专利名称：一种产葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术：
葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，简称G0D，Ε. C. 1. 1. 3. 4)是一种黄素糖蛋白。葡萄糖氧化酶分子为二聚体，含有两个亚基，分子量约160kDa，每亚基结合一个FAD分子，因此每个酶分子含有两个FAD分子。它是一种需氧脱氢酶，以氧为电子接受体，能专一地氧化β-D-葡萄糖为葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶由于具有催化专一性和高效性的优点，在食品、化工、医药、农业、饲料等领域有比较广泛的应用。由于葡萄糖氧化酶良好的应用效果，目前已经在很多行业中得到了广泛应用，近年来倍受关注，市场需求量也越来越大。
发明内容
本发明提供了一种用于葡萄糖氧化酶生产的黑曲霉，该菌株于2011年8月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉、武汉大学，保藏编号=CCTCC NOM201U91，分类学命名黑曲霉 BBE11721 (Aspergillus niger BBE11721)。上述黑曲霉的筛选方法，包括如下步骤1)定性筛选采用Fiedure. K. J显色法，将分离出黑曲霉菌株点种于平板分离培养基，28°C培养3 4d后直至出现蓝色颜色圈，进行蓝色圈大小定性比对。所述平板分离培养基组成如下葡萄糖40g ΙΛ蛋白胨2g L—1，，氯化钾0. 5g L—1，碳酸钙3. 5g L—1，可溶性淀粉IOg L-1，KI 1.7g ΙΛ脱氧胆酸钠0.2g ΙΛ琼脂20g L—1，磷酸缓冲液0. Imol ΛρΗ5. 6 ；2)定量筛选将黑曲霉菌丝体破壁上清液中加入2. 5mL邻联茴香胺溶液，0. 3mL的18%葡萄糖，0. ImL的L—1辣根过氧化物酶，35°C保温^iin后，向试管中加入稀释好的酶液样品0. ImL,反应;3min后，加入2mol Γ1硫酸终止反应，取出试管，测0D540的吸光值，以热失活的酶液做空白对照。根据标准曲线的结果，计算葡萄糖氧化酶活力单位。所述Imol L-1磷酸缓冲液(ρΗ6· 0)将132mL的Imol L-1磷酸氢二钾(K2HPO4)和868ml的lmol L—1磷酸二氢钾(KH2PO4)混合，调整pH值到6. 0，过滤灭菌，常温保存。所述邻联茴香胺溶液0. Ig邻联茴香胺，溶于IOmL甲醇，为储存液，4°C保存，实验前取0. Iml储存液，溶于12mL的0. Imol pH 6. 2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中；所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液0. 2mol Γ1磷酸氢二钠溶液330. 5mL与0. Imol L—1柠檬酸缓冲液169. 5mL混合，调整pH值到6. 2，去离子水定容至1L，常温保存。经定性定量筛选后，获得一株黑曲霉BBE11721，发酵96小时后葡萄糖氧化酶活可达2. 2 Umr1，对酶的热稳定性进行了分析，将酶液分别置于40°C、45°C、50°C、55°C、60°C下，每隔10分钟取样测定酶活。40°C与45°C下，60分钟酶活没有下降。50°C与55°C下，30分钟降到原有酶活的80%，60分钟降到60%。60°C下，30分钟降到降到原有酶活的65%，60分钟降到50%。
本发明提供的黑曲霉具有葡萄糖氧化酶产量高的优点，经优化摇瓶产量可达4. 6UmL—1 ；该菌株分泌的葡萄糖氧化酶可耐受较高温度，粗酶液40°C、45°C条件下，60分钟酶活没有损失，60°C条件下30分钟降到降到原有酶活的65%，60分钟降到50%。
图1 葡萄糖氧化酶活标准曲线图2 黑曲霉BBE11721的系统发育树图3 采用所筛菌株在平板分离培养基上的显色效果4 黑曲霉BBE11721发酵过程曲线图5 :40°C水浴中黑曲霉BBE11721产葡萄糖氧化酶的热稳定性图6 :55°C水浴中黑曲霉BBE11721产葡萄糖氧化酶的热稳定性图7 :60°C水浴中黑曲霉BBE11721产葡萄糖氧化酶的热稳定性
具体实施例方式实施例1产葡萄糖氧化酶菌株的定量筛选方法(一)样品来源采样来源为富含淀粉的土壤。(二)培养方法将采样所得上壤，取土壤样品5g，加入45mL的无菌水(含50u庆大霉素)中，摇床培养 QOOr mirT1)。斜面培养恒温，培养4d后置于4°C冰箱保存备用。摇床培养250mL摇瓶50mL装量，恒温，旋转摇床QOOr mirT1)，培养4d。(三)定性筛选方法采用Fiedure. K. J显色法，将富集培养后的土壤悬液稀释到10_4，分离出黑曲霉菌株。再将其点种于平板分离培养基培养3 4d后出现蓝色颜色圈，挑取颜色圈较大的的菌株接种至斜面培养。实施例2 产萄萄糖氧化酶的黑曲霉的定量筛选方法(一 )实验试剂0. Imol L-1 磷酸氢二钠-0. 05mol L-1 柠檬酸缓冲液(ρΗ6· 2) :0. 2mol L-1 磷酸氢二钠溶液330. 5mL与0. Imol L-1柠檬酸缓冲液169. 5mL混合，调整pH值到6. 2，去离子水定容至1L，常温保存。Imol Γ1 磷酸缓冲液(ρΗ6· 0)将 132mL 的 Imol Γ1 磷酸氢二钾(K2HPO4)和 868ml的lmol L—1磷酸二氢钾(KH2PO4)混合，调整pH值到6. 0，过滤灭菌，常温保存。邻联茴香胺溶液0. Ig邻联茴香胺，溶于IOmL甲醇，为储存液，4°C保存，实验前取0. Iml储存液，溶于12mL的0. Imol pH 6. 2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中。( 二 )酶活测定方法将黑曲霉菌丝体破壁上清液中加入2. 5mL邻联茴香胺溶液，0. 3mL的18%葡萄糖，0. ImL的90U πιΓ1辣根过氧化物酶，35°C保温^iin后，向试管中加入稀释好的酶液样品0. lmL，反应;3min后，加入2mol Γ1硫酸终止反应，取出试管，测0D540的吸光值，以热失活的酶液做空白对照。根据标准曲线的结果，计算葡萄糖氧化酶活力单位。以上海生工葡萄糖氧化酶做为标准品。将葡萄糖氧化酶标准品稀释成0. 4,0. 8，1. 2，1. 6,2. 0,2. 4U mL—1，在试管中加入2. 5mL邻联茴香胺溶液，0. 3mL的18% D-葡萄糖和0. ImL的90U mL—1辣根过氧化物酶溶液，35°C保温2min，加入0. ImL稀释好的葡萄糖氧化酶标准品，反应^iin后加入2mL的2mol L—1硫酸终止反应，在MOnrn下测定反应液吸光值。如下表1葡萄糖氧化酶标准曲线
权利要求
1.一种黑曲霉，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC N0:M201U91，分类学命名黑曲霉 BBE11721 (Aspergillus niger BBE11721)。
2.—种权利要求1所述黑曲霉的筛选方法，其特征在于，具体步骤如下、1)定性筛选采用Fiedure.K. J显色法，将分离出黑曲霉菌株点种于平板分离培养基，培养3 4d后直至出现蓝色颜色圈，进行蓝色圈大小定性比对；、2)定量筛选将黑曲霉菌丝体破壁上清液中加入2.5mL邻联茴香胺溶液，0. 3mL的18%葡萄糖，0. ImL的90U ml/1辣根过氧化物酶，35°C保温^iin后，向试管中加入稀释好的酶液样品0. ImL,反应;3min后，加入2mol Γ1硫酸终止反应，取出试管，测0D540的吸光值，以热失活的酶液做空白对照，根据标准曲线的结果，计算葡萄糖氧化酶活力单位。
3.权利要求1所述黑曲霉在葡萄糖氧化酶发酵生产中的应用。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，发酵培养基组成如下葡萄糖80gL—1，蛋白胨3g L—1，磷酸二氢钾2g L—1，七水合硫酸镁0. TgL—1，氯化钾0. 5g L—1，硝酸钠4g L—1，碳酸钙、3. 5g ΛρΗ 自然。
全文摘要
本发明公开了一种产葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其应用，属于微生物技术领域。本发明筛选得到一株黑曲霉，发酵96小时葡萄糖氧化酶活可达2.2UmL-1，于2011年8月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NOM2011291，分类学命名黑曲霉BBE11721(Aspergillus niger BBE11721)。本发明提供的黑曲霉具有葡萄糖氧化酶产量高的优点，经优化摇瓶产量可达4.6UmL-1；该菌株分泌的葡萄糖氧化酶可耐受较高温度，粗酶液40℃、45℃条件下，60分钟酶活没有损失，60℃条件下30分钟降到降到原有酶活的65％，60分钟降到50％。
文档编号C12Q1/32GK102382773SQ20111032942
公开日2012年3月21日 申请日期2011年10月26日 优先权日2011年10月26日
发明者刘玮, 堵国成, 张娟, 沈伊娜, 费丽杰, 陈坚, 顾磊 申请人:江南大学