一种高产木聚糖酶的黑曲霉及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产木聚糖酶的黑曲霉及其应用。黑曲霉（Aspergillus?niger）SM24/a，保藏编号为：CGMCC?No.8671。本发明提供的黑曲霉SM24/a，其能产生一种对于乙醇、乙酸、糠醛、香草醛、阿魏酸以及其混合物具有较好耐受性的木聚糖酶，且该产酶菌株产木聚糖酶活力极高，该木聚糖酶的固体发酵酶活最高可达10801IU/g（在1min内催化产生1μmol木糖的量定义为一个酶单位），最适反应pH值为5.6，最适反应温度为37℃，50℃时酶活残留率为79.01%。此外，5-羟甲基糠醛对于该酶具有抑制作用。5-羟甲基糠醛在单独存在或者混合存在时，其浓度与抑制率呈现一定的线性关系。因此，本发明的木聚糖酶也可作为5-羟甲基糠醛的浓度的定性乃至定量的指示剂。
【专利说明】一种高产木聚糖酶的黑曲霉及其应用
【技术领域】:
[0001]本发明属于微生物发酵及其酶工程化应用领域，具体涉及一种高产木聚糖酶的黑曲霉(Aspergillus niger) SM24/a以及该木聚糖酶在制备应用酶抑制法快速检测5-轻甲基糠醛浓度的制剂中的应用。
【背景技术】:
[0002]木聚糖酶,英文名称xylanase,简称XYL,是一种能催化水解β — 1，4木聚糖糖苷键的吡喃木糖，从而释放出木糖及木寡糖的酶。在半纤维素原料乃至纤维素原料的加工过程中，添加木聚糖酶可显著加速反应进程，改善产品的使用特性，降低生产工艺的成本、能耗和环境污染。因此，木聚糖酶被广泛地应用到纸浆造纸、食品、饲料和纺织等传统领域和木质纤维素乙醇领域。
[0003]木聚糖酶在木质纤维素生物精炼领域中具有重要的研究意义和重大的应用前景。Pryor S W(2012)认为添加木聚糖酶后，可以促进液氮浸泡后甘蔗渣的纤维素酶酶解。SillsDL (2012)通过在碱处理之后的柳枝稷中添加木聚糖酶，能够进一步提高还原糖的得率。木聚糖酶在促进纤维素酶酶解预处理后的作用和效果已经被广泛的认可。甚至，Billard H(2012)认为，通过添加木聚糖酶等酶的混合纤维素酶才是降低木质纤维素领域用酶成本和提闻酶解效率的决定性因素。
[0004]然而，在木聚糖酶应用到木质纤维素生物精炼领域中，木聚糖酶还要面临错综复杂的酶解条件和环境。值得注意的是预处理之后产生的抑制物对木聚糖酶酶解性能的影响。然而，截至目前为止，鲜见抑制物对于木聚糖酶的作用研究，且被研究的抑制物种类偏少。
[0005]不是所有的木聚糖酶对于多种单一的抑制物或者多种抑制物的混合物都具有较好的或者良好的耐受性。也不是所有的耐受性良好的木聚糖酶，其菌株可以高产木聚糖酶。如de Souza Moreira (2013)的研究显示,香草醒和阿魏酸对于来源于土曲霉的木聚糖酶具有一定的抑制作用，然而其所用的土曲霉菌株产木聚糖酶酶活极低。
【发明内容】
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[0006]本发明的第一个目的是提供一种高产木聚糖酶的黑曲霉(Aspergillus niger)SM24/a，该菌于2013年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为:CGMCC N0.8671。
[0007]本发明的黑曲霉(Aspergillus niger) SM24/a是从枯枝烂叶、土壤等材料中筛选培养出来。其真菌分类学表明:该菌菌丝体呈白色，菌落小而致密，可产黑色孢子。PDA培养基培养I天开始长白色菌丝，培养36h左右开始长黑色孢子。
[0008]本发明的黑曲霉(Aspergillus niger) SM24/a的分类学地位根据下述方法确定: [0009]常规方法提取真菌的18s rDNA，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。经比较分析及利用BIOLOG鉴定系统，本发明的黑曲霉(Aspergillus niger) SM24/a属于曲霉属，将其命名为黑曲霉(Aspergillus niger)SM24/a，该菌于2013年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为:CGMCC N0.8671。
[0010]利用木聚糖(Beech wood, SIGMA)测定木聚糖酶酶活，发现本发明的黑曲霉(Aspergillus niger) SM24/a能高产木聚糖酶，该木聚糖酶的固体发酵酶活最高可达10801IU/g (在Imin内催化产生I μ mo I木糖的量定义为一个酶单位)，最适反应pH值为
5.6，最适反应温度为37°C，50°C时酶活残留率为79.01%。
[0011]因此，本发明的第二个目的是提供一种木聚糖酶，其特征在于，以黑曲霉(Aspergillus niger) SM24/aff2为发酵菌株,经发酵而制得。
[0012]本发明的第三个目的是提供黑曲霉(Aspergillus niger)SM24/a在生产木聚糖酶上的应用。
[0013]本发明的第四个目的是提供木聚糖酶在制备应用酶抑制法快速检测5-羟甲基糠醛浓度的制剂中的应用。
[0014]本发明提供的黑曲霉(Aspergillus niger) SM24/a,其能产生一种对于乙醇、乙酸、糠醛、香草醛、阿魏酸以及其混合物具有较好耐受性的木聚糖酶，且该产酶菌株产木聚糖酶活力极高，该木聚糖酶的固体发酵酶活最高可达10801IU/g (在Imin内催化产生I μ mo I木糖的量定义为一个酶单位)，最适反应pH值为5.6，最适反应温度为37°C，50°C时酶活残留率为79.01%。此外，5-羟甲基糠醛对于该酶具有抑制作用。5-羟甲基糠醛在单独存在或者混合存在时，其浓度与抑制率呈现一定的线性关系。因此，本发明的木聚糖酶也可作为5-羟甲基糠醛的浓度的定性乃至定量的指示剂。 [0015]本发明的黑曲霉(Aspergillus niger) SM24/a于2013年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为:CGMCC N0.8671。
【专利附图】
【附图说明】:
[0016]图1是pH值作为发酵参数对本发明的黑曲霉(Aspergillus niger) SM24/a产木聚糖酶酶活性的影响；
[0017]图2是本发明黑曲霉(Aspergillus niger) SM24/a产木聚糖酶的pH酶学特性；
[0018]图3是本发明黑曲霉(Aspergillus niger) SM24/a产木聚糖酶的温度酶学特性；
[0019]图4是含5-羟甲基糠醛的混合抑制物的不同浓度与木聚糖酶酶活保留率之间的关系;
[0020]图5是应用本发明的黑曲霉(Aspergillus niger) SM24/a的18S rDNA构建的系统发育树。
【具体实施方式】:
[0021]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0022]实施例1:菌株的筛选
[0023]筛选样品为枯枝烂叶、土壤等材料。筛选样品经过适当处理后，梯度稀释涂布于木聚糖初筛培养基，该培养基的配方是:每升培养基中含有KH2PO40.5g，(NH4)2S042.0g,MgSO4.7Η200.25g，木聚糖(购自上海源聚生物)5.0g，琼脂18~20g，余量为水，pH5.6。30°C培养4~7d，挑取水解透明圈较大的菌落在PDA培养基上纯化，纯化后的菌株进行PDA斜面保存。
[0024]产木聚糖酶菌株发酵活力复筛:将PDA斜面保存的纯化菌株分别接种到等量的发酵复筛培养基液中，30°C，120rpm，培养6d。依据Bailey (1992)等人的测定方法并进行适当修改。具体方法为:准确称取木聚糖lg，在pH4.8 (0.2mol/L)的醋酸-醋酸钠缓冲液低速搅拌2.5h后定容配置成1%的底物。取0.9mLl%的木聚糖底物置于15mL刻度试管，于50V恒温预热5min，准确加入适当稀释的酶液(纯化菌株的发酵液)0.2mL,用秒表精确计时反应30min，立即加入2mL DNS终止反应，沸水浴5min，于540nm处测光吸收值(OD)。然后选择木聚糖酶活力活力较高的菌株进行妥善地保藏。所述的发酵复筛培养基液为修改过的Mander s营养液，其是在原Mandel’ s营养液的基础上去掉酵母粉和蛋白胨再加入玉米芯粉，使其终浓度为30g/L。
[0025]经筛选获得I株木聚糖酶活力极高的菌株，将该菌株命名为菌株SM24/a。
[0026]菌株SM24/a菌丝体呈白色，菌落小而致密，可产黑色孢子。PDA培养基培养I天开始长白色菌丝，培养36h左右开始长黑色孢子。 [0027]采用改良CTAB法提取菌株总DNA，选择扩增真菌ITS序列的通用引物ITSl: 5’ -TCCGTA GGT GAA CCT GCG G-3’ 和 ITS4:5’ -TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ 对黑曲霉(Aspergillus niger) SM24/a总DNA进行序列的扩增。在20 μ L的PCR反应体系中含有10XBuffer2y L (含 MgC12，2.5mmol/L)，dNTP (10mmol/L)0.4 μ L，上下游引物量为 IOpmol,rTag (5U/ μ L)0.2 μ L，约50ng的模板DNA，其余体积以无菌超纯水补足。PCR扩增条件为:95°C预变性 3min ;94°C变性 lmin，52°C退火 50s，72°C延伸 50s，35 个循环；72°C延伸 lOmin。PCR扩增产物采用DNA凝胶回收试剂盒进行割胶回收，并测序，其序列如SEQ ID N0.1所示。将该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的18S rDNA序列，构建系统发育树，如图5所示，经比较分析并结合BIOLOG鉴定结果，该菌属于黑曲霉，将其命名为黑曲霉(Aspergillus niger) SM24/a，该菌于2013年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为=CGMCC N0.8671。
[0028]实施例2:木聚糖酶的制备及其酶活力、酶学性质测定
[0029]1.木聚糖酶制剂的制备:将黑曲霉(Aspergillus niger) SM24/a活化，经种子培养，种子培养基为修改过的Mandel’ s营养液(同实施例1)，再加入木聚糖，使其终浓度为5g/L，pH5.6，在115°C下灭菌30min。设定摇床的参数为:30°C，120rpm，培养3天后获得种子培养液。将种子培养液以7.5% (v/w)的接种量接种到固体发酵培养基中，该固体发酵培养基的配方为:玉米芯与麸皮的质量比1:5，以玉米芯和麸皮的混合物为底物和支撑材料，以 1.4g/L(NH4)2S04，2.0g/L KH2PO4,0.3g/L CaCl2,0.3g/L MgSO4，添加适量的微量元素(FeSO4 *7H20,5mg/L ；CoCl2, 20mg/L ；MnSO4, 1.6mg/L ；ZnSO4,1.4mg/L)配置成营养液，溶剂为水，该营养液的起始pH为5.0 (如图1，该pH值是在一系列单因素优化实验后确定的)，以料水比(玉米芯和麸皮的混合物:营养液)1:3.5配置好固态发酵培养基后进行灭菌。接种量为7.5%v/v进行发酵。发酵92-108h后，其发酵液即为木聚糖酶制剂，进行木聚糖酶酶活测定。
[0030]在三角瓶中加入40mL pH4.8的醋酸缓冲液，用玻璃棒捣碎结块的固体发酵培养基(同上)，于110rpm30°C摇荡60min,直接吸取浸提液0.4mL进行梯度稀释，直至达到适当的倍数，然后进行木聚糖酶酶活的测定。
[0031]2.木聚糖酶的酶活力测定:依据Bailey(1992)等人的测定方法并进行适当修改。称取Ig山毛榉木聚糖置于IOOmL烧杯后，倒入60mL pH4.8的醋酸缓冲液低速搅拌2.5h，然后定容IOOmL容量瓶配置成1%山毛榉木聚糖溶液。吸取0.9mLl%山毛榉木聚糖溶液(Beechwood, SIGMA)作为底物，预热5min再加入0.2mL适当稀释的木聚糖酶制剂,在50°C反应30min，立即加入2mL DNS溶液终止反应，沸水浴5min，于540nm处测光吸收值(OD)。经测定，步骤I得到的黑曲霉(Aspergillus niger) SM24/a产的木聚糖酶制剂中的木聚糖酶的活力达到10801IU/g，具有极高的酶活力。
[0032]酶活定义:在Imin内催化产生I μ mo I还原木糖的量定义为一个酶单位。
[0033]3.木聚糖酶的酶学性质的测定:按上述测定方法，其他条件不变的情况下，调节缓冲液到不同的pH、不同的温度进行酶活测定反应，以测得最高酶活为100%，该条件为测得木聚糖酶最适反应条件。利用相应的缓冲液进行梯度稀释，在相同的温度下测定最佳pH。在50°C最佳的pH条件下，设定不同温度以测定酶的最佳温度。
[0034]结果表明，本发明的黑曲霉(Aspergillus niger) SM24/a产的木聚糖酶的最佳反应pH为5.6 (图2)，且在pH5.6的条件下保持酶活稳定，最适反应温度为37°C (如图3所示)。
[0035]实施例3:木聚糖酶对于发酵抑制物的耐受性能
[0036]1.木聚糖酶对单一抑制物的耐受性能 [0037]木聚糖酶对同一种发酵抑制物(如乙醇、乙酸、糠醛、香草醛和阿魏酸)的不同浓度，其相对酶活呈现一定的差异，但是，总体上来讲，都保留了较高的酶活残留率。在乙醇、乙酸的浓度为5g/L、15g/L和30g/L时，以及糠醛(2.5g/L、1.25g/L和0.4g/L)、阿魏酸(1.2g/L、0.6g/L和0.2g/L)和香草醛(1.3g/L、0.65g/L和0.2g/L)的浓度范围时，本发明的木聚糖酶的酶活保留率在93~108%。
[0038]2.木聚糖酶对添加有5-羟甲基糠醛的混合的抑制物的耐受性能:
[0039]如图4所示，在较高浓度的混合抑制物体系中(乙醇、乙酸、糠醛、香草醛、阿魏酸和 5-羟甲基糠醛的浓度分别为(30g/L、30g/L、2.lg/L、l.2g/L、l.27g/L 和 1.24g/L)，本发明的木聚糖酶的酶活保留率是83.30% ;在中等浓度的混合抑制物体系中(乙醇、乙酸、糠醛、香草醛、阿魏酸和5-羟甲基糠醛的浓度分别为(15g/L、15g/L、1.1g/L、0.6g/L、0.6g/L和0.6g/L)，本发明的木聚糖酶的酶活保留率是90.10% ;在低浓度的混合抑制物体系中(乙醇、乙酸、糠醛、香草醛、阿魏酸和5-羟甲基糠醛的浓度分别为5g/L、5g/L、0.35g/L、0.2g/L、0.2g/L和0.2g/L)，本发明的木聚糖酶的酶活保留率是95.59%。因此，可以利用木聚糖酶酶抑制法指示含有5-羟甲基糠醛的混合抑制物。
[0040]本发明的木聚糖酶的对抑制物的耐受性与现有技术中的木聚糖酶完全不同，这种耐受性的木聚糖酶未见有过报道。
[0041]本发明的木聚糖酶对于混合抑制物中的5-羟甲基糠醛具有线性指示作用，这种线性指示作用未见有过报道。因此，本发明木聚糖酶的应用属于一个崭新的领域。
[0042]上述详细说明是针对本发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
【权利要求】
1.一种黑曲霉(Aspergillus niger) SM24/a，其保藏编号为=CGMCC N0.8671。
2.—种木聚糖酶，其特征在于，以权利要求1所述的黑曲霉(Aspergillus niger)SM24/aW2为发酵菌株，经发酵而制得。
3.权利要求1所述的黑曲霉(Aspergillusniger) SM24/a在生产权利要求2所述的木聚糖酶上的应用。
4.权利要求2所述的木聚糖酶在制备应用酶抑制法快速检测5-羟甲基糠醛浓度的制剂中的应用。
【文档编号】C12N9/42GK103992954SQ201410125861
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年3月28日 优先权日:2014年3月28日
【发明者】袁振宏, 许敬亮, 何敏超, 张宇, 孔晓英, 粱翠谊, 陈小燕, 刘云云, 刘颖 申请人:中国科学院广州能源研究所