专利名称:一种利用黑曲霉生产壳聚糖酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用黑曲霉生产壳聚糖酶的方法，具体而言是指利用黑曲霉 (Aspergillusniger)Lff-I菌株固态发酵生产壳聚糖酶的新工艺，属于生物工程技术领域：
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背景技术：
壳聚糖是几丁质的脱乙酰基产物，是一种高分子阳离子絮凝剂。壳聚糖经部分降解得到的壳寡糖具有良好的水溶性，易被生物体吸收，且无毒、无热源、无变异性，并具有独特的生理活性，在农业、食品、医药等领域中有着广泛的应用前景。目前，国内外由壳聚糖制备壳寡糖主要有三种方法酸降解法、氧化降解法和酶解法。其中利用专一性的壳聚糖酶水解壳聚糖，具有反应条件温和、反应过程易控制及对环境无污染等特点，且壳寡糖产量高、 质量稳定，是一种较为理想的生产壳寡糖的方法。
壳聚糖酶的分布较广泛，目前已在细菌(Bacillus、Myxobacter, Enterobacter)、 放线菌(Streptomyces、Nocardioides)、霉菌(Aspergillus、Penicillium)、病毒 (chlorella virus PBCV_1、CVK_2)和植物的不同组织中检测到壳聚糖酶的存在，并已从发酵液中纯化得到壳聚糖酶。大多数微生物壳聚糖酶是一种诱导酶，在细胞的正常代谢活动中，微量合成或不合成，底物的存在将导致壳聚糖酶的大量合成。陈小娥等报道了摇瓶发酵一株曲霉菌，在粗酶液中检测到壳聚糖酶活性为197U/mL，同时研究了碳源对自筛曲霉突变株0U22-326)产酶的影响，发现CJ22-3^5菌株壳聚糖酶是一种典型的诱导酶，其合成与分泌都需要壳聚糖的诱导，质量分数为2%的壳聚糖起到最佳的诱导效果。孙玉英等报道的 Microbacterium sp. OUOl菌株产壳聚糖酶活性为118U/mL。余蓉等在发明专利(《壳聚糖酶制备新工艺》，公开号CN1810963A)中报道了利用贵州绿僵菌(Metarhizium guizhouense) 固态发酵生产壳聚糖酶的新技术，但壳聚糖酶固态发酵酶活性仅为83. lU/g干培养基。综上所述，目前无论是液体发酵或固态发酵，微生物产壳聚糖酶活性均较低，导致了壳聚糖酶的生产和应用成本高，从而限制了该酶的广泛应用；且未见有利用黑曲霉固态发酵生产壳聚糖酶的文献或专利报道。微生物固态发酵具有设备简单、投入少、见效快、生产成本低及对环境友好等优势。本发明利用黑曲霉固态发酵生产壳聚糖酶的酶活性高于目前国内水平。
发明内容
本发明的目的是提供一种以麸皮、玉米粉和豆饼粉等农副产品为发酵基料，利用黑曲霉LW-I固态发酵生产壳聚糖酶的方法。本发明所述固态发酵的技术方案和内容如下
1.菌株黑曲霉(Aspergillus niger) Lff-I菌株，由江南大学筛选和保藏，该菌株已于2008年在《农业生物技术学报》杂志的Vol. 16 No. 2 Pg. 346公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。
2.斜面种子培养去皮马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L, pH 6. O ； 121°C灭菌20min，放置试管斜面；冷却后接种LW-I菌株，30°C培养96h。此斜面培养基可用于菌种的活化、保藏和斜面种子等，每3个月转接1次。
3.麸曲种子制备:250mL三角瓶装IOg基料(麸皮IOg)，(NH4)2SO4 IOOmg,自来水 12mL, pH 6. 0 ；充分混勻，121°C灭菌40min ；冷却后接种LW-I试管斜面种子，30°C静置培养 96h，期间分别于24h和44h各翻曲一次。
4.固态发酵250mL三角瓶中装IOg基料(麸皮8 10g，豆饼粉0 2g，玉米粉 0 Ig)，(NH4)2SO4 50 lOOmg，壳聚糖 0 0. 3g, MgSO4 5 IOmgjCaCl2 5 IOmgjKH2PO4 30 50mg，自来水12 15mL，pH 6.0 ；充分混勻，121°C灭菌40min ；冷却后接种一菌耳LW-I 麸曲种子，30°C静置培养84 96h，期间分别于20 24h和40 44h各翻曲一次。
5.粗酶液提取固态发酵结束后称取发酵曲料lg，加入9mL的pH 5. 0,0. 05mol/L 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，室温浸泡lh，滤纸过滤，所得滤液即为壳聚糖酶液。
6.分析方法
壳聚糖酶活性测定于25mL具塞试管A和B中，分别加入用pH 5. 0、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制的质量浓度为1. 0%的壳聚糖溶液2. 4mL，50°C预热lOmin，在A管中加入0. ImL适当稀释的酶液，50°C准确反应20min;立即各加入2. 5mL 3'，5' -二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min，冷却后各加去离子水 5mL,混勻；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从盐酸氨基葡萄糖标准曲线上查出相应的还原糖(以氨基葡萄糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义为在本测定条件下，以每分钟产生1 μ g还原糖所需的酶量定义为1个壳聚糖酶活性单位(U)。
还原糖测定采用DNS法，以盐酸氨基葡萄糖为标准。
曲料水分测定称取一定量的固态发酵培养物(曲料)，105°C烘干至恒重。
本发明的有益效果本发明突出的优点是利用廉价的麸皮、豆饼粉和玉米粉等农副产品作为发酵主原料，且采用的生产菌株黑曲霉(Aspergillus niger)是公认安全 (GRAS)的微生物，其具有安全、可靠和不产生毒素等特点。本发明利用黑曲霉LW-I菌株固态发酵生产壳聚糖酶是一种充分利用自然界可再生资源、绿色环保且可持续的生产方式， 同时具有设备简单、投资少、见效快、生产成本低廉等优势。本发明在实验室小试规模上，利用黑曲霉LW-I菌株固态发酵生产壳聚糖酶，其壳聚糖酶发酵酶活性可达1381 1966U/g 干曲。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明，但不应将此理解为本发明上述内容的范围仅局限于下述实施例。
实施例1
1.菌株黑曲霉(Aspergillus niger)Lff-I 菌株。
2.固态发酵培养基250mL三角瓶装IOg基料(麸皮10g)，(NH4)2SO4 IOOmg, MgSO4IOmg, CaCl2 IOmg, KH2PO4 30mg,自来水 13mL, pH 6· 0。
3.固态发酵条件培养基121°C灭菌40min，冷却后接种一菌耳LW-I麸曲种子， 30°C静置培养96h，期间分别于20h和40h各翻曲一次。
重复3批次(每批次平行做3瓶)的上述三角瓶实验结果表明，LW-I成熟固态发酵曲料的壳聚糖酶平均酶活性达到1451U/g干曲。[0021]实施例2
1.菌株黑曲霉(Aspergillus niger)Lff-l 菌株。
2.固态发酵培养基250mL三角瓶装IOg基料(麸皮IOg)，(NH4)2SO4 IOOmg,壳聚糖 0. 2g, MgSO4 IOmg, CaCl2 IOmg, KH2PO4 30mg,自来水 13mL, pH 6· O。
3.固态发酵条件培养基121°C灭菌40min，冷却后接种一菌耳LW-I麸曲种子， 30°C静置培养96h，期间分别于20h和40h各翻曲一次。
重复3批次(每批次平行做3瓶)的上述三角瓶实验结果表明，LW-I成熟固态发酵曲料的壳聚糖酶平均酶活性达到1966U/g干曲。
实施例3
1.菌株黑曲霉(Aspergillus niger)Lff-l 菌株。
2.固态发酵培养基250mL三角瓶装IOg基料(麸皮8g，豆饼粉2g)，(NH4)2SO4 lOOmg，壳聚糖 0. 3g, MgSO4 IOmg, CaCl2 IOmg, KH2PO4 30mg,自来水 13mL, pH 6.0。
3.固态发酵条件培养基121°C灭菌40min，冷却后接种一菌耳LW-I麸曲种子， 30°C静置培养96h，期间分别于20h和40h各翻曲一次。
重复3批次(每批次平行做3瓶)的上述三角瓶实验结果表明，LW-I成熟固态发酵曲料的壳聚糖酶平均酶活性达到1381U/g干曲。
权利要求
1.一种实验室小试生产壳聚糖酶的新工艺，其特征在于以廉价的麸皮、豆饼粉和玉米粉等农副产品为固态发酵培养基的主料，并添加适量的无机氮源、壳聚糖和无机盐等，在 250mL三角瓶中，利用黑曲霉(Aspergillus niger)LW-1菌株进行固态发酵；发酵结束后向培养物中加入缓冲液提取壳聚糖酶。
2.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于使用的菌种是黑曲霉LW-I菌株。
3.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于采用的发酵工艺是固态发酵。
4.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于使用的固态发酵培养基配方为250mL三角瓶装IOg基料(麸皮8 10g，豆饼粉0 2g，玉米粉0 Ig)，(NH4) 2S04 50 lOOmg，壳聚糖 0 0. 3g, MgSO4 5 IOmgjCaCl2 5 IOmgjKH2PO4 30 50mg,自来水 12 15mL，pH 6. 0。
5.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于采用的固态发酵培养条件为发酵培养基 121°C灭菌40min，冷却后接种一菌耳黑曲霉LW-I麸曲种子，30°C静置培养84 96h，期间分别于20 24h和40 44h各翻曲一次。
专利摘要
一种利用黑曲霉生产壳聚糖酶的方法，属于生物工程技术领域：
。本发明采用廉价的麸皮、豆饼粉和玉米粉等农副产品为发酵基料，并添加适量的无机氮源、壳聚糖和无机盐等，利用黑曲霉(Aspergillus niger)LW-1菌株固态发酵生产壳聚糖酶。本发明提供了黑曲霉LW-1菌株实验室小试生产壳聚糖酶的固态发酵培养基配方和培养条件，其成熟发酵曲料的壳聚糖酶活性可达1381～1966U/g干曲。本壳聚糖酶生产新工艺具有设备简单、投入少、见效快、生产成本低廉、对环境友好以及壳聚糖酶固态发酵酶活性较高等优势，有利于壳聚糖酶的开发和利用，具有较高的经济和实用价值。
文档编号C12R1/685GKCN102154241SQ201010550909
公开日2011年8月17日 申请日期2010年11月19日
发明者史红玲, 吴静, 唐存多, 李剑芳, 邬敏辰, 陈伟 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan