一种用于检测阴道加德纳菌的引物对、试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测阴道加德纳菌的引物对、试剂盒及其应用。本发明的引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ?ID?NO：1上的一段序列，所述下游引物为SEQ?ID?NO：1的互补序列上的一段序列。使用本发明的特异性引物对能够快速、灵敏、准确地从临床样品中检测阴道加德纳菌，这对于早期诊断、及时治疗和有效控制生殖道阴道加德纳菌感染极有意义。
【专利说明】—种用于检测阴道加德纳菌的引物对、试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及疾病检测【技术领域】，尤其涉及阴道加德纳菌的检测，特别涉及一种用于检测阴道加德纳菌的引物对、试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]生殖道感染(Reproductive Tract Infection, RTI)是指各种病源微生物和寄生虫感染于生殖道或是经生殖道感染的一组感染性疾病的统称，包括内源性、外源性、医源性及性传播等感染，该病主要发生于生育期。生殖道感染疾病危害性涉及到诸多方面，表现在:(I)危害人类生殖健康，所导致的严重后果包括慢性盆腔炎疼痛、男女不孕症、宫外孕、异位妊娠和感染HIV风险增加等。(2)RTI还会对新生儿的健康带来影响，很多性传播疾病(如梅毒、淋病、衣原体、乙肝、人类乳头状瘤病毒、单纯疱疹病毒和艾滋病毒)可以通过妇女的怀孕期、分娩期和哺乳期传给孩子，这被称为“垂直传播”，给婴儿的健康造成严重后果。另外RTI也会引起自然流产、胎膜早破、早产和由此产生的低出生体重以及死胎。当孕妇为淋病患者时，多达35%的妊娠结果为自然流产和早产，多达10%为围产儿死亡。当孕妇衣原体未经治疗，新生儿先天性感染几率为30%，每年有数千名新生儿因此而失明。(3)生殖道感染疾病影响避孕节育的安全性。(4)生殖道感染还可增加宫颈癌发生的危险。(5)生殖道感染会增加多种疾病混合感染的危险，例如淋病患者感染衣原体、支原体的概率为非感染者的3-5倍。RTI带来这些严重的后果，对男性、女性个人和他们的家庭乃至整个社区造成健康问题。在我国有生殖感染症状的育龄妇女比例高达34.1%，已婚育龄妇女的既往生殖感染率高达73%，同时生殖感染疾病发病率目前也正以30%的速度逐年增长。
[0003]妇女RTI疾病严重 影响人类生殖健康，随着RTI发病率的上升，经济生产率受到影响，很多家庭的生活质量下降，RTI已经成为当今人类面临的重大社会问题。
[0004]阴道加德纳菌(Gardnerellavaginalis，GV)是RTI常见的病原体和女性细菌性阴道炎(BV)的主要病原体。细菌性阴道炎是育龄妇女一种常见的临床症候群，以下生殖道微生物菌群的变迁为主要特征，表现为占绝对优势的乳酸杆菌被具有潜在致病作用的高浓度GV以及相关的微生物所代替。GV可经性传播，不仅可以引起阴道炎和尿道炎，还可引起盆腔炎、异常子宫出血和子宫内膜炎、羊膜和绒毛膜炎、羊水感染、胎膜早破和早产、低出生体重儿、产后感染和子宫颈癌，而且与HIV的的传播增高率有关。
[0005]目前对GV的实验诊断主要以直接涂片寻找线索细胞(染色法)、胺试验、分离培养法、气相色谱法、免疫荧光法、聚合酶链反应技术以及分子杂交探针法等。后三种方法要求特殊实验设备及技术，一般难在普通实验室推广。革兰氏染色法受显微镜，标本采集以及操作者的经验等诸多因素影响，主观性强；胺试纸法检测灵敏度不但比革兰氏染色法低，而且比临床检测也低，加上胺试纸的稳定读取时间较短，不适合在临床上使用；阴道加德纳菌厌氧，对营养要求高，分离培养耗时长，培养困难；气相色谱法操作繁琐，试验成本较高。有报道用酶标葡萄球菌A蛋白来检测血清中加德纳菌抗体，阳性率偏低；酶测定法(脯氨酸氨基肽酶是BV的特异性标志酶)特异性较低。已有报道,克隆表达vaginolysin (简写VLY,加德纳菌细胞质的特异性抗原)，纯化后免疫动物获得多克隆抗体，建立ELISA方法来检测阴道加德纳菌，虽然这方法灵敏性高，但多克隆抗体特异性不是很高。
[0006]GV已被确认是女性BV的重要病菌，与输卵管妊娠、胎膜早破和新生儿早产等不良妊娠结局以及女性间质性膀胱炎等关系密切。近年来，随着社会发展、人们生活环境和传统文化观念的改变等因素，性病病原体感染率增加，BV发病率有逐年增高的趋势，所以建立快速、灵敏、准确地从临床标本中直接检阴道加德纳菌，对于BV的早期诊断、治疗和控制有重大意义。
[0007]自上世纪80年代起，分子生物学研究的不断深入，PCR技术开始广泛应用于微生物领域，该技术灵敏度好、特异性高，操作简单、快速，很大程度上缩短了诊断时间。
【发明内容】
[0008]针对现有技术的不足，本发明人通过PCR方法确定了一段阴道加德纳菌的保守序列，通过检测该段保守序列能够检测阴道加德纳菌的感染，所述保守序列具有SEQ ID N0:1所示的序列。因此，本发明的目的在于提供一种用于检测阴道加德纳菌的引物对，包括所述引物对的PCR检测试剂盒及其应用。使用本发明提供的阴道加德纳菌的特异性引物对能够快速、灵敏、准确地从临床样品中检测阴道加德纳菌，这对于早期诊断、及时治疗和有效控制生殖道阴道加德纳菌感染极有意义。
[0009]在第一方面，本发明提供一种用于检测阴道加德纳菌的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ ID NO:1上的一段序列，所述下游引物为SEQ ID N0:1的互补序列上的一段序列。
[0010]本发明人通过研究发现，SEQ ID NO:1是一段在阴道加德纳菌基因组上具有高度保守性的序列，而且相比于阴道加德纳菌基因组上的其它序列片段，该序列片段更容易扩±曾，针对该序列片段通过设计引物对取自人体(如女性生殖器)的样品进行PCR扩增能够判定阴道加德纳菌的感染情况。发明人针对该序列片段设计了多对引物进行PCR扩增，均能得到预期的扩增产物。而针对阴道加德纳菌基因组上的其它几个序列片段设计引物进行PCR扩增，没有得到预期的扩增产物。说明本发明的SEQ ID NO:1是易于扩增的序列片段，能够用于确定阴道加德纳菌的感染。
[0011]作为本发明的优选技术方案，所述上游引物和下游引物的序列长度均为12-30个碱基，例如12个碱基、15个碱基、16个碱基、18个碱基、20个碱基、22个碱基、25个碱基、27个喊基或29个喊基等。
[0012]作为本发明的优选技术方案，所述上游引物的5’端起始于SEQ ID NO:1的第一个碱基；所述下游引物的5’端第一个碱基与SEQ ID NO:1的最后一个碱基互补。其中，SEQID NO:1的第一个碱基即5’端的首个碱基，最后一个碱基即3’端的首个碱基。这样的一对引物能够扩增出SEQ ID NO:1的全长序列，长度为219bp。
[0013]作为本发明的优选技术方案，所述上游引物和下游引物的PCR扩增产物的大小为120-219bp,例如 125bp、138bp、147bp、154bp、168bp、179bp、185bp、193bp、199bp、208bp 或215bp，优选160-219bp，更优选189_219bp。PCR扩增产物的大小具体是由引物对在SEQ IDNO:1序列上的位置决定的。
[0014]作为本发明的优选技术方案，所述引物对的扩增产物为SEQ ID NO:USEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13 或 SEQ ID NO: 18，大小分别为 219bp、213bp、200bp 和 189bp。
[0015]作为本发明的优选技术方案，所述上游引物选自SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14 或 SEQ ID NO:16 ;所述下游引物选自 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:170可以从上游引物的具体例中选择一个引物与从下游引物的具体例中选择的一个引物配对进行PCR扩增。
[0016]作为本发明的优选技术方案，所述引物对选自下列任一项:
[0017](a)所述上游引物为SEQ ID NO:2，所述下游引物为SEQ ID NO:3 ；
[0018](b)所述上游引物为SEQ ID NO:4，所述下游引物为SEQ ID NO:5 ；
[0019](c)所述上游引物为SEQ ID NO:6，所述下游引物为SEQ ID NO:7 ；
[0020](d)所述上游引物为SEQ ID NO:9，所述下游引物为SEQ ID NO:10 ；
[0021](e)所述上游引物为SEQ ID NO:11，所述下游引物为SEQ ID NO:12 ；
[0022](f)所述上游引物为SEQ ID NO:14，所述下游引物为SEQ ID NO:15 ；
[0023](g)所述上游引物为SEQ ID NO:16，所述下游引物为SEQ ID NO:17。
[0024]本发明人使用(a)~(g)中的7对引物进行PCR扩增，分别得到219bp、219bp、213bp、213bp、200bp、200bp和189bp的扩增产物，与预期相符，因此可使用这7对引物作为检测阴道加德纳菌感染的引物对。
[0025]在第二方面，本发明提供一种阴道加德纳菌的PCR检测试剂盒，包括第一方面所述的引物对。
[0026]作为本发明的优选技术方案，所述PCR检测试剂盒还包括PCR缓冲液、MgCl2溶液、dNTPs和Taq DNA聚合酶。
[0027]在第三方面，本发明提供一种第一方面所述的引物对在作为阴道加德纳菌的PCR检测试剂盒的特异性引物或作为阴道加德纳菌的基因芯片探针序列中的应用。
[0028]本发明的有益效果为:本发明人研究发现了一段阴道加德纳菌的保守序列SEQ IDNO:1，该段保守序列易于扩增，具有高度的阴道加德纳菌特异性，本发明针对该序列设计了引物对，使用本发明提供的引物对扩增临床样品，能够快速、灵敏、准确地从临床样品中检测阴道加德纳菌，对于早期诊断、及时治疗和有效控制生殖道阴道加德纳菌感染极有意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为本发明实施例1的引物对扩增临床标本的PCR扩增产物鉴定结果图，其中泳道Mr为DNA Marker,泳道I和2为从临床阳性样品(阴道加德纳菌感染)DNA中扩增的产物，泳道3为阴性对照。
[0030]图2为本发明实施例1阳性扩增产物的测序结果图，其中，测序图谱上第168位C到386位T之间的序列为PCR产物的序列，与预计序列的反向互补序列一致。
[0031]图3为本发明实施例1阳性扩增产物的测序结果与NCBI数据库中Blast比对结
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【具体实施方式】
[0032] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。
[0033]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
[0034]实施例中，pMD18-T载体、PCR buffer、MgCl2, dNTPs、Taq DNA 聚合酶和 DNALigation Kit 购自 Takara (大连)，DNeasy Plant Mini Kit 购自 Qiagen 公司。试剂盒保存于-20°C，尽量避免反复冻融。
[0035]实施例1:
[0036]本实施例以ATAGGCGATTGCGCTTACGAAG(SEQ ID NO:2)和 CACGTCTTCGCTTGCACAAAG(SEQ ID NO:3)作为引物对扩增临床样本。
[0037](I) PCR扩增反应
[0038]准备好3支PCR反应管，分别向其中加入临床阳性样品DNA和阴性对照样品，随后分别加入0.1yL Taq 酶、0.8μ L dNTPs (2.5mM)U μ L PCR buffer (10*PCR buffer),
0.6μ L MgCl2(25yM)、0.1yL上游引物(100 μ M)和 0.1 μ L下游引物(100 μ Μ)，用 ddH20补充至总体积?ο μ L。将已经加好样的PCR管放置PCR仪上，设置PCR反应参数(见表1)，进行扩增；反应结束后，用1%的琼脂糖凝胶进行鉴定，结果如图1，样品大小结果与预计大小相符，阴性结果正常。
[0039]表1PCR反应参数
【权利要求】
1.一种用于检测阴道加德纳菌的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ ID NO:1上的一段序列，所述下游引物为SEQ ID NO:1的互补序列上的一段序列。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述上游引物和下游引物的序列长度均为12-30个碱基。
3.根据权利要求1或2所述的引物对，其特征在于，所述上游引物的5’端起始于SEQID NO:1的第一个碱基；所述下游引物的5’端第一个碱基与SEQ ID NO:1的最后一个碱基互补。
4.根据权利要求1或2所述的引物对，其特征在于，所述上游引物和下游引物的PCR扩增产物的大小为120-219bp，优选160-219bp，更优选189_219bp。
5.根据权利要求1-4任一项所述的引物对，其特征在于，所述引物对的扩增产物为SEQID NO:USEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13 或 SEQ ID NO:18。
6.根据权利要求1-5任一项所述的引物对，其特征在于，所述上游引物选自SEQIDNO:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO:14 或 SEQ IDNO:16 ;所述下游引物选自 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQID NO:12, SEQ ID NO:15 或 SEQ ID NO:17。
7.根据权利要求1-6任一项所述的引物对，其特征在于，所述引物对选自下列任一项: Ca)所述上游引物为SEQ ID NO:2，所述下游引物为SEQ ID NO:3 ； (b)所述上游引物为SEQID NO:4，所述下游引物为SEQ ID NO:5 ； (c)所述上游引物为SEQID NO:6，所述下游引物为SEQ ID NO:7 ； Cd)所述上游引物为SEQ ID NO:9，所述下游引物为SEQ ID NO:10 ； Ce)所述上游引物为SEQ ID NO:11，所述下游引物为SEQ ID NO:12 ； Cf)所述上游引物为SEQ ID NO:14，所述下游引物为SEQ ID NO:15 ； (g)所述上游引物为SEQ ID NO:16，所述下游引物为SEQ ID NO:17。
8.一种阴道加德纳菌的PCR检测试剂盒，包括权利要求1-7任一项所述的引物对。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR缓冲液、MgCl2溶液、dNTPs和Taq DNA聚合酶。
10.一种权利要求1-7任一项所述的引物对在作为阴道加德纳菌的PCR检测试剂盒的特异性引物或作为阴道加德纳菌的基因芯片探针序列中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103882134SQ201410125746
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月31日 优先权日:2014年3月31日
【发明者】黄钟, 李小青 申请人:深圳意达凯生物科技有限公司