专利名称：：一种木聚糖酶编码基因及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种木聚糖酶编码基因及其应用。
背景技术：
：木聚糖是由e-l，4-木糖苷键连接而成的线状木糖多聚体，侧链上连着多种不同的取代基。在自然界中，木聚糖是第二丰富的半纤维素类多糖，在被子植物中木聚糖占植株干物质重的15%~30%，在裸子植物中占植株干物质重的7%~12%。木聚糖在动物的消化道内不能被消化和吸收，而且会影响其他养分的吸收利用，具有很强的抗营养作用，因而大大地限制了富含木聚糖的饲料(如大麦、小麦和黑麦等)的应用。工业上降解木聚糖的方法主要有两种，即酸解和酶解。酸解作用较快，但常伴随着有毒物质的生成，而且容易引起容器的腐蚀。降解木聚糖的酶类主要是内切e-1，4-木聚糖酶(EC3.2丄8)，该酶能将木聚糖分解成低聚糖、木糖和少量的阿拉伯糖。自然界中，除细菌、真菌等微生物能产生木聚糖酶外，藻类、原生动物、甲壳类动物、昆虫、蜗牛和植物的种子等都可产生木聚糖酶。目前，用于生产实践中的木聚糖酶主要来自于真菌，因为真菌产生的木聚糖酶能够分泌到培养基中，易于纯化，而且其活性较高。在产木聚糖酶的真菌中，研究较多的是曲霉0^/^"///^*.)，到目前为止，己有十几种曲霉产木聚糖酶的性质获得了深入的研究。
发明内容本发明的目的是提供一种木聚糖酶编码基因及其应用。本发明所提供的木聚糖酶编码基因可为如下l)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列l;2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码木聚糖酶的DNA分子；3)与l)的基因具有90%以上的同源性，且编码木聚糖酶的DNA分子。序列表中的序列l由624个碱基组成，其开放阅读框架(0RF)为自5'末端第1-624位碱基，编码木聚糖酶。所述木聚糖酶的氨基酸序列如GenBankAccessionNo.DQ168666所示。上述严格条件可为在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C条件下杂交并洗膜。扩增上述木聚糖酶编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。含有上述木聚糖酶编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组载体具体可为在毕赤酵母组成型表达载体pGAPzaA的多克隆位点间插入上述木聚糖酶编码基因得到的重组载体，如pGAP-xynB。所述重组菌具体可为在毕赤酵母x-33中导入含有上述木聚糖酶编码基因的重组载体得到的重组菌。本发明的第三个目的是提供一种制备木聚糖酶的方法。本发明所提供的制备木聚糖酶的方法，是发酵培养上述含有木聚糖酶编码基因的重组菌，得到木聚糖酶。上述重组菌可用于制备猪、鸡等单胃动物的饲料添加剂，以提高饲料的利用率。本发明通过基因工程技术，利用硫色曲霉木聚糖酶xynB的氨基酸序列(GenBankAccessionNo.DQ168666)和毕赤酵母的密码子偏好性，合成了一个木聚糖酶编码基因，并将其转入毕赤酵母中，从而能高效生产木聚糖酶。摇瓶发酵研究表明，利用本发明方法生产的木聚糖酶的产量达到20000U/mL，该木聚糖酶的最适催化温度为5(TC，最适催化pH为4.4，适合作为猪、鸡等单胃动物的饲料添加剂使用。图1为木聚糖酶基因的重叠PCR扩增结果图2为重组菌株表达产物的SDS-PAGE分析结果图3为木聚糖酶的最适pH值图4为木聚糖酶的最适温度具体实施例方式实施例l、木聚糖酶编码基因的重叠PCR法从头合成根据已报道的硫色曲霉木聚糖酶xynB的氨基酸序列(GenBankAccessionNo.DQ168666)和毕赤酵母的密码子偏好性，设计8对引物(见表1)，利用重叠PCR方法，扩增木聚糖酶编码基因序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>具体PCR扩增方法为以B-F-1和B-R-1为引物，进行PCR扩增，得到二聚体;再以此二聚体为模板，以B-F-2和B-R-2为引物，进行PCR扩增；然后以上一轮PCR扩增产物为模板，以B-F-3和B-R-3为引物，进行PCR扩增；如此依次以上一轮PCR扩增产物为模板进行PCR扩增。PCR扩增条件为先94°C30S、然后68°C30S、最后72°Clmin，共35个循环。将上述PCR扩增产物分别进行化琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图l所示。其中，泳道M为DNA分子量标准，泳道1-8依次分别为以B-F-l和B-R-l、B-F國2和B-R-2、B隱F-3和B陽R-3、B-F隱4和B-R-4、B-F隱5和B-R-5、B-F隱6和B-R-6、B-F-7和B-R-7、B-F-8和B-R-8为引物的PCR扩增结果。纯化并回收约600bp的PCR扩增产物(即以B-F-8和B-R-8为引物的PCR扩增产物)进行测序，测序结果表明，扩增得到624bp的木聚糖酶编码基因，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示。实施例2、利用含有木聚糖酶编码基因的重组菌发酵生产木聚糖酶一、含有木聚糖酶编码基因的重组菌的构建将上述实施例1扩增得到的木聚糖酶编码基因(即以B-F-8和B-R-8为引物扩增得到的PCR产物)经过纯化后，用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切，然后与经过同样酶切的毕赤酵母组成型表达载体pGAPzaA(购自Invitrogen公司，USA)相连接，连接产物转化大肠杆菌T叩IO感受态细胞，经抗生素Zeocin筛选后，获得阳性克隆。提取阳性克隆的质粒，将得到的重组表达载体命名为pGAP-xynB。将10吗重组表达载体pGAP-xynB用限制性内切酶BspHI(购自NewEnglandBiolabs公司，USA)线性化后，电击转化至毕赤酵母x-33(购自Invitrogen公司，USA)的感受态细胞中(电转化条件2000V，25pF)，经抗生素Zeocin筛选后，获得阳性重组菌，将得到的阳性重组菌命名为x-33'。二、利用重组菌x-33'摇瓶发酵生产木聚糖酶挑取上述步骤一获得的重组菌x-33'的单菌落接种到YPD液体培养基中，28。C振荡培养过夜；将培养物按照l:1000的体积比转接到100mL新鲜的YPD液体培养基中，28t:振荡培养48h，得到发酵液。同时以未转入重组表达载体的毕赤酵母x-33的发酵液作为对照。将发酵液离心，取上清液进行12%的SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示。其中，泳道M为蛋白质分子量标准，泳道1为未转入重组表达载体的毕赤酵母x-33培养上清的SDS-PAGE电泳检测结果，泳道2和3为重组菌x-33'摇瓶培养48小时后上清液的SDS-PAGE电泳检测结果。结果表明，重组菌x-33'的培养上清经SDS-PAGE检测得到一条约20kDa的特异性表达条带，即木聚糖酶。对上述得到的木聚糖酶进行酶活检测。酶活测定采用DNS法，将l个酶活单位(U)定义为50°C、pH4.4的条件下，每分钟从质量百分含量为0.8%的木聚糖溶液中降解释放l叱还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位。实验设三次重复，每个样品测定均设三个平行实验，相对误差控制在5%以内。结果表明，摇瓶培养48小时后，发酵液中的木聚糖酶的平均酶活为20000U/mL。三、木聚糖酶的酶学性质分析1、酶反应最适温度的测定在20-65'C范围内，pH4.4的条件下测定上述步骤二获得的木聚糖酶的酶活，并计算木聚糖酶的相对活力。以20-65t;温度范围内测得的最高酶活力为基础，其它温度下测得的酶活力与之相比，所得数值即为该温度下的相对酶活力。实验设三次重复，结果如图4所示。结果表明，pH4.4的条件下，上述步骤二获得的木聚糖酶在50。C时酶活最高，此时的平均相对酶活力为100%。2、酶反应最适pH值的测定采用pH值分别为2.4、3.4、4.4、5.4、6.4和7.4的Na2HP04-柠檬酸缓冲液，将上述步骤二获得的含有木聚糖酶的上清液稀释100倍，底物(木聚糖)也用相同的缓冲液配制，5(TC条件下测定木聚糖酶的酶活，并计算木聚糖酶的相对活力。以pH值2.4-7.4范围内测得的最高酶活力为基础，其它pH值下测得的酶活力与之相比，所得数值即为该pH值下的相对酶活力。实验设三次重复，结果如图3所示。结果表明，5(TC条件下，上述步骤二获得的木聚糖酶在pH4.4时酶活最高，此时的平均相对酶活力为100%。序列表〈160〉1<210>1〈211〉624<212〉腿<213〉人工序列〈220〉〈223〉<400>1gttccacacgactctgtcgtcgagagatctgacgctttgcacaagttgtctgagagatct60accccatcctctaccggtgagaacaacggtttctactactccttctggaccgacggtggt120ggtgacgtcacctacaccaacggtgacgctggttcctacaccgtcgagtggtccaacgtt180ggtaacttcgttggtggtaagggttggaacccaggttctgctcaagacatcacctactcc240ggtaccttcaccccatccggtaacggttacttgtccgtctacggttggaccactgaccca300ttgatcgagtactacatcgtcgagtcctacggcgactacaacccaggttccggtggtact360tacaagggtaccgtcacttccgacggttccgtctacgacatctacaccgctaccagaacc420aacgctgcttctatccaaggtaccgctaccttcacccaatactggtccgttagacaaaac480aagagagttggtggtactgttaccacttccaaccacttcaacgcttgggctaagttgggt540atgaacttgggtactcacaactaccaaatcgtcgctaccgagggttaccaatcctctggt600624200810239321.1tcttcctccatcactgttcaatga权利要求1、一种木聚糖酶编码基因，为如下1)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码木聚糖酶的DNA分子；3)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码木聚糖酶的DNA分子。2、根据权利要求l所述的基因，其特征在于所述木聚糖酶的氨基酸序列如GenBankAccessionNo.DQ168666所示。3、含有权利要求l所述基因的重组表达载体和表达盒。4、根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为在毕赤酵母组成型表达载体pGAPzaA的多克隆位点间插入权利要求1所述基因得到的重组表达载体。5、含有权利要求l所述基因的转基因细胞系。6、含有权利要求l所述基因的重组菌。7、根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于所述重组菌是将权利要求3或4所述的重组表达载体导入毕赤酵母x-33中得到的重组菌。8、扩增权利要求l所述木聚糖酶编码基因全长或其任一片段的引物对。9、一种制备木聚糖酶的方法，是发酵培养权利要求6或7所述的重组菌，得到木聚糖酶。10、权利要求6或7所述的重组菌在制备饲料添加剂中的应用。全文摘要本发明公开了一种木聚糖酶编码基因。该基因为如下1)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码木聚糖酶的DNA分子；3)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码木聚糖酶的DNA分子。本发明通过基因工程技术，合成了上述木聚糖酶编码基因，并将其转入毕赤酵母中，从而能高效生产木聚糖酶。摇瓶发酵研究表明，利用本发明方法生产的木聚糖酶的产量达到20000U/mL，该木聚糖酶的最适催化温度为50℃，最适催化pH为4.4，适合作为猪、鸡等单胃动物的饲料添加剂使用。文档编号C12N5/10GK101418308SQ20081023932公开日2009年4月29日申请日期2008年12月10日优先权日2008年12月10日发明者于贵平,曹云鹤,李一航,李德发,王春林申请人:北京德宝群兴科技有限公司