基于木聚糖酶的工程菌及其实现方法
【专利摘要】一种生物工程【技术领域】的基于β-葡萄糖苷酶的工程菌及其实现方法，该木聚糖酶基因克隆自灰色链霉菌(Streptomyces?griseorubens)JSD-1，将其连接到表达载体上得到重组表达载体，进一步将该重组表达载体导入大肠杆菌并诱导合成木聚糖酶。本发明克服现有技术中的内切-β-1,4-木聚糖酶多为胞内酶且表达量较低，应用范围受限等不足，应用基因工程菌表达本发明所述的内切-β-1,4-木聚糖酶基因制备木聚糖酶，可为木聚糖酶的规模化发酵生产提供一种新方法。
【专利说明】基于木聚糖酶的工程菌及其实现方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种生物基因工程【技术领域】的基因及其实现方法，具体是一种能够外源表达定向进化内切-β-1，4-木聚糖酶(Sg-Xya)的大肠杆菌工程菌及其实现方法。
【背景技术】
[0002]木质纤维素是植物界中最为丰富的天然高分子化合物，是植物通过光合作用产生的主要干物质，主要包括纤维素、半纤维素和木质素。据估计，每年全世界绿色植物光合作用产生的木质纤维素总干重为1730亿t，所含总能量可达2 X 1018kJ，相当于每年全世界消耗能量的10倍。木质纤维素的生物降解和解聚作用是一个高度复杂的过程，它涉及众多酶系的参与。
[0003]木质纤维素中的半纤维素组分是由几种不同类型的单糖构成的异质多聚体，这些糖是五碳糖和六碳糖，包括木糖、阿伯糖、甘露糖和半乳糖等。半纤维素主要分为三类:聚木糖类、聚葡萄甘露糖类和聚半乳糖葡萄甘露糖类，其中聚木糖类是以l，4-13_D-吡喃型木糖构成主链，以4-氧甲基-吡喃型葡萄糖醛酸为支链的多糖；聚葡萄甘露糖类是由D-吡喃型葡萄糖基和吡喃型甘露糖基以1，4-β型连接成主链；另一类聚半乳糖葡萄甘露糖类则还有D-吡喃型半乳 糖基用支链的形式以1，6-α型连接到此主链上的若干D-吡喃型甘露糖基和D-吡喃型葡萄糖基上。半纤维素在木质组织中占总量的50%，它结合在纤维素微纤维的表面，并且相互连接，这些纤维构成了坚硬的细胞相互连接的网络。
[0004]半纤维素的主要降解酶有内切-β -1, 4-木聚糖酶(Endo-β -1, 4-xylanases)和β -1, 4-木糖苷酶(β -1, 4-xylosidase)，此外，半纤维素的降解还需要木聚糖酯酶、α -葡糖醒酸酶(a -glucuronidases)、a -L-阿拉伯呋喃糖酶(a -L-arabinofuranosidase)和乙酰酯酶(Acetylesterase)等辅助酶的作用。由此可见，内切_β _1，4_木聚糖酶在纤维素的酶降解过程中起十分关键的作用。
[0005]目前，大量的内切_β- 1，4 -木聚糖酶基因均已被成功克隆和表达。与真核生物基因相比，原核生物基因结构简单、无内含子，具有易克隆、易表达及种类多等优势。灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)是一种常见的土壤细菌(或放线菌)。灰略红链霉菌之前的研究重点为如何改造其代谢途径以提高抗生素尤其是链霉素的发酵产量，对其基因组内其他功能基因的开发和利用还相对较少。
[0006]与大多数细菌相比，链霉菌具有较为复杂的生长、分化机制，基因组较其他的原核生物也更大，可达8-9Mb。一般情况下，链霉菌对大分子多糖物质有很强的分解利用能力，如半纤维素等。因此，研究链霉菌对半纤维素的分解利用机制，发现全新的半纤维素酶尤其是木聚糖酶基因序列并通过转基因对目的基因进行外源表达，对新型半纤维素酶制剂的开发及生产具有重大意义。
【发明内容】
[0007]本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于木聚糖酶的工程菌及其实现方法。
[0008]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0009]本发明涉及一种基于木聚糖酶的工程菌，能够外源表达内切-1，4-木聚糖酶的DH5 α大肠杆菌。
[0010]所述工程菌通过以下方式构建得到:
[0011]I)设计并合成PCR引物，自灰略红链霉菌JSD-1 (CGMCC N0.5706)基因组DNA为模板进行PCR扩增；
[0012]所述的PCR引物是指含有Nde I和EcoR I酶切位点的引物，具体包括:
[0013]正向引物Xya-Nde 1-F:
[0014]5’-GGAATTCCATATGATCGGCACCGCCGTCGCCGGCGG-3’
[0015]反向引物Xya-EcoR 1-R:
[0016]5’-GGAATTCTCAGTGCTTGTGCTTCGGCCCCTTCGGCCCC-3’
[0017]所述的PCR扩增采用PrimeSTAR GXL高保真酶(TaKaRa)进行扩增，PCR扩增条件为:98°C预变性3min ;98°C变形10s，68。。延伸Imin ；30个循环后68°C终延伸3min。
[0018]2)构建具有Sg-Xya基因的质粒:将步骤I得到的PCR扩增产物切胶回收后连接至克隆载体，并导入DH5a大 肠杆菌感受态细胞；挑取具有相应抗性的克隆并通过菌落PCR进行鉴定，直至获得阳性克隆后挑取并摇菌提取得到PET-30质粒。
[0019]所述的克隆载体采用pEASY-Blunt Simple Cloning Vector。
[0020]3)构建具有Sg-Xya基因的表达载体，具体步骤包括:
[0021]3.1)用Nde I和EcoR I双酶切处理含有Sg-Xya基因的克隆质粒后通过琼脂糖凝胶电泳回收含有β_1，4-木聚糖酶(Sg-Xya)基因的片段；
[0022]3.2)用Nde I和EcoR I内切酶处理ρΕΤ_30质粒，并通过琼脂糖凝胶电泳回收载体片段；
[0023]3.3)将两次回收的DNA片段混合，在T4DNA Ligase的作用下过夜连接，然后导入DH5 α大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆并扩大培养提取其质粒，获得含有Sg-Xya基因的表达载体。
[0024]4)将表达载体转化至大肠杆菌:将步骤3中得到的含有Sg-Xya基因的表达载体质粒转入Transetta (DE3)感受态细胞内。通过具有卡那霉素抗性和氯霉素抗性的LB液体培养基进行筛选获得阳性克隆，即含有Sg-Xya基因的工程菌。
[0025]所述的β -1, 4-木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0026]所述的Sg-Xya基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其长度为1026个碱基对，编码341个氨基酸，分子量为39.1KD。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1目的基因PCR扩增结果电泳图。
[0028]图2含有目的基因的克隆载体酶切电泳图。
[0029]图3含有目的基因的ρΕΤ- 30载体酶切电泳图。
[0030]图4重组菌诱导蛋白SDS-PAGE电泳图。【具体实施方式】
[0031]下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
[0032]灰略红链霉菌(Streptomycesgriseorubens) JSD -1 的培养
[0033]灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)分离自上海浦江镇腐烂土壤,保藏编号为CGMCC N0.5706 ;该菌株于2012年I月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中国科学院微生物研究所(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号100101)
[0034]将该菌接种于LB液体培养基中，32°C培养60h，离心收集菌体并提取细菌的基因组 DNA。
[0035]所述的LB液体培养基组分为:蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaC15g、去离子水1L，pH6.8-7.2ο
实施例2
[0036]灰略红链霉菌内切-β -1，4-木聚糖酶(Sg-Xya)基因的克隆
[0037]通过对灰略红链霉菌内切-β-1，4-木聚糖酶基因序列进行分析，设计含有Nde I和EcoR I酶切位点的引物如下:
[0038]正向引物Xya-Nde 1-F:`[0039]5’-GGAATTCCATATGATCGGCACCGCCGTCGCCGGCGG-3’
[0040]反向引物Xya-EcoR 1-R:
[0041]5’-GGAATTCTCAGTGCTTGTGCTTCGGCCCCTTCGGCCCC-3’
[0042]以灰略红链霉菌JSD-1基因组DNA为模板，采用PrimeSTAR GXL高保真酶(TaKaRa)进行扩增。PCR扩增条件为:98°C预变性3min ;98°C变形10s，68°C延伸Imin ；30个循环后68°C终延伸3min。
实施例3
[0043]含有内切-β -1，4-木聚糖酶(Sg-Xya)基因克隆载体的构建
[0044]将PCR扩增产物进行电泳检测，结果表明获得片段约为1.3Kb(见图1);然后将PCR产物切胶回收后连接到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector (北京全式金)，随后导入DH5a大肠杆菌感受态细胞。
[0045]挑取具有相应抗性的克隆，通过菌落PCR进行鉴定，直至获得阳性克隆。挑取阳性克隆，摇菌提取其质粒后送上海桑尼生物有限公司进行测序。
实施例4
[0046]含有内切-β -1，4-木聚糖酶(Sg-Xya)基因表达载体的构建
[0047]选取序列正确的质粒，用Nde I和EcoR I双酶切后通过琼脂糖凝胶电泳回收含有内切-β-1，4_木聚糖酶(Sg-Xya)基因的片段(如图2);同样，用Nde I和EcoR I内切酶处理pET_30a表达载体，并通过琼脂糖凝胶电泳回收较大的载体片段。
[0048]将两次回收的DNA片段混合，在T4DNA Ligase的作用下过夜连接，然后导入DH5 α大肠杆菌感受态细胞。挑取阳性克隆，扩大培养提取其质粒便获得含有内切_β -1，4-木聚糖酶(Sg-Xya)基因表达载体。用Nde I和EcoR I双酶切并通过琼脂糖凝胶电泳检测(如图3),确认载体构建无误。
实施例5
[0049]含有内切-β -1，4-木聚糖酶(Sg-Xya)基因表达菌株的构建
[0050]将含有内切-1，4-木聚糖酶(Sg-Xya)基因表达载体质粒转入Transetta(DE3)感受态细胞内。通过具有卡那霉素抗性和氯霉素抗性的LB固体培养基(抗生素浓度均为25yg/mL)进行筛选获得阳性克隆。获得的阳性克隆便为含有内切-β-1，4-木聚糖酶(Sg-Xya)基因的表达菌株。
实施例6
[0051]内切_β-1, 4-木聚糖酶(Sg-Xya)的外源表达[0052]挑取阳性克隆并接种于含有卡那霉素和氯霉素的LB液体培养基(浓度均为25 μ g/mL)中，32°C、150rpm震荡培养2_3h，当0D600达到0.6-0.8时，加入IPTG使发酵液中IPTG浓度达为0.1mM, 28°C、140rpm继续培养6小时进行诱导表达。待诱导表达完成，离心收集菌体，用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再用1/10发酵液体积的I XPBS缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下超声波破碎至菌液澄清，13000rpm/min离心10min收集上清,上清液即为内切-β -1, 4-木聚糖酶的粗酶液。
实施例7
[0053]重组菌诱导表达内切-β -1, 4-木聚糖酶粗酶液的SDS-PAGE
[0054]制备12%SDS-PAGE 胶，将粗酶液与 5 X SDS-PAGE Loading Buffer 比例混合，与沸水浴lOmin，每个点样孔上样10yL，120V电泳IOmin待条带进入分离胶后调高电压至160V，电泳60-70min，直至溴酚蓝指示条带完全跑出胶。停止电泳，用考马斯亮蓝R-250溶液过夜染色，然后用脱色液进行洗涤，直至背景色完全脱去，条带清晰可见(如图4)。
[0055]所述的12%SDS_PAGE是由浓缩胶与分离胶构成的，其组分分别为:
[0056]分离胶:蒸馏水1.6mL, 30% 丙烯酰胺溶液 2.0mL, 1.5M Tris-HCl (pH8.8) 1.3mL，10% 过硫酸铵(APS) 0.05mL, 10%SDS 溶液 0.05mL, TEMED0.002mL ；
[0057]浓缩胶:蒸馏水0.68mL，30%丙烯酰胺溶液0.17mL，1.0MTris-HCl (pH6.8) 0.13mL, 10% 过硫酸铵(APS) 0.01mL, 10%SDS 溶液 0.01mL, TEMED0.0OlmL ；
[0058]所述的5 X SDS-PAGE Loading Buffer 组分为:IM Tris-HCl (ρΗ6.8) 1.25mL,SDS0.5g，溴酚蓝25mg，甘油2.5mL,去离子水定容至5mL。小份分装(500 μ L)后与室温保存，使用前每小份加入β -巯基乙醇25 μ L0
[0059]所述的考马斯亮蓝R-250溶液组分为:考马斯亮蓝R_2501g，异丙醇250mL，冰醋酸10OmT,,去离子水 650mL。
[0060]所述的脱色液组分为:冰醋酸IOOmL,无水乙醇50mL,去离子水850mL。
【权利要求】
1.一种基于木聚糖酶的工程菌，其特征在于，该工程菌为外源表达内切-β -1，4-木聚糖酶的DH5 α大肠杆菌； 所述的β -1,4-木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示； 所述的β -葡萄糖苷酶具有Sg-Xya基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其长度为1026个碱基对，编码341个氨基酸，分子量为39.1KD。
2.根据权利要求1所述工程菌的实现方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)设计并合成PCR引物，自灰略红链霉菌JSD-1(CGMCC N0.5706)基因组DNA为模板进行PCR扩增； 所述的PCR引物是指含有Nde I和EcoR I酶切位点的引物，具体包括: 正向引物Xya - Nde 1- F:
5’ - GGAATTCCATATGATCGGCACCGCCGTCGCCGGCGG - 3’ 反向引物Xya-EcoR 1-R:
5’ - GGAATTCTCAGTGCTTGTGCTTCGGCCCCTTCGGCCCC - 3’ 2)构建具有Sg-Xya基因的质粒:将步骤I得到的PCR扩增产物切胶回收后连接至克隆载体，并导入DH5ci大肠杆菌感受态细胞；挑取具有相应抗性的克隆并通过菌落PCR进行鉴定，直至获得阳性克隆后挑取并摇菌提取得到PET - 30质粒； 3)构建具有Sg- Xya基因的表达载体； 4)将表达载体转化至大肠杆菌:将步骤3中得到的含有Sg-Xya基因的表达载体质粒转入Transetta感受态细胞内。通过具有卡那霉素抗性和氯霉素抗性的LB液体培养基进行筛选获得阳性克隆，即含有Sg - Xya基因的工程菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增采用PrimeSTARGXL高保真酶进行扩增，PCR扩增条件为:98°C预变性3min ;98°C变形10s，68°C延伸Imin ;30个循环后68°C终延伸3min。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征是,所述的克隆载体采用pEASY-BluntSimpleCloningVector0
5.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的步骤3具体包括: `3.1)用Nde I和EcoR I双酶切处理含有Sg - Xya基因的克隆质粒后通过琼脂糖凝胶电泳回收含有Sg - Xya基因的片段；` ` 3.2)用Nde I和EcoR I内切酶处理pET -30质粒，并通过琼脂糖凝胶电泳回收载体片段； ` 3.3)将两次回收的DNA片段混合，在T4DNA Ligase的作用下过夜连接，然后导入DH5 α大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆并扩大培养提取其质粒，获得含有Sg -Xya基因的表达载体。
【文档编号】C12N9/42GK103865868SQ201410125516
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月31日 优先权日:2014年3月31日
【发明者】周培, 冯海玮, 支月娥, 初少华, 孙玉静, 罗艳青 申请人:上海交通大学