一种木聚糖酶突变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种木聚糖酶突变体，是氨基酸序列为SEQ?ID?NO：1的木聚糖酶的第5位氨基酸由Pro变为Asn，第34位氨基酸由Gln变为Asn。上述木聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQ?ID?NO：2，其一种编码基因的核酸序列为SEQ?ID?NO：3。本发明的木聚糖酶突变体最适pH值为5.5，在酸性、中性范围内具有较高酶活，在pH2.0-5.0范围内，突变体的酶活残留率均高于野生型；木聚糖酶突变体的最适作用温度为60℃，且在70℃条件下仍能保持约80%的酶活，比野生型具有更强的耐热性。此外，本发明的木聚糖酶突变体对胃蛋白酶和胰蛋白酶也具有很强的耐受性，有利于其在饲料领域的广泛应用。
【专利说明】一种木聚糖酶突变体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于功能基因改造【技术领域】，具体是一种木聚糖酶突变体及其应用。
技术背景
[0002]木聚糖(xylan)广泛存在于自然界中，是半纤维素的重要组分，它是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一。在被子植物中木聚糖占干物质重的15%-30%，在裸子植物中占干物质重的7%-12%。但木聚糖具有很强的抗营养作用，在动物的消化道内不能被消化和吸收，而且会影响其它养分的吸收利用，因而大大限制了富含木聚糖饲料(大麦、小麦、黑麦等)的应用。木聚糖酶(Xylanase)是指能专一降解半纤维素木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称。人们对木聚糖酶的研究早在六十年代就已开始，主要研究集中在食品、饲料、造纸、能源工业等方面的木聚糖酶，已经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同功能的木聚糖酶。并分离出多种木聚糖酶基因，已工业化生产多种木聚糖酶产品。
[0003]迄今为止发现的大多数木聚糖酶最适作用pH值在6-7范围内，关于酸性木聚糖酶的报道比较少。近几年对酸性木聚糖酶(PH4.0以下时仍保持较高酶活性)的开发已经引起人们的广泛关注，对于酸性木聚糖酶的生产、纯化、性质、酸性特征的结构基础及其在饲料加工、酿酒工业、 果汁加工、以及能源等领域的应用等方面的研究正在不断深入。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种木聚糖酶突变体及其应用，通过对来源于里氏木霉(Trichoderma reesei)的木聚糖酶进行蛋白质工程改造,获得了突变体蛋白，其耐热性得到显著提高，有利于其在饲料领域的广泛应用。
[0005] 申请人:对里氏木霉木聚糖酶的N末端进行突变，经过大量的筛选，发现P5N、Q34N这两个突变位点能引起木聚糖酶耐热性的改变，从而促成本发明。
[0006]本发明一方面提供了一种木聚糖酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的木聚糖酶的第5位氨基酸由Pro变为Asn，第34位氨基酸由Gln变为Asn。
[0007]上述木聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，其一种编码基因的核酸序列为 SEQ ID NO:3o
[0008]本发明另一方面提供了携带有编码序列为SEQ ID NO:3的木聚糖酶突变体基因的质粒。
[0009]将上述质粒转入毕赤酵母中进行重组表达，获得的木聚糖酶突变体耐热性得到很大提闻。
[0010]本发明的木聚糖酶突变体最适pH值为5.5，在酸性、中性范围内具有较高酶活，在PH2.0-5.0范围内，突变体的酶活残留率均高于野生型；木聚糖酶突变体的最适作用温度为60°C，且在70°C条件下仍能保持约80%的酶活，比野生型具有更强的耐热性。此外，本发明的木聚糖酶突变体对胃蛋白酶和胰蛋白酶也具有很强的耐受性，有利于其在饲料领域的广泛应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1:本发明木聚糖酶突变体XYNHlO与野生型XynII的最适作用pH比较示意图；
[0012]图2:本发明木聚糖酶突变体XYNHlO与野生型XynII的pH稳定性比较图；
[0013]图3:为木聚糖酶突变体XYNHlO与野生型XynII的最适作用温度比较图；
[0014]图4:木聚糖酶突变体XYNHlO与野生型XynII的耐热性比较图。
【具体实施方式】
[0015]本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook,2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(AusubeI, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
[0016]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细描述。
[0017]实施例1木聚糖酶突变体基因的合成及扩增
[0018]为了提高来源于里氏木霉的木聚糖酶XynII (GenBank:AAB29346.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的耐热性,通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选,设计PCR 引物 Xynl1-FUXynI1-Rl 如下:·[0019]XynI1-Fl:GGCGAATTCCAGACTATCCAACCAGGAA (下划线为限制性内切酶 EcoRI 识别位点)
[0020]XynI1-Rl:ATAGCGGCCGCTTAAGAAACAGTAATAGAT (下划线为限制性内切酶 NotI 识别位点)
[0021]以XynII基因为模板，以上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoR1、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，370C 220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有木聚糖酶的大肠杆菌细胞裂解液。
[0022]分别取出30ul裂解液至两块新的96孔板，其中一块于70°C处理IOmin后，两块96孔板都加入30ul底物，于37°C反应30min后，DNS法测定生成的还原糖，不同的突变子高温处理后保持的活性不同。结果发现有些突变对木聚糖酶的耐热性没有影响，有些突变甚至使耐热性降低了，对依然保持高活性的突变子进行DNA测序，最终， 申请人:获得了能提高木聚糖酶耐热性的突变组合P5N和Q34N。
[0023]含P5N和Q34N两点突变的木聚糖酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID N0:2，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:3由上海捷瑞生物公司合成。
[0024]将合成的木聚糖酶突变体基因命名为XynHIO，用引物Xynll-Fl、XynI1-Rl进行PCR扩增，引物两端引入EcoR 1、Not I位点。PCR反应条件为:94°C变性5min ;然后94°C变性30s，56°C复性30s，72°C延伸lmin，30个循环后，72°C保温lOmin。琼脂糖凝胶电泳结果显示，XynHlO基因为大小576bp的片段。
[0025]通过上述同样的PCR方法扩增得到野生型木聚糖酶XynII的基因片段。
[0026]实施例2毕赤酵母工程菌株的构建
[0027]将上述克隆得到的木聚糖酶突变体基因XynHlO片段，通过EcoR I和Not I位点与表达载体PPIC9K相连接，构建表达载体pPIC9K-XynH10。
[0028]将表达质粒pPIC9K_XynH10用Sal I进行线性化，表达质粒线性化片段通过电穿孔法转化毕赤酵母GSl 15，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株GSl 15/pPIC9K-XynH10，然后在含不同浓度遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。
[0029]将一个转化子命名为毕赤酵母XynHlO (Pichia pastoris XynHlO)，转接于BMGY培养基中，30°C、250rpm振荡培养Id ;再转入BMM培养基中，30°C、250rpm振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4d ;离心去除菌体，得到含木聚糖酶XynHlO的发酵上清液；将其进行SDS-PAGE电泳检测分析，结果显示发酵上清液中重组木聚糖酶突变体XynHlO的分子量大小约为20kDa。
[0030]通过上述同样的酶切连接方法将野生型木聚糖酶基因XynII克隆到毕赤酵母GS115宿主中，构建得到重组表达野生型木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，命名为毕赤酵母XynII (Pichia pastoris XynlD0 摇瓶水平发酵毕赤酵母 XynII, 30°C、250rpm 振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4d;离心去除菌体，得到含重组野生型木聚糖酶XynII的发酵上清液。
[0031](I)木聚糖酶活单位的定义
[0032]在37°C、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中释放
Iμ mol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
[0033](2)酶活测定方法
[0034]取2ml浓度为1%的木聚糖底物(pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制)，加入到比色管中，37°C平衡lOmin，再加入2ml经pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液适当稀释并经37°C平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混匀于37°C精确保温反应30min。反应结束后，加入5ml DNS试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5min，用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ml，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值Ae。
[0035]酶活计算公式:
[0036]
【权利要求】
1.一种木聚糖酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的木聚糖酶的第5位氨基酸由Pro变为Asn，第34位氨基酸由Gln变为Asn。
2.如权利要求1所述的木聚糖酶突变体，其特征在于，所述的突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:2o
3.编码权利要求1所述的突变体的基因，其核酸序列为SEQID Ν0:3。
4.一种重组质粒，所述的重组质粒携带有权利要求3所述的基因。
5.一种重组毕赤酵母，所述的重组毕赤酵母携带有权利要求4所述的重组质粒。
【文档编号】C12N15/81GK103627686SQ201310567525
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月14日 优先权日:2013年11月14日
【发明者】徐晓东, 王华明, 李冬冬, 赵俊桥, 王海, 邵静 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司