性较高，稳定性好，酶活测定快捷方便，为阿魏酸酯酶的工业化生产提供新思路。
图I为本发明方法的流程示意图。
具体实施方式
实施例I玉米粉诱导下微生物发酵生产阿魏酸酯酶比较
(I)培养液的制备取 KH2PO4 3g，Na2HPO4 · 7H20 6g，NaCl O. lg，酵母粉 8g，MgSO4 ·7Η20 0. 2g, CaCl2 0.05g，粉碎至40目的玉米粉20g，加入IOOOmL水中，加热混匀，获得培养液；将培养液分装到250mL锥形瓶中，每个锥形瓶含30mL培养液。
(2)菌株的活化将在4°C下保藏的烟曲霉接种于马铃薯琼脂斜面培养基上，于28°C下活化培养3天；将活化后的烟曲霉用接种针刮入无菌水中，振荡制得烟曲霉孢子悬浮液，烟曲霉孢子悬浮液中烟曲霉孢子浓度为I X IO6个/mL。上述烟曲霉购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌株编号为CGMCC No. 3. 5835。
(3)酶液的制备向30mL培养液中加入ImL烟曲霉孢子悬浮液，于28°C、转速140rpm的摇床中发酵培养5天；发酵后的培养液于4°C、IOOOOrpm下离心2min,上清液稀释10倍待用。
(4)阿魏酸酯酶酶活的测定取50mM阿魏酸甲酯溶于IOmL色谱纯的甲醇，加入90mL柠檬酸盐缓冲液(O. 1M，pH6. O)稀释10倍得底物溶液；取2mL底物溶液加热至40°C，再加入ImL步骤(3)制得的酶液，继续在40°C下反应30min ;加热至95°C，维持IOmin终止反应，室温下冷却得到待测酶液。[0025]采用薄层色谱法(TLC)定性分析待测酶液中是否含有阿魏酸，对其中含有阿魏酸的待测酶液再利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进行定量测定，换算即可得到阿魏酸酯酶的酶活值。酶活的定义在40°C，pH6. O条件下，每分钟水解底物阿魏酸甲酯产生I μ moL阿魏酸所需要的酶量为一个酶活力单位。
采用薄层色谱法(TLC)对酶解反应产物阿魏酸进行定性分析，包括取待测酶液，加等体积的乙酸乙酯进行萃取，静置分层，取上层清液，用毛细管点样器进行点样；将硅胶板放入展开剂中进行展开，展开剂为甲苯乙酸=4 l(v V)，晾干；之后放入碘蒸气中熏蒸一段时间，观察斑点颜色。通过比对阿魏酸标准品与待测酶液样品在硅胶板上的迁移距离(Rf值)，从而定性判断待测酶液样品中是否含有阿魏酸。
采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对酶解反应产物阿魏酸进行定量分析，包括取阿魏酸标准品溶于甲醇，制成lmg/mL的标准溶液，依次稀释成100mg/L,50mg/L,10mg/L, 8mg/L, 4mg/L, 2mg/L, lmg/L标准溶液；.取配制好的阿魏酸系列标准溶液各ImL于 洁净干燥的进样瓶中，进样，在色谱检测条件下测定对应的峰面积值(A)，以峰面积值A为纵坐标，阿魏酸浓度C为横坐标，绘制标准曲线；经统计处理得阿魏酸的线性回归方程为A=42710C+16602(R2 = O. 9992)。根据同样的方法，对待测酶液进行检测，峰面积值代入线性回归方程即得阿魏酸的含量。色谱条件色谱柱为C18反相柱(250 X 4. 6mm，4 μ m)，流动相为乙腈O. 5%甲酸=30 : 70 (V : V),流速I. OmL/min,检测波长317nm,柱温30°C,进样量10 μ L,跑样时间30min。
对比例1-11
将实施例I中的烟曲霉分别用黑曲霉(Aspergillus niger)DNl、黑曲霉DN2、黑曲霉QH12、黑曲霉ZJU、臭曲霉(Aspergillus foetidus)QH>臭曲霉GQ1、点青霉(Penicillium notatum)ALI、浅根霉(Rhizopus ssp)、米曲霉(Aspergillus oryzae) >
木霉(Trichoderma koningii)ZJU、黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens Sacc)Ull 替代(上述菌株为利用常规方法分离得到的试验材料，无特异性要求)，其余步骤相同，以玉米粉为培养基主要原料发酵生产阿魏酸酯酶，具体结果见表I。
表I玉米粉诱导下不同微生物发酵生产阿魏酸酯酶比较
权利要求
1.一种烟曲霉发酵生产阿魏酸酯酶的方法，包括 将经活化的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)CGMCC No. 3. 5835接种于培养液中，并在25 30°C下发酵培养2 6天； 其中，所述的培养液由玉米粉或麸皮与基础液体培养基组成； 以体积IL计，所述的基础液体培养基包括=KH2PO4I 4g，Na2HPO4 7H20 I 6g，NaCl0 0. 2g，酵母粉 5 10g，MgSO4 7H20 0. I 0. 3g, CaCl20 0. 05g。
2.根据权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述的玉米粉或麸皮的粒径为4(T60目。
3.根据权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述的培养液中玉米粉或麸皮的质量百分比浓度为I 3%。
4.根据权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述的接种为将浓度为IX IOf^l X IO8个/mL的烟曲霉CGMCC No. 3. 5835孢子悬浮液接种到培养液中，接种量为3(Tl50mL/lL培养液。
5.根据权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为28°C，时间为4 5天。
6.根据权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述的培养液置于摇床中进行发酵培养，摇床转速为120 150rpm。
专利摘要
本发明公开了一种烟曲霉发酵生产阿魏酸酯酶的方法，将经活化的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)CGMCC No.3.5835接种于培养液中，并在25～30℃下发酵培养2～6天；其中，所述的培养液由玉米粉或麸皮与基础液体培养基组成。采用本方法，以玉米粉为发酵培养基的主要原料，烟曲霉通过液体发酵在第4～5天产阿魏酸酯酶酶活稳定达到98U/L以上。本发明原料来源广泛，菌株生长繁殖快；工艺简单，条件温和，易于控制；且产阿魏酸酯酶酶活较高，稳定性好，酶活测定方便，为阿魏酸酯酶的工业化生产提供新思路。
文档编号C12N9/18GKCN102286442 B发布类型授权 专利申请号CN 201110257798
公开日2012年8月29日 申请日期2011年9月2日
发明者何国庆, 傅明亮, 冯宇, 方若思, 董亚晨, 陈启和 申请人:浙江大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (5), 非专利引用 (4),