一种重组耐热木聚糖酶的制备方法与流程

本发明属于分子生物学及基因工程领域，具体涉及一种重组耐热木聚糖酶的制备方法。
背景技术：
：木聚糖是植物细胞壁半纤维素的主要成分，是自然界中第二大含量丰富的可再生资源。木聚糖酶能够将木聚糖水解为低聚木糖及木糖，根据木聚糖酶的作用方式可将木聚糖酶分为β-1,4-内切木聚糖酶，β-木糖苷酶，α-葡萄糖醛酸苷酶，α-l-呋喃型阿拉伯糖苷酶等。β-1,4-内切木聚糖酶能够水解木聚糖主链的β-1,4糖苷键，产生低聚木糖和少量木糖，是降解木聚糖的关键酶。由于β-1,4-内切木聚糖酶能够有效的水解木聚糖主链的β-1,4糖苷键，使其在饲料、造纸等工业领域具有巨大的应用潜力。目前限制β-1,4-内切木聚糖酶在饲料、造纸等工业领域产业化应用的主要因素是耐热性能差、生产成本高。饲料及造纸等工业领域均涉及到高温加工环节，普通的β-1,4-内切木聚糖酶经过高温环节后，酶容易变性失活，不能发挥作用。因此筛选及高效表达高温耐热β-1,4-内切木聚糖酶可以有效的推动β-1,4-内切木聚糖酶在饲料、造纸等工业领域的产业化应用。中国专利申请(cn103602645a)公开了一种木聚糖酶的制备方法，木聚糖酶的制备方法，包括下述步骤：活化菌种：用ypd培养基，对含有耐热木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌进行活化，活化条件为28～32℃，20～26h，所述的ypd培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基；扩大培养：将活化好的菌种接入摇瓶中，于28～32℃下，以180～220r/min的转速进行扩大培养；二次扩大培养：22～26h后接入种子罐，28～32℃条件下进一步扩大培养；发酵：经种子罐扩大培养后，接入发酵罐，28-32℃下，ph4.6～4.8条件下进行发酵，140～160h后发酵结束；过滤：将发酵结束的料液，加入1％的硅藻土，混合均匀后，打入板框压滤机进行过滤，过滤压力<0.5mpa；超滤浓缩：过滤澄清后，用膜分子量10000da的有机膜进行超滤浓缩，浓缩至所需要的酶活；加入防腐剂，所述的防腐剂包括盐和山梨酸钾；盐的浓度为8-12％，山梨酸钾的浓度为1-3‰；加入上述的防腐剂后，与滤液混合均匀，在小于0.5mpa的压力下，精滤、除菌，灌装。其发酵得到的木聚糖酶的酶活依旧需要提高。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供了一种重组耐热木聚糖酶tx的制备方法。本发明通过密码子优化技术优化了来源于嗜热细菌thermotogapetrophilarku的β-1,4-内切木聚糖酶基因tx，将优化后的tx基因转入毕赤酵母得到了表达耐热β-1,4-内切木聚糖酶tx的重组工程菌。最后通过高密度发酵技术，实现了耐热木聚糖酶tx的高效表达，为其产业化应用奠定基础。本发明通过以下技术方案实现：一种重组耐热木聚糖酶的制备方法，包括以下步骤：s1.根据毕赤酵母密码子偏好性，对来源于嗜热细菌thermotogapetrophilarku耐热木聚糖酶基因tx进行优化，优化后的耐热木聚糖酶基因tx序列如seqidno.1；s2.合成步骤s1中优化后的耐热木聚糖酶基因tx，构建重组表达载体，将构建成功的重组表达载体转入毕赤酵母得到重组工程菌株，然后进行高酶活转化子筛选；s3.将筛选出来的高酶活转化子进行高密度发酵，即得。优选地，步骤s2中表达载体为ppiczαa或ppic9k。优选地，步骤s3高密度发酵步骤为：i.种子培养液制备：将筛选得到的高酶活转化子接种于100mlbmgy培养基中，30℃、240rpm培养20h进行活化，取活化的菌液以1:50的比例接种到300mlbmgy培养基中，30℃、240rpm培养至od600＝5；ii.向发酵罐中加入20l发酵基础培养基，121℃灭菌20min，调节温度至30℃，用氨水调节ph值至5.0，加入4.35ml/lptml，按体积比1:10接入种子培养液；发酵过程中，温度控制在30℃，通气量维持在2vvm，转速控制在500-800rpm，溶氧维持在20％以上；iii.培养20～30h后，用氨水或磷酸调节ph值至4.5～7.0，培养温度为24～32℃，流加100％甲醇进行诱导培养，诱导培养144～192h后，收集发酵液，进行浓缩、纯化即得。进一步地，高密度发酵步骤ii中，加入种子培养液16～24h后至发酵罐中甘油耗尽，补加含有12ml/lptm1的50％甘油，补料速度为18ml/l·h，持续补加4～6h。进一步地，高密度发酵步骤iii：培养20～30h后，用磷酸调节ph值至5.5，温度为26℃，流加100％甲醇进行诱导培养并补加ptml，诱导培养168h后，收集发酵液，进行浓缩、纯化即得。本发明制备方法用到的相关培养基具体如下：大肠杆菌培养基为lb：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％nacl，ph7.0；lb-amp培养基：lb培养基加100μg/ml氨苄青霉素；lb-zeo培养基：lb培养基加25μg/mlzeocin；毕赤酵母种子培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；酵母筛选培养基为ypdzeo：ypd+100mg/lzeocin；酵母诱导培养基bmgy：1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％ynb、0.00004％biotin、1％甘油(v/v)；bmmy培养基：以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与bmgy相同；重组酵母发酵培养基本盐培养基：磷酸氢二铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、氢氧化钾0.1％、消泡剂0.03％，高压后每升加4.35毫升ptm1；ptm1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％、一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、六水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、浓硫酸0.5％、生物素0.02％。由实验结果可知，本发明方法制备得到的重组耐热木聚糖酶在ph5-10范围内具有很好的稳定性，剩余酶活均大于83％；同时也具有很好的热稳定性，当处理温度为100℃时，剩余酶活可达到81％。附图说明图1：优化前和优化后tx基因序列比对；图2：重组耐热木聚糖酶tx的最适ph及ph稳定性；图3：重组耐热木聚糖酶tx的最适反应温度及温度稳定性。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。大肠杆菌菌株topl0，毕赤酵母以及表达载体ppiczαa和ppic9k均由本司实验室保存。实施例1不同培养基制备按下述配方，进行不同培养基的制备：大肠杆菌培养基为lb：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％nacl，ph7.0。lb-amp培养基：lb培养基加100μg/ml氨苄青霉素；lb-zeo培养基：lb培养基加25μg/mlzeocin；毕赤酵母种子培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；酵母筛选培养基为ypdzeo：ypd+100mg/lzeocin；酵母诱导培养基bmgy：1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％ynb、0.00004％biotin、1％甘油(v/v)；bmmy培养基：以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与bmgy相同；重组酵母发酵培养基本盐培养基：磷酸氢二铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、氢氧化钾0.1％和消泡剂0.03％；高压后每升加4.35毫升ptm1；ptm1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％、一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、六水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、浓硫酸0.5％、生物素0.02％。实施例2一种重组耐热木聚糖酶的制备方法所述重组耐热木聚糖酶的制备方法，包括以下步骤：s1.根据毕赤酵母密码子偏好性，对耐热木聚糖酶基因tx进行优化；针对毕赤酵母表达系统，通过在线软件graphicalcodonusageanalyser(http://gcua.schoedl.de/)对不含信号肽的耐热木聚糖酶基因tx的密码子进行分析，找出低频密码子；根据找出的低频密码子通过软件dna2.0software(http://www.dna20.com)对tx基因进行优化；优化后的tx基因序列如seqidno.1所示，并由基因合成公司进行合成；经过优化，tx基因的密码子适应指数由0.78提升到0.88，gc含量由原来的43％提高到46％；碱基a，t，c和g均匀分布于优化后的tx基因，减少了at和gc富集区，利于tx基因在毕赤酵母的表达；优化后的tx基因与原始基因的相似性为76％，如图1所示；s2.合成步骤s1中优化后的耐热木聚糖酶基因tx，连接到表达载体ppiczαa构建重组表达载体ppiczαa-tx，将构建成功的ppiczαa-tx用限制性内切酶saci线性化后，转入毕赤酵母得到重组工程菌株，然后进行高酶活转化子筛选：将转化子分别接入含有1.4mlbmgy的24孔板中，30℃培养36h后，按体积分数1％的比例加入甲醇进行诱导培养，每24h取样进行测定；s3.将筛选出来的高酶活转化子进行高密度发酵，高密度发酵步骤为：i.种子培养液制备：将筛选得到的高酶活转化子接种于100mlbmgy培养基中，30℃、240rpm培养20h进行活化，取活化的菌液以1:50的比例接种到300mlbmgy培养基中，30℃、240rpm培养至od600＝5；ii.向发酵罐中加入20l发酵基础培养基，121℃灭菌20min，调节温度至30℃，用氨水调节ph至5.0，加入4.35ml/lptml，按体积比1:10接入种子培养液；发酵过程中，温度控制在30℃，通气量维持在2vvm，转速控制在500rpm，溶氧维持在20％以上；加入种子培养液20h后至发酵罐中甘油耗尽，补加含有12ml/lptm1的50％甘油，补料速度为18ml/l·h，持续补加5h；iii.培养30h后，用磷酸调节ph值至5.5，温度为26℃，流加100％甲醇进行诱导培养并补加ptml，诱导培养168h后，收集发酵液，进行浓缩、纯化即得。实施例3一种重组耐热木聚糖酶的制备方法所述重组耐热木聚糖酶的制备方法，包括以下步骤：s1.根据毕赤酵母密码子偏好性，对耐热木聚糖酶基因tx进行优化；针对毕赤酵母表达系统，通过在线软件graphicalcodonusageanalyser(http://gcua.schoedl.de/)对不含信号肽的耐热木聚糖酶基因tx的密码子进行分析，找出低频密码子；根据找出的低频密码子通过软件dna2.0software(http://www.dna20.com)对tx基因进行优化；优化后的tx基因序列如seqidno.1所示，并由基因合成公司进行合成；经过优化，tx基因的密码子适应指数由0.78提升到0.88，gc含量由原来的43％提高到46％；碱基a，t，c和g均匀分布于优化后的tx基因，减少了at和gc富集区，利于tx基因在毕赤酵母的表达；优化后的tx基因与原始基因的相似性为76％，如图1所示；s2.合成步骤s1中优化后的耐热木聚糖酶基因tx，连接到表达载体ppic9k构建重组表达载体ppic9k-tx，将构建成功的ppic9k-tx用限制性内切酶saci线性化后，转入毕赤酵母得到重组工程菌株，然后进行高酶活转化子筛选：将转化子分别接入含有1.4mlbmgy的24孔板中，30℃培养36h后，按体积分数1％的比例加入甲醇进行诱导培养，每24h取样进行测定；s3.将筛选出来的高酶活转化子进行高密度发酵，高密度发酵步骤为：i.种子培养液制备：将筛选得到的高酶活转化子接种于100mlbmgy培养基中，30℃、240rpm培养20h进行活化，取活化的菌液以1:50的比例接种到300mlbmgy培养基中，30℃、240rpm培养至od600＝5；ii.向发酵罐中加入20l发酵基础培养基，121℃灭菌20min，调节温度至30℃，用氨水调节ph至5.0，加入4.35ml/lptml，按体积比1:10接入种子培养液；发酵过程中，温度控制在30℃，通气量维持在2vvm，转速控制在500rpm，溶氧维持在20％以上；加入种子培养液16h后至发酵罐中甘油耗尽，补加含有12ml/lptm1的50％甘油，补料速度为18ml/l·h，持续补加4h；iii.培养20h后，用氨水或磷酸调节ph值至4.5，培养温度为24℃，流加100％甲醇进行诱导培养并补加ptml，诱导培养144h后，收集发酵液，进行浓缩、纯化即得。实施例4一种重组耐热木聚糖酶的制备方法所述重组耐热木聚糖酶的制备方法，包括以下步骤：s1.根据毕赤酵母密码子偏好性，对耐热木聚糖酶基因tx进行优化；针对毕赤酵母表达系统，通过在线软件graphicalcodonusageanalyser(http://gcua.schoedl.de/)对不含信号肽的耐热木聚糖酶基因tx的密码子进行分析，找出低频密码子；根据找出的低频密码子通过软件dna2.0software(http://www.dna20.com)对tx基因进行优化；优化后的tx基因序列如seqidno.1所示，并由基因合成公司进行合成；经过优化，tx基因的密码子适应指数由0.78提升到0.88，gc含量由原来的43％提高到46％；碱基a，t，c和g均匀分布于优化后的tx基因，减少了at和gc富集区，利于tx基因在毕赤酵母的表达；优化后的tx基因与原始基因的相似性为76％，如图1所示；s2.合成步骤s1中优化后的耐热木聚糖酶基因tx，连接到表达载体ppiczαa构建重组表达载体ppiczαa-tx，将构建成功的ppiczαa-tx用限制性内切酶saci线性化后，转入毕赤酵母得到重组工程菌株，然后进行高酶活转化子筛选：将转化子分别接入含有1.4mlbmgy的24孔板中，30℃培养36h后，按体积分数1％的比例加入甲醇进行诱导培养，每24h取样进行测定；s3.将筛选出来的高酶活转化子进行高密度发酵，高密度发酵步骤为：i.种子培养液制备：将筛选得到的高酶活转化子接种于100mlbmgy培养基中，30℃、240rpm培养20h进行活化，取活化的菌液以1:50的比例接种到300mlbmgy培养基中，30℃、240rpm培养至od600＝5；ii.向发酵罐中加入20l发酵基础培养基，121℃灭菌20min，调节温度至30℃，用氨水调节ph至5.0，加入4.35ml/lptml，按体积比1:10接入种子培养液；发酵过程中，温度控制在30℃，通气量维持在2vvm，转速控制在800rpm，溶氧维持在20％以上；加入种子培养液20h后至发酵罐中甘油耗尽，补加含有12ml/l的50％甘油，补料速度为18ml/l·h，持续补加5h；加入种子培养液24h后至发酵罐中甘油耗尽，补加含有12ml/lptm1的50％甘油，补料速度为18ml/l·h，持续补加6h；iii.培养30h后，用氨水或磷酸调节ph值至7.0，培养温度为32℃，流加100％甲醇进行诱导培养并补加ptml，诱导培养192h后，收集发酵液，进行浓缩、纯化即得。对比例1一种重组耐热木聚糖酶的制备方法与实施例1的区别在于，耐热木聚糖酶基因tx未经步骤s1进行密码子优化，其它步骤均与实施例1类似。试验例1重组耐热木聚糖酶酶活测定1.试验对象：分别按实施例2～4及对比例1～2制备方法制备得到的重组耐热木聚糖酶tx。2.试验方法：吸取2ml经稀释的酶液，加入到刻度试管中，90℃平衡5min，再加入5mldns试剂，电磁震荡3s～5s，然后加入2ml木聚糖溶液，90℃保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁震荡3s～5s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度。吸取200μl经过适当稀释的酶液，加入到刻度试管中，再加入2ml木聚糖溶液(已经过90℃平衡)，电磁震荡3s～5s，90℃准确保温30min。加入5mldns试剂，电磁震荡3s～5s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁震荡3s～5s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度。酶活定义为在90℃、ph为5.0的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位u。3.试验结果：如表1所示表1重组耐热木聚糖酶酶活组别酶活(u/ml)实施例217320实施例314200实施例416300对比例12240由表1可知，按实施例2～4制备得到的重组耐热木聚糖酶均具有较高的酶活性；与对比例1相比，实施例2制备制备得到的重组耐热木聚糖酶酶活提高了6.73倍，说明本发明重组耐热木聚糖酶基因tx经过优化后，重组耐热木聚糖酶表达量及酶活提高显著。试验例2重组耐热木聚糖酶的最适反应ph及ph稳定性检验将按实施例2制备方法制备得到的重组耐热木聚糖酶tx进行最适反应ph实验，结果如图2所示。由图2a可知，重组木聚糖酶tx的最适ph为5.0，在ph4-7范围内相对酶活均高于63％。将按实施例2制备方法制备得到的重组耐热木聚糖酶tx分别在ph值为3～10条件下室温处理3h后，然后按试验例1方法测定酶活。实验结果如图2所示。由图2b可知，按实施例2方法制备得到的重组耐热木聚糖酶tx在ph5-10范围内具有很好的稳定性，剩余酶活均大于83％。试验例3重组耐热木聚糖酶的最适反应温度及热稳定性检验将按实施例2制备方法制备得到的重组耐热木聚糖酶tx进行最适反应温度实验，结果如图3所示。由图3a可知，重组木聚糖酶tx的最适反应温度为90℃。将按实施例2制备方法制备得到的重组耐热木聚糖酶tx分别在30℃～100℃条件下处理2小时，然后按试验例1方法测定酶活，实验结果如图3所示。由图3可知，按实施例2方法制备得到的重组耐热木聚糖酶tx具有很好的热稳定性，当处理温度为100℃时，剩余酶活可达到81％。sequencelisting<110>广东溢多利生物科技股份有限公司<120>一种重组耐热木聚糖酶的制备方法<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>987<212>dna<213>thermotogapetrophilarku<400>1tctcaaaacgtttccttgcgtgagttggccgagaagttgaatatctacattggttttgct60gctattaacaacttttggtctttgtccgacgccgagaagtatatggaggttgccagaaga120gagttcaacattttgactccagagaaccagatgaagtgggacaccatccatccagagcgt180gaccgttacaacttcactccagccgaaaagcacgtcgagttcgccgaggaaaacgacatg240atcgtccatggtcacacccttgtctggcacaaccaattgccaggttggatcaccggaaga300gagtggactaaggaggagttgttgaacgttttggaggaccacatcaagaccgtcgtttcc360cacttcaagggacgtgtcaagatctgggacgtcgtcaatgaagccgtttccgactctggt420acctaccgtgagtctgtctggtacaagactatcggtccagagtacatcgagaaggccttc480agatgggctaaggaggccgacccagatgccattttgatctacaacgattactctattgag540gaaattaacgctaagtccaactttgtttacaacatgattaaggagttgaaggagaagggt600gttccagtcgacggtatcggattccaaatgcatattgattacagaggattgaattacgat660tcttttagaagaaacttggagcgtttcgctaagttgggtttgcagatttacattactgag720atggacgttcgtatcccattgtccggttccgaggaatactacttgaagaagcaggccgag780gtctgtgctaagattttcgacatctgtttggacaatcctgccgtcaaggccattcagttc840tggggtttcaccgataaatactcctgggtcccaggtttcttcaagggttacggtaaggct900ttgttgtttgacgaaaactacaatccaaagccttgttactacgctattaaggaggttttg960gaaaaaaaaattgaagagagaaagtaa987当前第1页12